Method Article

Kantitatif analiz düz kas hücre soy izleme farelerin gelişmiş aterosklerotik lezyonları içinde hücresel kompozisyon

DOI:

10.3791/59139

⸱

February 20th, 2019

 ,  ,  , 
1Heart, Lung, Blood and Vascular Medicine Institute, University of Pittsburgh, 2Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia, 3Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia, 4Division of Cardiology, University of Pittsburgh School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz hayvan diseksiyon, doku gömme, kesit, Boyama, ve brachiocephalic arterler analizini sistematik yöntemleri de dahil olmak üzere son aşama fare aterosklerotik lezyonları hücresel bileşimi karakterize etmek için standart bir protokol öneriyoruz atheroprone düz kas hücre soy izleme fare.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ateroskleroz ölüm dünya çapında önde gelen nedenidir kalır ve umut verici tedavi hedeflerini açıklayan sayısız preklinik çalışmalar rağmen roman müdahaleler zor kalmıştır. Bu nedeniyle, kısmen, bir güven kurulan hastalık yerine genetik manipülasyon veya farmakolojik tedaviler ateroskleroz gelişimi üzerine etkilerini araştıran preklinik önleme modelleri için muhtemeldir. Ayrıca, bu çalışmaların sonuçları yüzeysel lezyon analizleri kullanımı ve lezyon hücre popülasyonlarının karakterizasyonu olmaması nedeniyle karıştırıcı çoğu kez. Bu çevirim engellerin üstesinden yardımcı olmak için bir tek hücre düzeyinde hücresel bileşiminde değişiklikler incelenmesi immünfloresan boyama ve confocal mikroskobu tarafından istihdam müdahale modelleri üzerinde artan bir güven öneriyorum. Bu amaçla, biz sözde bir terapötik Ajan hayvan diseksiyon, gömme, kesit, boyama ve brachiocephalic damar tutulumu miktar için sistematik bir yaklaşım da dahil olmak üzere bir fare müdahale modeli test etmek için bir protokol tanımlamak. Ayrıca, son aşama aterosklerotik lezyonları hücrelerde fenotipik çeşitliliği nedeniyle, hücre özgü, indüklenebilir soy izleme fare sistemleri ve nasıl bu tarafsız karakterizasyonu için kullanılacak olabilir kullanmanın önemini açıklamaktadır Aterosklerotik Lezyonu hücre popülasyonlarının. Birlikte, bu stratejileri daha doğru bir şekilde tedavi müdahaleler modellemek ve aterosklerotik hastalık çözümlemek için vasküler biyologlar yardımcı olabilir ve umut verici bir biçimde klinik başarı daha yüksek oranda içine çevirmek olacaktır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ateroskleroz morbidite ve mortalite dünya çapında koroner arter hastalığı, periferik arter hastalıkları ve felç çoğunluğu temel önde gelen nedenidir. Son aşama koroner ateroskleroz miyokardiyal bozma muhasebe Dünya nüfus ölüm1,2yaklaşık % 16 gibi ciddi komplikasyonlara yol açabilir. Halk sağlığı üzerindeki yıkıcı etkisi nedeniyle, önemli çaba ateroskleroz ilerleme roman tedavi stratejileri geliştirmek için sürüş mekanizmaları deşifre etmek için yapılmış. Henüz, onay olasılığını (LOA) klinik kardiyovasküler hastalık için en düşük arasında sadece ben (%8,7 için faz) klinik diğer alanları ile karşılaştırıldığında3oranıdır. Bu açıklanabilir kısmen birçok engellerin tarafından o ateroskleroz, neredeyse her yerde doğa, klinik olarak sessiz ilerleme ve önemli hastalık heterojenite dahil olmak üzere etkili ilaç geliştirme için poz veriyor. Ayrıca, preklinik hayvan çalışmaları suboptimal tasarımını da klinik çeviri başarı eksikliği oluşturuyor. Özellikle, müdahale çalışmaları mümkün olduğunda tedavi stratejileri etkinliğini araştırmak uygulamak için gerekli olduğunu düşünüyoruz. Ayrıca, son aşama Aterosklerotik Lezyonu hücresel kompozisyon gelişmiş karakterizasyonu kader haritalama ve fenotipleme tarafından da dahil olmak üzere lezyon analizleri için standart yordamları gerçekleştirmek için kritik bir ihtiyaç vardır.

