Yalıtım ve yüksek tuz evlat edinen Transfer dendritik hücreler antijen sunan tedavi

Özet

Burada, manyetik hücre sıralama ve içine saf fareler sonraki evlat edinen transfer tarafından fare dalağı dendritik hücreleri izole etmek için bir iletişim kuralı mevcut. Yüksek tuz aktif dendritik hücre modeli evlat edinen transfer ve Akış Sitometresi adım adım yordamlar açıklamak için seçildi.

Özet

Aşırı diyet tuz tüketiminizi iltihap için katkıda bulunur ve hipertansiyon gelişiminde önemli bir rol oynar. Daha önce dendritik hücreler (DC) antijen sunan lider NADPH oksidaz aktivasyonu ve isolevuglandin (IsoLG) oluşumu için yükseltilmiş ekstraselüler sodyum hissedebiliyorum bulduk-protein adducts. Bu IsoLG protein tepki öz-proteinler ile adducts ve bir devlet gibi otoimmün ve hipertansiyon tanıtmak. Biz geliştirdik ve hipertansiyon işlevinde DC incelemek için state-of--art yöntemleri en iyi duruma getirilmiş. Burada, detaylı bir protokol yalıtımı için içinde sağlamak yüksek sodyum ve fare dalak CD11c evlat edinen transferi ile in vitro tedavi⁺ hücreleri hipertansiyon içindeki rollerine çalışmaya alıcı fareler içine.

Giriş

Aşırı diyet tuz hipertansiyon için önemli bir risk faktörüdür. ^{1 , 2} Amerikan Kalp Derneği en fazla 2,300 miligram (mg) sodyum (Na⁺) alımı günlük, ancak önerir; ABD nüfusunun % 10'dan daha az bu öneriye gözlemler. ^{3 , 4} mütevazı indirimleri Na⁺ alımı düşük kan basıncı ve Koroner kalp hastalığı ve inme ABD'de yıllık yeni olgu % 20 oranında azaltmak. ⁵ hipertansif nüfusunun % 50 tuz-duyarlılık, sergiler aşırı tuz tüketimi ile önemli bir sorun olduğunu Na⁺ yükleme veya benzer bir damla kan basıncında Na^{sonra aşağıdaki tansiyon 10 mmHg artış olarak tanımlanan +} kısıtlama ve diyürez. ⁶ tuz-hassasiyet Ayrıca normotansif kişilerin % 25 oluşur ve ölüm ve kardiyovasküler olaylar bağımsız bir tahmin. ^{7 , 8} tuz algılama mekanizmaları böbrek içeren hipertansiyonda de incelenmiştir; Ancak son yıllarda yapılan çalışmalarda bağışıklık hücreleri Na⁺hissi olabilir düşündürmektedir. ^{9 , 10}

Son kanıtlar işleme değişiklikleri ekstra renal Na⁺ iltihabı teşvik ve interstitium Na⁺ birikimi neden olabilir gösteriyor. ^{11 , 12} bizim laboratuvar ve diğerleri doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık sistemi hücrelerinin hipertansiyon alevlenmesi için katkıda göstermiştir. ^{9 , 13 , 14 , 15} Anjiyotensin II, norepinefrin ve tuz neden makrofajlar, monosit ve T lenfositleri böbrek ve damarlara sızmak ve teşvik Na⁺ saklama, vazokonstriksiyona, kan basıncı da dahil olmak üzere çeşitli hipertansif bir çekim gücü, bakış açısını ve uç-organ hasarı. ^{9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20} önceki çalışmalarda, DCs isolevuglandin (IsoLG) birikir bulduk-protein adducts Anjiyotensin II ve DOCA-tuz hipertansiyon da dahil olmak üzere çeşitli hipertansif uyaranlara yanıt olarak. ¹⁴ IsoLGs lysines üzerinde proteinler için hızla ve kovalent adduct büyük ölçüde reaktif lipid peroksidasyon ürünleri vardır ve onların birikimi DC harekete geçirmek ile ilişkilidir. Biz son zamanlarda yükseltilmiş Na⁺ IsoLG-protein için güçlü bir uyarıcı olduğunu kurduk ¹⁴ adduct DCs.⁹ Na⁺ girmesinden DCs amiloride hassas taşıyıcıları aracılık ettiği antikorundan oluşumu. Na⁺ sonra kalsiyum (Ca^{2 +}) Na⁺/Ca^{2 +} Eşanjör üzerinden için değiştirilir. CA^{2 +} protein kinaz C (PKC) artan süperoksit için (O₂^{· -}) önde gelen NADPH oksidaz etkinleştirir etkinleştirir ve IsoLG-protein adduct oluşumu. ⁹ yanıt olarak Anjiyotensin II alt pressor bir doz DCs asal hipertansiyon tuz maruz evlat edinen transferi. ⁹

