Polyacrylamide jeller içinde Mango-Tagged RNA floresan görselleştirme bir Poststaining yöntemi ile

Özet

Burada RNA Mango aptamers ı, II, III veya IV ile etiketlenmiş görüntü Rnas 'ında doğal veya denatüre Poliakrilamid jel elektroforezi (Page) jelleri kullanarak hassas, hızlı ve ayrımcılık sonrası jel boyama yöntemi sunuyoruz. Standart sayfa jeller çalıştırdıktan sonra, Mango-Tagged RNA kolayca TO1-biotin ile lekelenmiş ve daha sonra yaygın olarak kullanılabilir floresan okuyucular kullanılarak analiz edilebilir.

Özet

Doğal ve denatüre Poliakrilamid jelleri, ribonukleoprotein (RNP) karmaşık mobilitesini karakterize etmek ve sırasıyla RNA boyutunu ölçmek için rutin olarak kullanılır. Birçok jel görüntüleme tekniği, spesifik olmayan lekeler veya pahalı fluorophore probları, hassas, ayrımcılık ve ekonomik jel görüntüleme metodolojileri çok tercih edilir. RNA Mango çekirdek dizileri, rasgele bir RNA kökü ile kapalıyken sadece ve pahalı olmayan bir RNA 'ya eklenebilen küçük (19 – 22 NT) sıralı motifler. Bu mango Etiketler bağlama üzerine binlerce kez daha floresan olur TO1-biotin denilen bir thiazole-turuncu fluorophore ligand için yüksek yakınlık ve özgüllük ile bağlayın. Burada Mango ı, II, III ve IV, yüksek hassasiyetle jeller RNA özellikle görüntü için kullanılabilir olduğunu göstermektedir. Doğal jellerin RNA 'nın 62,5 fmol 'sı ve 125 fmol olarak da denatüre jeller,% 30 dakika boyunca potasyum ve 20 Nm to1-biotin içeren bir görüntüleme tamponunun içinde jel ile tespit edilebilir. Mango etiketli sistemin özgüllüğünü, toplam bakteriyel RNA 'nın karmaşık bir karışımı bağlamında Mango etiketli 6S bakteriyel RNA 'nın görüntülemesi ile gösteriyoruz.

Giriş

Mango (TO1-biotin, Şekil 1a) thiazole-turuncu basit türevleri için sıkıca (nanomolar bağlayıcı) bind dört küçük floresan RNA aptamers bir dizi oluşan bir RNA etiketleme sistemi,^1,2,3 . Bağlayıcı üzerine, bu ligin floresans 1.000 artar-4.000-belirli aptamer bağlı olarak katlayın. Mango III, RNA Mango aptamers nanomolar bağlayıcı benzeşme ile birlikte geliştirilmiş yeşil floresan protein (eGFP), aşan Mango sisteminin yüksek parlaklık, görüntüleme ve RNA arıtma hem de kullanılmasını sağlar kompleksleri^2,

Protokol

1. Reaktiflerin hazırlanması

1. TO1-biotin sonrası boyama çözeltisi (jel boyama çözeltisi)
   1. 1 m₂HPO₄ ve 158 ml 1 m Nah₂Po₄' ü 342 ml ekleyerek, 25 °C ' de pH 7,2 ' de 1 m fosfat tampon yapın. Uygun fosfat çözeltisi ekleyerek pH 'ı 50 mM 'ye 7,2 olarak ayarlayın. 0,2 μm filtre kullanılarak steril filtre ve solüsyonu oda sıcaklığında plastikte saklayın.
   2. 5x jel boyama çözeltisi (TO1-biotin olmadan) aşağıdaki gibi hazırlayın. 247,5 mL ddH₂O, 700 ml 1 m kcl, 50 ml 1 m fosfat tampon (pH 7,2) ve 2,5 ml ara 20 karıştırma tarafından 1 L çözüm makyaj. 0,2 μm filtre kullanılarak s....