Ateroskleroz çalışmaları büyük çoğunluğu uyuşturucu tedavi veya gen manipülasyon (nakavt veya çakma) hastalık başlama ve ilerleme önce sağlıklı genç farelerde oluşan ateroskleroz önleme modellerinin odaklanmak. Bu çalışmalar, genler ve ateroskleroz gelişmede rol sinyal molekülleri çok sayıda ortaya çıkardı. Ancak, bu hedeflerin çoğunu insan etkili tedaviler için çevirmek başarısız oldu. Gerçekten de, bir terapi gelişmiş aterosklerotik lezyonları olan yaşlı hastalar için sağlıklı genç fareler üzerinde etkisini tahmin etmek zordur. Bu nedenle, müdahale çalışmaları preklinik deneysel boru hattı büyük olasılıkla uygulanması alaka düzeyini ve etkinliğinin yeni bir tedavi daha doğru bir tasviri sağlar. Fikri bir önleme4,5,6 veya müdahale stratejisi7istihdam pro-inflamatuar sitokin İnterlökin-1β (IL-1β) inhibe çarpıcı farklı etkileri tarafından desteklenir. Önleme ve müdahale çalışmaları arasındaki farklar öneririz farklı hücresel süreçler farklı ateroskleroz geliştirme aşamalarında ortaya ve önleme çalışmaları muhtemel olduğu gerçeği vurgulamaktadır yetersiz klinik senaryo modellemek yeterli.

Amerikan Kalp Derneği son zamanlarda uygun deneysel tasarım, yordam standardizasyon, analiz ve hayvan ateroskleroz çalışmalar8/ raporlama için öneriler ayrıntılı bilimsel bir açıklama yayınladı. Faydaları ve kısıtlamaları baskın teknikleri alanında kullanılan vurgulamaktadır. Örneğin, aorta Sudan IV tr yüz boyama genellikle ilk okuma gerçekleştirilir. Lipid birikimi Sudan IV tr yüz boyama küresel plak yükünün değerlendirmesi için uygun bir yöntem olsa da, daha gelişmiş son aşama lezyon aşamasındaki yağlı çizgi lezyonlar ayırt edemiyor. Bu nedenle, tr yüz boyama yorumu kez belirsiz ve yüzeysel9' dur. Dikkatli analiz dokusunun kesitleri Miktar Endeksi lezyon istikrar ve morfolojik parametreleri gemi, lezyon ve Lümen boyutu kullanarak bir deneme etkisini daha doğru bir anlayış sağlar.