CD11c tanımlaması⁺ DCs dan doku immünhistokimya ve RT-PCR ile daha önce sınırlı olmuştur, ve yalıtım DC'lerin Akış Sitometresi tarafından sıralama hücreye sınırlı olmuştur. Akış Sitometresi hücre sıralama bağışıklık hücreleri yalıtım için güçlü bir yöntem olsa da, pahalı, zaman alıcı ve hücrelerin bir düşük verim için yol açar. Bu nedenle, biz bir adım adım protokol doku sindirim, tüp bebek stimülasyon ve evlat edinen transferi CD11c için optimize⁺ hipertansiyon çalışmaya DCs.

Protokol

Vanderbilt Üniversitesi'nin kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi burada açıklanan yordamları onayladı. Fareler yer alan ve uygun olarak Kılavuzu bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı (Ulusal akademiler Press. için bakım Yeniden düzenlenen 2010).

1. yalıtım dalağı fare dan

1. 1640 RPMI hazırlayın: %10 FBS, 0.10 mM HEPES, 1 mM sodyum pyruvate, 50 µM β-mercaptoethanol ve % 1 penisilin/streptomisin.
2. 10-12 hafta ötenazi-CO₂ Solunduğunda eski C57bl/6 erkek fareler. Göğüs ve fare kenarlarında % 70 etanol ile sprey. Sol taraftaki dikkatle cilt ve dalak ortaya çıkarmak için Periton boşluğuna açın.
3. Küçük forseps, ihtiyatlı bağırsak ve karaciğer ve farenin sol kenarına taşınır ve yavaşça iyi makas kullanarak dalak tüketim.
   Not: Bu adım yapmanız gerekir çok dikkatli gastrointestinal sistem zarar kirlenme tetikleyebilir.
4. Her eksize dalak RPMI 1640 orta 3 mL içeren etiketli 15 mL konik tüp yerleştirin.

2. tek hücre süspansiyonlar dalağı gelen nesil

Not: Dalak bir tek hücre süspansiyon mekanik ayrışma artı Enzimatik sindirim birleştirerek ayrışmış.

