Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Dang humması virüs kaynaklı akut viral Ensefalitis-benzeri hastalık bir Murine modeli

6.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/59132

⸱

28 Nisan 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate Institute of Medical Sciences, College of Medicine, Taipei Medical University, 2Department of Microbiology and Immunology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 3Center of Infectious Disease and Signaling Research, National Cheng Kung University

Bu makalede

Özet

Burada, nöropati gelişimini görüntülemek için bir immünopetik ıCR (Kanser Araştırma Enstitüsü) merkezi sinir sistemi enfeksiyonu murine modeli oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Akut viral ensefalitik bozuklukların aynı hastalık puanları ile izlenmesi, Dang virüse bağlı nöropati içinde vivo göstermek için gerçekleştirilebilir.

Özet

Ritim virüsü (DENV), sivrisinekler tarafından iletilen bir artthropod kaynaklı virüs,, plazma kaçağı nedeniyle ölümcül komplikasyonlar ile karakterize Dang Hemorajik ateş olarak bilinen şiddetli hastalığa neden olabilir, asit, plevral efüzyon, solunum sıkıntısı, şiddetli kanama ve organ bozukluğu. DENV enfeksiyonu birkaç olgu nörolojik belirtiler mevcut; Ancak çalışmalar DENV kaynaklı neuropathogenesis 'i daha fazla araştırmadı. Bu çalışmada, orta sinir sistemi (CNS) enfeksiyonu ile DENV indüksiyonu araştırılması için immünoteksel bir outbred ıCR (kanser araştırması Enstitüsü) fare kullanmak için bir protokol sunuyoruz, akut viral ensefalitis gibi progresyon takip Hastalığı.

Giriş

Flaviviridae ailesinin bir artthropod kaynaklı virüsü olan denv, üç viral yapısal proteini (capsid, premembran ve zarf) ve yedi viral yapısal olmayan PROTEINLERE (ns1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B) kodlayan pozıtıf anlamda RNA genomu içerir. ve NS5). Denv dört serotipleri (DENV1-4), hangi yaklaşık 390.000.000 kişi yıllık enfekte, hükümetler sivrisinek vektör ve hastalık kontrolü doğru önemli çabaları yönetmiş olsa bile küresel bir yük neden1. Şu anda, koruyucu aşılar ve terapötik antiviral ilaçlar geliştirilmesi altında ve daha uzun vadeli doğrulama gerektirir2. Klinik uygulamada, CNS enfeksiyonu olan bir Dang hastasıyla nadir olmasına rağmen, Dang hastalığı gelişiminin çeşitliliğini anlamak için daha fazla incelenmesi gerekir3. Daha fazla soruşturma ve doğrulama gereklidir; Özellikle, Dünya Sağlık Örgütü (WHO) ciddi Dang 'ın sınıflandırılmasında, bilişsel bozukluk, konvülsiyonlar, ensefalopati ve ensefalit gibi CNS bozukluğu katılımı dahil etti3,4. Denv enfeksiyonunun hayvan modellerini inşa etmek, DENV enfeksiyonu neuropathogenesis keşfetmek için vazgeçilmez.

Denv tarafından cns enfeksiyonu oluşturmak için, çeşitli çalışmalar denv enfeksiyon farklı yollar idam, dahil olmak üzere (1) C57BL/6 fareler intraserebral aşı 4 x 103 plak şekillendirme birimleri (PFU) adapte olmayan DENV35, 6, (2) alınan Balb/c fareler intraperitoneal inokülasyon 7 x 104 PFU in vitro nörouyarlanmış DENV47, (3) alınan İsviçre fareler intraserebral aşı 1 x 105 PFU In vivo nörouyarlanmış DENV18, ve (4) 1 x 106 PFU 'ya adapte olmayan DENV29' u alan ICR Suckling fareler intrakerebral ve intraperitoneal Co-inoculation. Bu çalışmaların bulgularınagöre5,6,7,8,9, farelerde denv enfeksiyonu beyin viral çoğaltma sonucu, akut viral yol ensefalit benzeri sendromlar, ekstremite felç ve postural istikrarsızlık, CNS nörotoksisite ve inflamasyon, genel ve lokalize plazma sızıntısı ile kan-beyin bariyeri (BBB), ve hırıllık eşliğinde davranışsal değişiklikler. Bu çalışmaların tüm sonuçları5,6,7,8,9 denv 'in CNS ve akut viral ensefalitis gibi indüksiyon enfekte yeteneği göstermiştir enfeksiyon aşağıdaki hastalık.