Son olarak, insan histopatoloji çalışmalarda hücresel kompozisyon rüptürü daha iyi bir tahmin boyutundan lezyon kendisi, düz kas hücreleri (SMC) içinde lezyonlar yoksul ve makrofajlar10rüptürü daha duyarlı olmak zengin olduğunu düşündürmektedir, 11. Bu gözlemler klasik hücre kimliği için kullanılan işaretleri boyama dayalı idi (yani, SMC ve LGALS3 veya CD68 makrofajlar için ACTA2). Ancak, bu işaretleri ifade kesinlikle tek hücre türü için birden fazla soy SMC, endotel hücreleri ve myeloid hücrelerin12gibi plastisite nedeniyle aterosklerotik lezyonları içinde sınırlı değildir. Özellikle, SMC benzersiz tanımlaması Aterosklerotik Lezyonu içinde son on yıl kadar dedifferentiate ve soy özgü marker genleri (bir süreç denir bastırmak için bu hücre özelliği nedeniyle neredeyse imkansız fenotipik anahtarlama) yaralı ya da hastalıklı gemiler13' te. Bu sınırlama SMC tanımlama soy izleme7,14,15,16,17,18, geliştirme tarafından hile 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. o oluşmak-in kalıcı olarak etiketleme SMC ve onların döl onların kaderi ve fenotipik evrim ateroskleroz ilerleme sırasında SMC özel rehberleri tarafından tahrik Cre recombinase ifade kullanarak izlemek için (yani, Myh117,15,17,18,19,20,21,22,23 , 24, Acta225,26 ve, SM22α14,16) ve [Bentzon ve Majesky gözden gazetecilere (örn, floresan proteinler, β-galaktozidaz) harekete geçirmek 201827]. Bir SMC soy izleme embriyogenez ayarı dışında istihdam ilk çalışmalar, SMC onların fenotip ve transdifferentiate chondrogenic hücrelere sırasında Vasküler kalsifikasyon kullanarak modüle ki kanıt Speer vd.14 sağlanan bir SM22α Cre R26R LacZ soy izleme modeli. Bu çalışmalar SMC soy izleme öncülük rağmen herhangi bir belirli olmayan SMC ifade SM22α hastalığın ortamda tarafından muhabir olarak etiketlenmiş olacak ki onlar kısmen belirsiz vardı. Bu sınırlama geliştirme ve kullanımı, Tamoksifen indüklenebilir Cre ERT/hücre etiketleme zamansal bir denetim erişimine izin verme LoxP tarafından baypas edilmiş. Sadece tamoxifen teslim sırasında oluşur ve izleme Cre içinde etkinleştirme alternatif hücre tiplerinin kaçınarak Cre ERT ifade tamoxifen pozlama, zaman sürüş hücre türüne özgü organizatörü ifade hücre sınırlı hücre etiketleme hastalığın ilerlemesini ayarlama. SMC ateroskleroz, floresan gazetecilere (eYFP7,15,17,18 ile ilişkili tamoxifen indüklenebilir Myh11- Cre/ERT2 transgene içinde soy izleme için , 21, mTmG19,25, klonal genişletme çalışmaları için konfeti20,22,23 ) olağanüstü verimliliği ve özgüllük SMC etiketleme göstermiştir ve vardır Kader harita SMC nüfus son yıllarda yapılan çalışmalarda aterosklerotik lezyonları için kullanılmıştır. Önemlisi, bu çalışmalar bu açığa: 1) SMC % 80'i içinde aterosklerotik lezyonları yapmak gelişmiş değil ifade immunohistological analizinde kullanılan herhangi bir geleneksel SMC işaretleri (ACTA2, MYH11) ve bu nedenle soy izleme olmadan tanımlanmış 17; 2) SMC kümelerine işaretleri makrofaj işaretleri veya Mezenkimal Kök hücre işaretleri16,17,19da dahil olmak üzere diğer hücre tiplerinin hızlı; ve 3) SMC yatırım ve Aterosklerotik Lezyonu oligokonal genişleme doldurmak ve SMC klonlar korumak plastisite geçiş phenotypically farklı popülasyonlar20,23. Özetlemek gerekirse, bunu şimdi düz kas hücreleri bir dikkat çekici fenotipik çeşitlilik aterosklerotik lezyonlarının sunmak ve faydalı veya zararlı rol lezyon Patogenez onların fenotipik geçişler niteliğine bağlı olarak üzerinde olabilir açıktır. Bu keşifler SMC athero teşvik fenotipik geçişler son aşama ateroskleroz hedefleme için dikkate değer yeni bir tedavi cadde temsil eder.