1. Collagenase D (1 mg/mL; 0.29 U/mg liyofilize) ekleyerek dalak sindirim çözüm hazırlamak ve Dnaz (0.1 mg/mL) için hazırladım RPMI 1640 orta (bkz. Adım 1.1)
2. Forseps 3 mL dalak sindirim çözeltisi içeren dalak C tüp (ayrılma tüp) içine aktarmak için kullanın.
3. Üreticinin yönergelerine göre yarı otomatik bir homogenizer kullanarak mekanik ayrışma gerçekleştirin.
   1. C tüp C tüp üzerinde dönen kol sıkıca yerleştirilir sağlanması yarı otomatik homogenizer üzerine yerleştirin. C tüp yerleştirilir sonra yarı otomatik homogenizer 60 için dalak 04.01 protokolü çalıştırmak için Başlat düğmesine basın s.
      Not: Mekanik ayrışma da 40 mikron filtre 50 mL konik tüp üstüne yerleştirip yavaşça dalak filtreden taşlama gerçekleştirilir. Dalak taşlama sonra üzerinden 40 µm filtre 10 mL RPMI medya ile yıkayın.
4. Mekanik ayrışma sonra homogenizer tüpünden ayırmak ve Enzimatik sindirim gerçekleştirin. Sürekli rotasyon (20 devir/dakika) altında 37 ° C'de 15 dakika örnekleri kuluçkaya.
5. Çözüm 40 µm süzgeç aracılığıyla filtreleme sonra 50 mL konik tüp içine pipetting tarafından aktarın. Dulbecco'nın PBS (dPBS) 10 mL ile 40 µm süzgeç yıkayın. Hücreleri, 300 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi
6. Santrifüjü sonra tamamen süpernatant Aspire edin ve 10 mL dPBS resuspending tarafından Pelet yıkayın. 4 ° C'de 10 dakika için 300 x g , santrifüj

3. CD11c yalıtım⁺ DCs dan dalak tek hücre süspansiyon

1. Hücre Pelet 5 mL dPBS resuspend ve hemasitometre ve trypan kullanarak hücreleri saydırmak mavi dışlama.
2. 300 x g, 4 ° C'de 10 dakika için centrifuging tarafından hücreleri cips
3. Süpernatant tamamen Aspire edin ve Pelet manyetik olarak aktif hücre sıralama (Mac) arabellek 400 µL içinde resuspend.
4. (Bkz. Tablo reçetesi) CD11c lastikteki 1 x 10⁸ hücre başına 100 µL ekleyin.
5. Girdap hücre süspansiyon ve buzdolabında 4 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya
6. Hücreleri yıkamak için MACs arabellek 10 mL ekleyin. 4 ° C'de 10 dakika için 300 x g , santrifüj
7. Süpernatant tamamen Aspire edin ve Mac'ler arabellek 500 µL içinde resuspend.

4. manyetik ayırma CD11c⁺ DCs

Not: Manyetik Ayırma el ile manyetik ayırıcı ile yapılır ( Tablo malzemelerigörmek) LS sütun ile donatılmış. Manyetik Ayırma da otomatik olarak bir otomatik manyetik ayırıcı ile yapılabilir. (bkz. Tablo malzeme).

1. LS sütun Mac'ler ve akışı aracılığıyla toplamak için her sütunu altında 15 mL konik tüp manyetik alanına koyun.
2. LS sütun arabellek 3 mL ile yıkayın.
3. Hücre süspansiyon her LS sütun üzerine yerleştirin ve etiketsiz hücreleri içeren aracılığıyla akış-toplamak.
4. LS sütun geçmesine etiketlenmemiş hücreleri toplama Mac'ler arabellek 3 mL ile yıkayın. LS sütun 2 daha kere yıkayın.
5. LS sütun manyetik ayırıcı kaldırın. Her sütun için MACs arabellek 5 mL ekleyin ve hemen sıkıca LS sütun temiz 15 mL konik tüp içine dalan tarafından manyetik olarak etiketli hücreleri floş.
   Not: Yüksek saflıkta hücre süspansiyon elde etmek için CD11c hücre çift yalıtım gerçekleştirmek önemlidir. Bu nedenle, adımları 3.1 4.5 ile yineleyin. ve şekil 4 saflık standartları için başvuru. Bu adımı CD11c saflığı geliştirir⁺ hücreleri % 90-95.
6. CD11c belirlemek⁺ DC trypan mavi dışlama kullanarak bir hemasitometre üzerinde numara. Hücre örneği bir 1:1 seyreltme % 0,4 trypan mavi çözümünde'oranında seyreltin.
   Not: sigara-hücrelerin lekeli mavi, hücrelerin günahı kalır iken.
   1. Bunu yapmak için dikkatli bir hemasitometre hücre Numune dilüsyonu 10 µL ile doldurun ve kuluçkaya 1 dakikadır.
   2. 1 x 1 mm² uygun cep numarasını belirlemek için yüklenen odasında 4 meydanlarda hücreleri hesaplama.