Mevcut bulgularımıza dayanarak9,10,11,12,13,14,15, biz bir in vivo olarak denv enfeksiyon bir murine modeli oluşturduk Platform/faktörler viral çoğaltma karşı hedeflenen ajanlar terapötik etkinliğini incelemek için, yanı sıra nörotoksisite. Burada, CNS enfeksiyonunu incelemek ve DENV 'in neden olduğu farklı önem dereceleri ile nöropatilerin gelişimini izlemek için immünoptikli bir outbred ıCR Mouse oluşturmak için kullanılan protokolü rapor ediyoruz. Sonuçları zaman bağımlı bir şekilde DENV-enfekte fareler ensefalit benzeri hastalığın önemli progresyonu gösterir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvan etüdünün deneysel protokolleri, Tayvan bilim ve Teknoloji Bakanlığı tarafından kurulan yönergelere göre, ulusal savunma Tıp Merkezi 'nin (ıAUC numarası: 16-261) Kurumsal hayvan bakımı ve Kullanıcı Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. enfeksiyon prosedürü

  1. Adapte olmayan DENV2 (strain PL046) stokları9 (aslen 2,5 x 107 ile 1 x 109 PFU/ml arasında değişen Tayvan 'da hastalık kontrolü merkezlerinden elde edilir).
  2. 1 x 106 PFU Ile Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) 1640 orta 40 μL toplam hacmine virüs stok seyreltmeli.
  3. 10 μL (2,5 x 105 PFU) seyreltilmiş virüs Ile 30 g iğne ile donatılmış bir 0,3 ml şırınga doldurun ve seyreltilmiş virüs 30 μl (7,5 x 105 PFU) ile 30 g iğne ile donatılmış başka bir 0,3 ml şırınga doldurun.
  4. 7 gün eski ıCR Suckling fareyi tutun ve aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
    1. İntraserebral enjeksiyon için, parmak ve başparmak arasında auricle basarak eğilimli bir konumda fareyi tutun ve intracerebrally lambda alanına seyreltilmiş virüs 10 μL enjekte, sagittal ve lambdoid sütür kesişiminde nokta 16 yaşında.
    2. İntraserebral enjeksiyon sonra, parmak ve başparmak kullanarak bir sırtüstü pozisyonda fareyi tutun ve intraperitoneal hafifçe murine ağının içine seyreltilmiş virüs 30 μL enjekte.
      Not: yamyamlık önlemek Için, 75% alkol annenin koku hissi geçici bir kayıp oluşturmak için kullanılır. Ayrıca, annelerinin dışkı ve idrar ile çöp kapsayan önerilmektedir.
  5. Onların kafesleri geri Suckling fareler Lay ve 5 dakika için bekleme ve anne süt emme de dahil olmak üzere fareler, avidite ile güvenlik poststimulasyonu kontrol etmek için bekleyin.
    Not: Çoğu zaman, fareler normal aktivite poststimulasyonu göstermek ve teknik zorluk aşağıdaki herhangi bir zararlı etkileri gibi görünmüyor. Bu deney sırasında hayvanlar, Tayvan Ulusal Savunma Tıp Merkezi 'nin kurumsal hayvan bakımı ve Kullanıcı Komitesi tarafından sürdürülmüştür.
  6. Farelerin günlük ilerlemesini vücut ağırlığı (mikrogram dengesi kullanarak), Akut Viral ensefalit benzeri hastalık (Bölüm 2 ' de açıklandığı gibi hastalık skorlamasına göre) ve hayatta kalma oranı9,10,11 ile değerlendir ,12,13,14,15.