Burada, biz hayvan diseksiyon, gömme, kesit, boyama ve brachiocephalic damar tutulumu miktar için sistematik yöntemleri de dahil olmak üzere son aşama fare aterosklerotik lezyonları analiz etmek için standart bir protokol öneriyoruz. İnterlökin-1β inhibisyon SMC kader ve fenotip üzerindeki etkisini belirlemek için SMC lineage ApoE- / - fareler bir anti-IL1β antikor veya IgG izotip eşlemeli denetimin haftalık enjeksiyonları almadan önce 18 hafta boyunca Batı diyet beslenen izleme kullanılır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvancılık, işleme ve yordamlar Virginia Üniversitesi ve Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı Komitesi tarafından kabul edildi.

1. nesil SMC soy izleme fareler

  1. Myh11- Cre/ERT2 erkek28 doğurmak (Jackson laboratuvar; #019079) R26R-EYFP kadın ile (Jackson laboratuvar; #006148) Myh11- Cre/ERT2+ R26R-EYFP elde etmek için+/ + erkekler.
  2. Myh11- Cre/ERT2+ R26R-EYFP doğurmak+/ + erkek ApoE- / - dişi fareler ile (Jackson laboratuvar; #002052). Döl çapraz ve Genotipleme Myh11- Cre/ERT2+ R26R-EYFP tarafından seçin+/ + ApoE- / - erkek ve R26R-EYFP+ / + ApoE- / - dişi fareler son doğurmak olarak. Kuyrukları klip ve Genotipleme littermates üzerinde gerçekleştirin. Tüm erkek fareler-meli var olmak Myh11- Cre/ERT2+ R26R-EYFP+ / + ApoE- / - ve deneysel fareler (şekil 1A) kullanılabilir.
    Not: Genotipleme protokolleri Jackson laboratuvar Web sitesinde bulunabilir. Myh11 Cre/ERT2 transgene kadın kullanımı engellemek Y kromozom üzerinde yer alır. Diğer soy izleme sistemleri kullanılabilir ama bu sistemi en güvenilir soy izleme stratejisi kader harita SMC ateroskleroz için bugüne kadar.

2. düz kas hücre soy izleme fare diyet ve tedavileri

  1. Erkek Myh11- Cre/ERT2+ R26R-EYFP var+/ + ApoE- / - fareler altı ila sekiz hafta-in yaş Myh11 kalıcı olarak etiketlemek için gelen bir dizi 1 mg tamoxifen enjeksiyonları almak+ SMC YFP ile ve onların kaderi (şekil 1 izlemek için A).
    1. 55 ° C'de ısı fıstık yağı
    2. Tamoxifen bir çözüm 10 mg/mL, hazırlamak ve 55 ° C'de tamoxifen tam dağılmasına kadar kuluçkaya Önceden ısıtılmış fıstık yağı ekleyin.
    3. 10 mg/mL tamoxifen çözüm 0.1 mL ile mayi iğne on iğne bir dizi için iki hafta içinde gerçekleştirmek.
      Not: Tamoxifen bir biohazard ve bakımı ile ele alınması gerekir.
  2. 5-7 gün sonra son enjeksiyon ile tamoxifen, Gelişmiş aterosklerotik lezyonların geliştirme için izin vermek için 18 haftalık bir süre (örneğin, Batı diyet yağ dan kcal % 42; % 0,2 total kolesterol) yüksek yağlı diyet yemek diyet yerine hangi sürekli olarak aort, aortik kökü, brachiocephalic arter ve abdominal aorta da dahil olmak üzere birden çok damar yataklarında geliştirir.
  3. 18 haftalık yüksek yağlı diyet beslenme, terapötik müdahale istenen süre (şekil 1B) başlar.
    Not: örnek olarak, bir anti-IL1β antikor veya IgG izotip eşlemeli denetim yüksek yağlı diyet 18 ve 26 hafta arasında bir haftalık mayi enjeksiyonlar yapılır.
  4. 8-16 h önce plazma kolesterol ve trigliserid için doğru okumalar gerçekleştirmek için hasat doku için hızlı farelere gıda kaldırın.