5. tedavisinde Vitro yüksek tuz CD11c⁺ DCs

1. %10 FBS, 0,1 mM HEPES, 1 mM sodyum pyruvate, 50 µM β-mercaptoethanol ve % 1 penisilin/streptomisin 500 mL 1640 ekleyerek DC kültür ortamı hazırlamak RPMI.
2. NaCl 1.17 g ağırlığında ve steril 50 mL Şahin tüp içine yerleştirerek 10 x DC yüksek tuz hücre kültür medya (400 mM) hazırlayın. NaCl çözümdür kadar steril DC hücre kültür medya (5.1 adımda hazırlanan) 50 mL 50 mL Şahin tüp ve girdap ekleyin.
3. Hemen yüksek tuz DC kültür 0,2 mikron filtre bir hücre kültür Hood ile vakum filtrasyon kullanarak medya filtre.
4. Dalağı 300 x g 10 dk 4ºC az için gelen her hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi. 1 x 10⁶ hücre/mL bir konsantrasyon, DC kültür medyada her hücre Pelet resuspend.
5. 900 μL (yaklaşık 1 x 10⁶ hücreler) 24-şey düz dipli Falcon plaka DC süspansiyon pipet. Her şey için nihai sodyum konsantrasyonu 190 mm 100 µL yüksek tuz DC kültür medya ekleyin. Plaka etiket ve 37 ° C yer CO₂ kuluçka 48 h için humified.

6. yüksek tuz evlat edinen Transfer tedavi CD11c⁺ DCs

1. 48 h için tüp bebek stimülasyon sonra Kaldır 37 ° C plaka CO₂ kuluçka humified.
2. Hücre kültür medya yukarı ve aşağı resuspend CD11c⁺ DCs. pipet tüm CD11c pipette⁺ DC karşılık gelen bir içine süspansiyon etiketli 1.6 mL tüp. De kaplama her birey için bu adımı yineleyin.
3. Her CD11c santrifüj kapasitesi⁺ DC süspansiyon 300 x g 4 ° C'de 10 dk de Süpernatant Aspire edin. DC Pelet steril dPBS 100 µL ile resuspend.
4. Beraberlik DC süspansiyon 27 G ½ inç iğne ile donatılmış bir 1 mL şırınga içine.
5. Saf erkek 10 haftalık C57bl/6 fareler % 2'in altında yer isoflurane istikrarlı bir cerrahi uçak elde etmek için. Anestezi düzeyini pedal refleks eksikliği ile kontrol edin. İstikrarlı bir cerrahi uçak elde sonra yavaş yavaş ve dikkatli bir şekilde iğne yaklaşık 30 ° açılı retro-orbital alanı tanıtmak.
   Not: 27 G iğne eğimi aşağı, oküler zarar görmesini önlemek için göz uzak dönük.
6. Yavaş yavaş ve sorunsuz CD11c enjekte⁺ DC süspansiyon (yaklaşık 1 x 10⁶ hücreleri). Enjeksiyon işlemi tamamlandıktan sonra iğneyi retro-orbital alan göz zarar vermemesi için bilinçli olmak için dikkatli bir şekilde çıkarın.
   Not: Enjeksiyon sonra orada az veya hiç kanama olmalı. Üvey CD11c transferini⁺ DCs da enjeksiyon (örneğin kuyruk ven) bir damardan yöntemini kullanarak gerçekleştirilebilir. Denetim fare CD11c almak⁺ normal tuz medyada kültürlü DCs.
7. Fareler burun konisi kaldırmak ve onları anestezi kurtarma sırasında yaklaşık 30 dakika izlemek.