Sonuçlar

Kısa Mango-Tagged RNAs protokol bölümünde açıklandığı gibi hazırlanmıştır. Denatüre koşullarda floresan, jellerin üre varlığı nedeniyle gözlemlemek en zor olacağını varsayarsak, ilk olarak bir nüklik asit denaturant olarak davranan üre, Mango aptamers direnci okudu. Biz mango aptamers yaklaşık 1 M üre konsantrasyonuna kadar denatürasyon önemli ölçüde dirençli olduğunu bulundu (Şekil 2a). Bir denatüre jel jel boyama solüsyonu eklemeden önce, jel üre son konsantrasyonu 6 m........

Tartışma

Mango floresan etiketinin önemli bir avantajı, tek bir etiketin birden çok şekilde kullanılabilmesi. Bu aptamers yüksek parlaklık ve yakınlık onları sadece hücre görselleştirme² için değil, aynı zamanda In vitro RNA veya RNP arıtma⁴için yararlı hale. Bu nedenle jel görüntüleme, Mango etiketinin çok yönlülüğünü basit bir şekilde genişletir. Mango jel görüntüleme hassasiyeti, Kuzey leke¹⁴ ' ten biraz daha azdır, ancak uzun ve sıkıcı membran transferine.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0,8 mm Kalın Tarak 30 mL PAGE jelleri için 14 Kuyu	LabRepCo	11956042
101-1000 & mikro; L  ipuçları	Fisher	02-707-511
20-200 & L düşük tutma  ipuçları	Fisher Scientific	02-717-143
Akrilamid:N,N'-metilenbisakrilamid (%40 19:1)	Biyoreaktifler	BP1406-1	Akut toksisite
Akrilamid:N,N'-metilenbisakrilamid (%40 29:1)	Fisher	BP1408-1	Akut toksisite
Agar	Anachemia	02116-380
Alüminyum destekli TLC plaka	Sigma-Aldrich
Amersham Görüntüleyici 600	GE Sağlık Yaşam Bilimleri	29083461
Amonyum Persülfat	Biorad	161-0700	Zararlı
BL21 hücreleri	NEB	C2527H
Borik Asit	ACP	B-2940
Bromofenol Mavi sodyum tuzu	Sigma	B8026-25G
Klloform	ACP	C3300
Ditiotreitol	Sigma Aldrich Alkoller	D0632-5G
DNaz I	ThermoFisher	EN0525
EDTA Disodyum Tuzu	ACP	E-4320
Etanol Ticari
Düz Jel Yükleme ipuçları	Costar	CS004854
Formamid %99	Alfa Aesar	A11076
Ara parçalı ve taraklı jel aparat seti	LabRepCo	41077017
Plastik Kapaklı Cam Tabak	Pyrex	1122963	Jel parçanıza sığacak kadar büyük olmalıdır
Gliserol	Anachemia	43567-540
HCl	Anachemia 464140468
ImageQuanTL	GE Sağlık Yaşam Bilimleri	29000605
IPTG	Invitrogen	15529-019
KCl ACP		P-2940
MgCl2 Caledron		4903-01
MgSO4	Sigma-Aldrich	M3409
NaCl	ACP	S-2830
NaOH	BDH	BDH9292
Orbital Döndürücü	Lab-Line
Fenol	Invitrogen	15513-039
Yuvarlak Jel Yükleme ipuçları	Costar	CS004853
Sodyum Fosfat dibazik	Caledron	8120-1
Sodyum Fosfat monobazik	Caledron	8180-01
SYBRGold	ThermoFisher	S11494
T7 RNA Polimeraz	ABM	E041
TEMED	Sigma-Aldrich	T7024-50 ml
TO1-3PEG-Biotin Florofor	ABM	G955
Tris Baz	Fisher	BP152-500
Tripton	Fisher	BP1421-500
Tween-20	Sigma	P9496-100
Üre	Fisher	U15-3
Ksilen Siyanol	Sigma	X4126-10G
Maya Özü		Bioshop YEX401.500

1164840001P016EAAN