3. hasat Brachiocephalic arter (BCA)

  1. Hayvan ötenazi hayvan bakım ve kullanım Komitesi (ACUC) gereksinimleri ve yönetmeliklere uymalıdır. CO2 boğulma approximatively 5 dakika tarafından deneysel fareler ötenazi ve ölüm tarafından ayak çimdik doğrulayın.
  2. Fare tartmak ve kan toplamak.
    1. Fare tartmak
    2. % 70 ile fare ventral yan sprey etanol
    3. Kardiyak ponksiyon 1 mL şırınga ventrikül içinde göğüs boşluğu sol taraftan bağlı 25 G iğne ekleyerek gerçekleştirin. 0.1-1 mL kan toplanabilir.
    4. Şırınga temizlenerek bir EDTA vakum tüp kan aktarmak ve bir rock'çı veya rotator için 10-15 dk tüpü yerleştirin.
    5. Kan bir 1,5 mL tüp ve santrifüj 4 ° C'de 10 dakika 250 x g için transfer Dikkatli bir pipet ve yeterli ipuçları en iyi plazma faz çekilme ve yeni bir tüp aktarın. Kolesterol ve trigliserit ölçme öncesinde-20 ° C'de depolayın.
      Not: tam kan kan hücre sayımları ve sitokinler veya bağışıklık hücre profil oluşturma dahil olmak üzere diğer kan bileşenleri de dahil olmak üzere ek çalışmalar için kullanılabilir.
  3. Bir kesik approximatively 2 cm orta Karin kullanarak cilt makas ve karın boşluğu ortaya çıkarmak için cilt çekin olun. Karın zarını göğüs kemiği olmadan zarar verme dokulara kadar kesti. Göğüs, kalp ve akciğer zarar vermemesi için dikkatli olmak ile orta aksiller satırında iki kesim yapmak.
  4. Göğüs kemiği cımbız ile kaldırın ve kısmen kalp ortaya çıkarmak için diyafram kesti. Kalp kolayca erişilebilir değilse, Sağ atrium ulaşmak için göğüs kafesi yeterince Kes gitsin.
  5. Fare ile bir yerçekimi perfüzyon sistemi (Şekil 2A) sıvı. Öyle ki perfüzyon sıvı basıncı ortalama fare kan basıncı (Şekil 2B) eşdeğerdir yerçekimi perfüzyon sistemi yükleyin. Bu sistem perfüzyon tutarlılık için izin verir ve her ikisi de gemi morfoloji ve floş kırmızı kan hücreleri korur.
    Not: başvuru olarak, fizyolojik bir tansiyon 120 mmHg (ortalama sistolik kan basıncı) ve 70 mmHg (ortalama diyastolik kan basıncı)29,30C57Bl6 fareler var. Ortalama sistolik ve diyastolik kan basıncı ile fare genetik arka plan değişebilir.
    1. Bir 23 bağlanmak veya 25G yerçekimi perfüzyon sistemi için iğne kelebek ve fosfat tamponlu tuz (PBS) tüpler havadan kovmak için iğne çalıştırın. İğne sol ventrikül yerleştirin ve iğne yerde güvenli. Iris makas kullanarak, küçük bir insizyon attım (< 2 mm) içine Sağ atrium ya da artan aort olun.
    2. 5 mL ile de PBS, sonra 10 mL % 4 Paraformaldehyde (PFA) çözeltisi, sonra PBS ile 5 mL sıvı. PBS ve % 4 İngiltere'de yılın çözüm ortam sıcaklığında kullanın.
    3. Faiz (örneğin, karaciğer, akciğer, dalak) dokuların toplamak ve % 4 İngiltere'de yılın çözümde koyun.
  6. BCA maruz
    1. Boyun bölgesi deri ve tükürük bezleri kaldırarak temizleyin.
    2. Bir kesme makası kullanarak ağız sapı Göğüs kafesine midline gerçekleştirin. Makas yakından göğüs kemiğinin altında bulunan damarlara zarar görmesini önlemek için göğüs kemiği arkasında yakın dikkat et. Her iki göğüs kafesi Forseps ile tam olarak göğüs boşluğunu açmak için çekin. Şahdamarı kısmen görünür olmalıdır.
    3. Kas ve bağ dokusu ve yağ iyi cımbızla doğru şahdamarına kadar brachiocephalic hastalığının çatallanma ve aort temizlenmiş ve bağ dokusu ve yağ (şekil çevreleyen izole arter kaldırarak temizle 2C).
  7. BCA kaldırmak
    1. Forseps kullanarak, onun çatallanma aşağıda doğru karotis kapmak ve forseps (Şekil 2D) üzerinde ilk bir kesim yapın.
    2. Boyun arterine elinde hala, subklavyan arter ile ikinci bir kesme yapmak. Son iki aort brachiocephalic arter (Şekil 2D) her iki tarafında aracılığıyla kesikler.
    3. Diğer damar doku (örneğin, abdominal aort, aortik kök içeren kalp üstün parçası) ilgi toplamak.
    4. BCA ve diğer dokularda % 4 İngiltere'de yılın çözüm gecede, oda sıcaklığında yerleştirin.
      Not: Fiksasyon saat çalışma tutarlı tutulmalıdır.