2. hastalık skorlama

  1. Akut viral ensefalitis benzeri hastalıkların notunu izleyin. Sağlıklı fareler için 0 puan atayın; 1 küçük hastalıklar belirtileri ile fareler, kilo kaybı dahil, hareketlilik azaltılmış, ve bir kambur vücut yönü; limbik nöbet sergileyen fareler 2; 3 fareler için sergi limbik zayıflık, zorluk ve anterior ekstremite veya posterior ekstremite zayıflık ile hareket dahil; 4 felç için; ölüm için 5.
    Not: Puan 3 ulaştığında, hastalık belirtileri hızla gelişen olarak kabul edilir.
  2. Her grupta günlük test puanlarının ortalama ± SD 'yi kullanarak, her gün eğri bazlı bir rakam olarak, adım 2,1 ' e göre hastalığın puanlamasını çizin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Dang patogenezi için hastalarda şiddetli Dang humması ile ilişkili nörolojik komplikasyonlar bildirilmiştir4. Bu vakalar klinikte nadir olmasına rağmen, DENV enfeksiyonunun immünoyetenekli bir duvar modeli oluşturmak sadece immünopatogenezi incelemek için değil, aynı zamanda CNS enfeksiyonu, nöroinflamasyon, nörotoksisite ve akut viral ensefalitis benzeri bir hastalık. Bu çalışmada, mevcut modelimize göre9,10

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Şiddetli Dang hastalığı hastalarının CNS 'inde denv enfeksiyonu tespit edilmiştir3,17, Dang patogenezi sırasında akut viral ensefalitin tezahürü olasılığını düşündürmektedir. Burada, özellikle DENV kaynaklı akut viral ensefalitis benzeri hastalıklara odaklanarak, şiddetli Dang CNS disfonksiyonunun katılımı ile ilgili olarak DENV enfeksiyonunun bir in vivo murine modelini bildiriyoruz. Önceki modeller ile karşılaştırıldığında, özellikle tek rota enfeksiyonu için (...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Bu çalışmada bilim ve Teknoloji Bakanlığı (MOST107-2321-B-038-001) ve Intramural finansman 106TMU-CIT-01-2, Taipei, Tayvan hibe tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Roswell Park Memorial Institute 1640 orta (RPMI)Gibco11875-085Seyreltici virüs
0.3 mL İnsülin Şırıngası BD Ultra-Fine­II328838İntraserebral ve intraperitoneal enjeksiyon
Mikro teraziMETTLER TOLEDO'nun LabXAL104Ağırlık faresi
Uyarlanmamış DENV2 (suş PL046)Tayvan Hastalık KontrolMerkezleri-Enfekte fare
Kanser Araştırmaları Enstitüsü (ICR) emziren fareBioLASCO Taiwan Co.,Ltd-Faremodelimiz