7. 14 gün düşük doz Anjiyotensin II hazırlanması (140 ng/kg/dk)

1. Anjiyotensin II arabellek 5 M NaCl 500 μL ve Asetik asit 300 μL ekleyerek hazırlayın. Kuantum satış (QS) ilâ 30 mL deiyonize H₂0.
2. Anjiyotensin II 5 mg/mL stok çözüm Anjiyotensin II arabelleği ile geçiyoruz. Anjiyotensin II stok çözüm ozmotik minipump Anjiyotensin II a oran-in 140 ng/kg/dk her fare, vücut ağırlığına bağlı olarak teslim edecek böyle bir nihai toplama ulaşmak için ek arabellek ile sulandırmak.
   Not: Temel Anjiyotensin II (mg) = (fare ağırlık (g) x 0.2 mg / gün x 14 gün) / 1000
   Anjiyotensin II (mg) hazırlanan (temel Anjiyotensin II x 260 µL) = / Pompa hızı (0,25 μL/saat)
   Anjiyotensin II stok birimi (μL) hazırlanan Anjiyotensin II = / stok konsantrasyonu (5 mg/mL) x 1,000
   Birim (μL) seyreltik 270 - Anjiyotensin II stok birimi =
3. Anjiyotensin II stok birimi için seyreltik ekleyin (Anjiyotensin II arabellek) 7.2 adımda hesaplanan birim dayalı.
4. Steril hücre kültür başlık altında ozmotik minipump açın.
5. Seyreltilmiş Anjiyotensin II çözüm ekleyin ve herhangi bir hava şırınga ve iğne sınırdışı. Sağlanan iğne ozmotik minipump dibine yerleştirin ve yavaş yavaş yavaş ve dikkatli mesane iğneden geri çeker iken Anjiyotensin II çözüm enjekte.
6. Ozmotik minipump kafa ozmotik mesane tam olarak, herhangi bir hava kesesi almak için dikkat yerleştirin.

8. 14 gün düşük doz Anjiyotensin II ozmotik Minipumps implantasyonu

1. On gün sonra üvey CD11c transferini⁺ DCs, anestezi başlatmak ve sürekli olarak elde etmek ve uygun cerrahi düzlemin korumak için % 2 isoflurane almak için burun konisi için fare taşımak için bir isoflurane odasında yerde fareler.
2. Kürk boyun sırt tarafındaki makasları ile cerrahi sitesi hazırlamak için kaldırın. % 7.5 betadin ameliyat başlamadan önce ardından % 70 etanol ile traş alanı temizleyin.
3. Küçük bir insizyon attım (yaklaşık 1,5 cm) Deride oluşturun. Ozmotik minipump yerleşimini için subkutan bir cep oluşturmak için belgili tanımlık kesme hemostats takın.
4. Minipump subkutan cep içine yerleştirin. Yakın Cilt 2-3 cerrahi zımba ile yara ve başka bir uygulamada % 7.5 betadin yaraya uygulayın ve enfeksiyonu önlemek için zımba.
5. Onları onların kafes için dönmeden önce anestezi kurtarma sırasında fareler için 30-60 dk izlemek.
   Not: Fareler olman lazım 3-4 gün sonra ozmotik minipump implantasyonu izlenir.

9. akış sitometrik çözümlemesi için alıcı farelerin dalağı yalıtım

1. Düşük doz Anjiyotensin II infüzyonu 14 gün izole sonra tüp bebek yüksek tuz alma fareler gelen dalağı DCs evlat edinen transferi ile tedavi. (Adım 1 ve 2) listelenen kesin adımları izleyin.