4. doku işleme ve kesit

  1. %4 PFA ve etiketli doku kaset (şekil 3A) yerde dokuyu. Kullanım köpük yastıkları doku sağlamak için kaset onun yönelimi ve kaset işleme adım (şekil 3B) aracılığıyla, siz bunu baþka korur. Kasetleri kapatın ve doku (24-72 s) işleme kadar % 70 etanol içinde bırakın.
    1. Histolojik ve immünfloresan aşağıdaki gibi (bir işlemci ile vakum nüfuz kullanarak rutin gece yordamı örneği) boyama için toplanan işlem BCA ve diğer doku: % 10 tarafsız arabelleğe alınmış formalin, ortam sıcaklığında (2 x), 30 dk için % 75 etanol 60 dk 30 ° c (1 x), % 90 etanol 60 dk 30 ° c (1 x), % 95 etanol 60 dk 30 ° c (1 x), % 100 etanol 60 dk 30 ° c (3 x), Ksilen 60 dk 30 ° c (3 x) ve parafin 80 dk 62 ° c (3 x) için için için için için.
  2. BCA dikey olarak aort blok yüz (şekil 3C) yakın ile embed.
  3. Parafin blok bir döner microtome (10 µm kalınlık) katıştırılmış doku erişene dek kesti.
  4. Doku görünür olduğunda, bir bölümü konumu belirlemek için mikroskop altında incelemek. Aort hala görünmüyorsa, bir bölümü her zaman aralığında inceleyerek bir anda en fazla on 10 µm bölümleri kaldırın.
  5. Aort yoluyla kesitli ve brachiocephalic arter görülür tamamen microtome blade dikey doku konumlandırmak için blok yönünü ayarlanır.
  6. BCA 10 µm bölüm kalınlığı kes. Bu noktada, tüm bölümleri slayt başına üç bölümlü seri olarak toplanır. Subklavyan bifurkasyon (şekil 3D) erişene dek toplamak.
    Not: Sonraki z-yığın confocal resim alma ve tek hücre sayımı için 10 µm bölüm kalınlığı, BCA kesmek önemlidir. Bu kalınlık Derneği arasında tek bir çekirdek ve sitoplazmik veya yine de kesit derinliğini boyama membran titiz ve sigara cofounding değerlendirmesine olanak sağlar.

