Method Article

Fare Kraniyofacial dokularda ve Undecalcified kemik doku hazırlama ve Immünostasyon

DOI:

10.3791/59113

⸱

May 10th, 2019

 ,  , 
1The State Key Laboratory Breeding Base of Basic Science of Stomatology (Hubei-MOST) & Key Laboratory for Oral Biomedicine of Ministry of Education, School and Hospital of Stomatology, Wuhan University, 2Department of Biologic and Materials Sciences, School of Dentistry, University of Michigan

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, kraniyofasiyal morphogenesis/patogenezi sırasında protein düzeylerini algılamak ve ölçmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz Buna ek olarak, immünostasyon için genç farelerden undecalcified Sert dokularda hazırlama ve donuk kesit için bir yöntem açıklanmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doku immünostası, belirli bir doku içinde ilgi proteinlerinin son derece spesifik ve güvenilir tespiti sağlar. Burada, kraniyofasiyal morphogenesis/patogenezi sırasında fare kraniyofasin dokularında örnek olarak protein ifadesini algılamak için tam ve basit bir protokol açıklanmaktadır. Protokol, dokuların preparasyon ve kriyobölümlenmesini, dolaylı immünofluoresesans, görüntü edinme ve miktarlama içerir. Buna ek olarak, immünostasyon için undecalcified Sert dokularda hazırlık ve donuk kesit için bir yöntem tarif edilir, örnek olarak kraniyofasiyal dokular ve uzun kemikler kullanılarak. Bu yöntemler, kraniyofacial morfogenik/patogenezi sırasında çeşitli dokularda protein ifadesi ve morfolojik/anatomik değişikliklerin belirlenmesi için anahtardır. Onlar da uygun modifikasyonlar ile diğer dokular için geçerlidir. Histolojinin bilgi ve yüksek kalite bölümleri deneysel sonuçlardan bilimsel sonuçlar çekmek için önemlidir. Bu metodolojinin potansiyel sınırlamaları şunlardır ancak antikorların özgüllüğü ve burada da tartışılan ölçüme karşı zorluklar ile sınırlı değildir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüz insan kimliğinin önemli bir parçasıdır ve epitelyum, kas, kemik, kıkırdak, diş gibi çeşitli farklı dokulardan oluşur. Bu dokular üç germ katmanından türetilmiştir: ectoderm, endoderm, ve mezoderm1,2. Kraniyofasin dokularının uygun desenleme ve gelişimi için, hücre proliferasyonu, ölüm ve farklılaşma WNT, fgf, hh ve BMP yollar3,4 gibi belirli sinyal yolları tarafından son derece koordine ve düzenlenmiş olması gerekir ,5. Proliferasyon, hayatta kalma veya hücrelerin farklılaşma kusurları, en sık görülen konjenital ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm fare deneyler, araştırma hayvanların insani bakım ve kullanımı kapsayan Michigan Üniversitesi kurallarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada kullanılan tüm hayvan prosedürleri, Michigan Üniversitesi 'nde (protokol #PRO00007715) Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıesuc) tarafından onaylanmıştır.

1. doku hazırlama

  1. Embriyonik dokuların hazırlanması
    1. Hazırlamak 1 10 cm çanak ve fosfat tamponlu tuz (PBS) içeren birkaç 3,5 cm yemekler, ve 1 12-iyi kültür plaka içeren 2 ml 4% civarında formaldehite (PFA) her iyi her hamile fare için PBS içinde. Tüm Petri yemekleri ve plaka buzun üzeri....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embriyonik kraniyofasiyal doku bölümleri
Yukarıdaki adımları takiben, kafaları kontrol (P0-CRE) veya Mutant (seçimli aktif Bmpr1a nöral Crest hücrelerinde, P0-CRE; caBmpr1a) embriyonik günde (E) 16,5 veya 18,5 embriyolar disseke edildi. 4 h için 4% PFA sabitleme sonra, numuneler OCT gömülü ve Cor, cryosec,. Sonuçlanan bölümler pSmad1/5/9 (alt BMP sinyal faktörleri) veya Ki67 (bir hücre proliferasyonu işaretçisi) karşı antikorlar ile immünostize edildi.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada fare kafası ve undecalcified kemik dokularının hazırlanması için ayrıntılı bir protokol ve hücre proliferasyonu, hücre ölümü ve BMP sinyalizasyon işaretçileri immünostasyon için donuk kesit sağlar. Ayrıca immünofluorescent görüntülerden nicel veriler elde etme stratejisini de ayrıntılarıyla biliyoruz. Bu yöntemler, uygun değişikliklerle diğer dokulara da uygulanabilir.

Doku hazırlama koşulları dokuların boyutuna ve tipine göre farklılık gösterir. Sabitleme ve kriyokoruma süresi genellik.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01DE020843 Y.M.), uluslararası FOP Derneği (Y.M.) ve Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (31500788 J.Y.) bir Grant-in-Aid tarafından desteklenmektedir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Yapışkan bantLeica# 39475214
Alexa fluor 488-keçi anti-Tavşan ikincil antikoruInvitrogenA-11034
InvitrogenP36931ile Antifade Mountant
Sığır serum albüminiSigmaA2153
LamellerFisher Marka12-545-E
KriyostatLeicaCM1850
EDTASigmaE6758
Floresan mikroskobuOlympusBX51
JelatinSigmaG1890
Yerinde  Hücre Ölümü Tespit KitiMilliporeS7165
Mikroskop slaytlarıFisher Marka12-550-15
OCT BileşikFisher Healthcare23-730-571
Paraformaldehit (PFA)SigmaP6148 ve nbsp;
Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS)SigmaP4417
Polietilen glikol  tert-oktilfenil eterSigmaT9284Triton X-100
Proteinaz KInvitrogenAM2542
Tavşan anti-Ki67 antikoruHücre Sinyal Teknolojisi9129Lot #: 3; RRID:AB_2687446
Tavşan anti-pSmad1/5/9 antikoruHücre Sinyalizasyon Teknolojisi13820Lot #: 3; RRID:AB_2493181
Sodyum sitratSigma1613859
SükrozSigmaS9378
TrisSigma10708976001
DAPI

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Trinh, L. eA., Fraser, S. E. Imaging the cell and molecular dynamics of craniofacial development: challenges and new opportunities in imaging developmental tissue patterning. Current Topics in Developmental Biology. 115, 599-629 (2015).
  2. Marcucio, R., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tissue PreparationImmunostainingMouse CraniofacialUndecalcified BoneCryosectioningImmunofluorescenceProtein DetectionGelatin EmbeddingAntibody StainingFluorescence Quantification

Related Articles