10. yüzey boyama

1. 1 x PBS polistiren FACS tüp ve 4 ° C'de 8 min için 350 x g , santrifüj resuspended splenocytes aktarma Santrifüjü sonra süpernatant Aspire edin. Mac'ler tampon ve Santrifüjü (350 x g, 8 dk, 4 ° C) iki kez 1 mL ile yıkayın.
   1. Splenocytes istenen akış sitometrik panelleri sayısına göre farklı polistiren FACS tüpler eşit bölün.
2. Canlı/ölü hücre canlılığı boyama gerçekleştirmek için 1 x PBS ve santrifüj (350 x g, 8 dk, 4 ° C) hücrelerle yıkayın. 1 mL 1 x PBS resuspend ve hücre canlılık 1 µL ekleyin (malzeme tabloya bakın) leke. 4 ° C'de 15 dakika kuluçkaya (buzdolabı veya buz üzerinde) ışıktan korumak için folyo kaplı.
3. Hücre canlılığı leke kuluçka sırasında MAC'ler arabellek uygun bir birim içinde boyama hücre yüzeyine antikorlar kokteyl hazırlamak.
4. MAC'ler arabelleği, santrifüj (350 x g, 8 dk, 4 ° C), 1 mL hücrelerle yıkama ve ile antikor kokteyl 100 µL her hücre Pelet resuspend. Işık 4 ° C'de 30 dk için korumalı kuluçkaya
   Not: Her Akış Sitometresi antikor benzersizdir ve son derece yararlı ve önerilen doz titrasyon eğrisi her spesifik antikor için gerçekleştirerek gerekli antikor en uygun miktarını belirlemek için.
5. 1 mL MAC'ler arabelleği iki kez hücrelerle yıkama ve MAC'ler arabelleği akış sitometrik analiz için uygun bir miktar splenocytes resuspend.

Sonuçlar

Şekil 1 bir şematik yukarıda açıklanan adımları temsil eder. İzole fare dalağı CD11c için sıralanır⁺ DCs sıralama ve normal tuz ortamları (NS; 150 mmol NaCl) veya yüksek tuz medya (HS; 190 mmol NaCl) 48 h. CD11c kaplama manyetik hücre⁺ DCs sonra adoptively retro-orbital tarafından aktarılır enjeksiyon saf alıcı fareler için. On gün sonra 14 gün boyunca düşük doz Anjiyotensin II (140 ng/kg/dk) infüzyon için ozmotik minipumps ile fareler i...

Tartışma

Geçerli protokol yordamlar CD11c yalıtmak için optimize edilmiş⁺ DCs dalağı fareler ve adoptively onları DCs rol tuz kaynaklı hipertansiyonda çalışmaya naif hayvanlar içine transfer. Bu iletişim kuralı yalıtmak ve adoptively makrofajlar, monosit ve T ve B lenfositleri de dahil olmak üzere edinilmiş bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere diğer bağışıklık hücre alt kümeleri aktarmak için adapte edilebilir. Biz yeterli hücre hayatta kalma ve istikrar DC yüzey ifade işaretleyicilerin görünümünü elde etmek için ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
APC/Cy7 anti-fare CD11c	Biolegend	117324
autoMACS Çalışan Tampon	Miltenyi Biotec	130-091-221
CD11c Mikro Boncuklar Ultrapure	Miltenyi Biotec	130-108-338
Kollajenaz D	Roche	11088866001
DNaz I	Roche	10104159001
Kalsiyum ve magnezyum içermeyen DPBS	Corning	21-031-CV
FcR Bloke Edici Reaktif	Miltenyi Biotec	130-092-575
FITC anti-fare CD45	Biolegend	103108
GentleMACS C tüpü	Miltenyi Biotec	130-096-334
GentleMACS ayrıştırıcı cihaz	Miltenyi Biotec	130-093-235	Kullanım protokolü: Dalak 04.01
CANLI/ÖLÜ sabitlenebilir menekşe ölü hücre leke kiti	Invitrogen	L34964
LS Sütunlar	Miltenyi Biotec	130-042-401
QuadroMACs Seperator	Miltenyi Biotec	130-090-976
RPMI 1640 orta	Gibco	11835-030