Kaynaklar

  1. Guzman, M. G., Gubler, D. J., Izquierdo, A., Martinez, E., Halstead, S. B. Dengue infection. Nature Reviews Disease Primers. 2, 16055(2016).
  2. Katzelnick, L. C., Coloma, J., Harris, E. Dengue: knowledge gaps, unmet needs, and research priorities. Lancet Infectious Diseases. 17 (3), e88-e100 (2017).
  3. Carod-Artal, F. J., Wichmann, O., Farrar, J., Gascon, J. Neurological complications of dengue virus infection. Lancet Neurology. 12 (9), 906-919 (2013).
  4. Geneva: World Health Organization. Dengue: Guidelines for Diagnosis, Treatment, Prevention and Control: New Edition. , WHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee (2009).
  5. Amaral, D. C., et al. Intracerebral infection with dengue-3 virus induces meningoencephalitis and behavioral changes that precede lethality in mice. Journal of Neuroinflammation. 8, 23(2011).
  6. de Miranda, A. S., et al. Dengue-3 encephalitis promotes anxiety-like behavior in mice. Behavioural Brain Research. 230 (1), 237-242 (2012).
  7. Velandia-Romero, M. L., Acosta-Losada, O., Castellanos, J. E. In vivo infection by a neuroinvasive neurovirulent dengue virus. Journal of Neurovirology. 18 (5), 374-387 (2012).
  8. Despres, P., Frenkiel, M. P., Ceccaldi, P. E., Duarte Dos Santos, C., Deubel, V. Apoptosis in the mouse central nervous system in response to infection with mouse-neurovirulent dengue viruses. Journal of Virology. 72 (1), 823-829 (1998).
  9. Tsai, T. T., et al. Microglia retard dengue virus-induced acute viral encephalitis. Scientific Reports. 6, 27670(2016).
  10. Cheng, Y. L., et al. Activation of Nrf2 by the dengue virus causes an increase in CLEC5A, which enhances TNF-alpha production by mononuclear phagocytes. Scientific Reports. 6, 32000(2016).
  11. Ho, M. R., et al. Blockade of dengue virus infection and viral cytotoxicity in neuronal cells in vitro and in vivo by targeting endocytic pathways. Scientific Reports. 7 (1), 6910(2017).
  12. Jhan, M. K., et al. Anti-TNF-alpha restricts dengue virus-induced neuropathy. Journal of Leukocyte Biology. 104 (5), 961-968 (2018).
  13. Kao, J. C., et al. The antiparasitic drug niclosamide inhibits dengue virus infection by interfering with endosomal acidification independent of mTOR. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (8), e0006715(2018).
  14. Tsai, T. T., Chen, C. L., Tsai, C. C., Lin, C. F. Targeting heat shock factor 1 as an antiviral strategy against dengue virus replication in vitro and in vivo. Antiviral Research. 145, 44-53 (2017).
  15. Jhan, M. K., et al. Dengue virus infection increases microglial cell migration. Scientific Reports. 7 (1), 91(2017).
  16. Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Intraparenchymal Stereotaxic Delivery of rAAV and Special Considerations in Vector Handling. Methods in Molecular Biology. , 199-215 (2016).
  17. Fong, C. Y., et al. Mild encephalitis/encephalopathy with reversible splenial lesion (MERS) due to dengue virus. Journal of Clinical Neuroscience. 36, 73-75 (2017).
  18. Sarathy, V. V., et al. A lethal murine infection model for dengue virus 3 in AG129 mice deficient in type I and II interferon receptors leads to systemic disease. Journal of Virology. 89 (2), 1254-1266 (2015).
  19. Schul, W., Liu, W., Xu, H. Y., Flamand, M., Vasudevan, S. G. A dengue fever viremia model in mice shows reduction in viral replication and suppression of the inflammatory response after treatment with antiviral drugs. The Journal of Infectious Diseases. 195 (5), 665-674 (2007).
  20. Tyler, K. L. Acute Viral Encephalitis. New England Journal of Medicine. 379 (6), 557-566 (2018).
  21. Yauch, L. E., Shresta, S. Mouse models of dengue virus infection and disease. Antiviral Research. 80 (2), 87-93 (2008).
  22. Assir, M. Z., Jawa, A., Ahmed, H. I. Expanded dengue syndrome: subacute thyroiditis and intracerebral hemorrhage. BMC Infectious Diseases. 12, 240(2012).
  23. Kumar, R., Prakash, O., Sharma, B. S. Intracranial hemorrhage in dengue fever: management and outcome: a series of 5 cases and review of literature. Surgical Neurology. 72 (4), 429-433 (2009).
  24. Simanjuntak, Y., Liang, J. J., Lee, Y. L., Lin, Y. L. Repurposing of prochlorperazine for use against dengue virus infection. Journal of Infectious Diseases. 211 (3), 394-404 (2015).
  25. Rocha, B. A. M., et al. Dengue-specific serotype related to clinical severity during the 2012/2013 epidemic in centre of Brazil. Infectious Disease Poverty. 6 (1), 116(2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Dengue Vir s Ensefalitimm nokompetan Fare Modelintraserebral Enjeksiyonntraperitonal EnjeksiyonHastal k lerleme SkorlamasV cut A rl l mKambur Post r De erlendirmesiLimbik N bet zlemiHematoksilin Eozin BoyamaPlak Olu um Analizi
Dang humması virüs kaynaklı akut viral Ensefalitis-benzeri hastalık bir Murine modeli
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.