5. immünfloresan boyama

Not: Aterosklerotik lezyonları tam bir karakterizasyonu morfolojik parametreleri değerlendirilmesi ve plak veya istikrarsızlık ve mevcut Protokolü odak olmayacaktır hücresel kompozisyon dizinleri içerir. Lezyon Morfoloji, kollajen içerik ve intraplaque kanama Movat7,17, PicroSirius kırmızı 7,31, Ter119 boyama 7,18, sırasıyla analiz edilebilir. Burada, lezyonlar hücresel bileşimi analiz etmek için iletişim kuralı anlatacağım.

  1. Aşağıdaki çözümlerden bir kimyasal başlık altında oda sıcaklığında slaytları kuluçkaya: Ksilen 5 dk (2 x), 5 min (2 x) için % 100 etanol, 5 min (2 x) için % 95 etanol, 5 min (2 x) ve deiyonize H2O için % 70 etanol (diH2O) 5 min (2 x) için.
  2. Antijen alma çözüm üreticinin yönerge göre slaytları kuluçkaya.
    1. Sitrik asit ile antijen maskesinin çözüm tabanlı (bkz. Tablo malzeme), bir boyama rezervuar ve dolgu slaytlara üst hazır antijen alma çözümü ile çözüm diH2O. yer 320 ml 3 mL seyreltik.
    2. Herhangi bir boş yuva slayt rafa bile Isıtma sağlamak için boş slaytlar ile doldurun. Antijen alma çözüm buharlaşma kaynamaya izin vermek için bir kapak ile konteyner kapağı.
    3. Bir mikrodalga fırında yaklaşık 675-700 Watt 20 dk slaytları ısı. Kontrol düzenli olarak slaytlar ve yerine buharlaşan sıvı ile öyle ki bölümleri kalır diH2O maskesinin çözümde her zaman sular altında.
    4. Slaytlar, oda sıcaklığında 1 h için çözüm soğumasını sağlar.
  3. 6 g balık cilt jelatin (FSG) 1 litre PBS çözülür. PBS/FSG arabellek yıkama olarak kullanılır. PBS/FSG % 10 normal serum engelleme çözeltisi hazırlamak.
    Not: Balık cilt jelatin engelleme arabellek hazırlanmasında kullanılır. FSG memeli antikorlar ile cross-react serum proteinleri arka plan gürültü en aza indirerek içermiyor. Ancak, FSG endojen biotin içerir gibi diğer engelleme seçeneğini biotin algılama sistemleri ile tercih edilmelidir. Normal serum kullanılan türü kullanılan ikincil antikor üzerinde temel alır. Eşek ikincil antikorlar kullanıldığında, normal at serum engelleme ve antikor dilutions için seçilmelidir.
  4. PBS slaytları, oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. Daire doku bölümleri ile hidrofobik bir kalem. Engelleme arabellek için 1S oda sıcaklığında PBS/FSG/normal serum bölümlerle kapsar. Süre belgili tanımlık doku engelleme PBS/FSG/normal serum birincil antikor çözümde bu adımı sırasında hazır olun.
  5. Gecede 4 ° C'de bir nem odasında PBS/FSG/normal Serumda seyreltilmiş birincil antikorlar ile kuluçkaya. Bir bölüm başına slayt IgG denetim antikorlar denetlemek için birincil antikor özgüllük için birincil antikor olarak aynı konsantrasyon, bir karışımı ile inkübe.
  6. Slaytları aşağıdaki gibi oda sıcaklığında yıkama: PBS/FSG 5 min (3 x), o zaman PBS için 5 dk (1 x) için.
  7. İkincil antikorlar fluorophore Birleşik ( Tablo malzemelerigörmek) ve diamidino-2-phenylindole (DAPI) ile oda sıcaklığında 1 h için PBS/FSG/normal Serumda seyreltilmiş çekirdeği counterstaining için kuluçkaya. Slaytlar ışıktan korumak.
  8. Slaytlar 5.6 adımda anlatıldığı gibi yıkayın.
  9. Montaj medya floresan için uygun kullanarak slaytları mount ( Tablo malzemelerigörmek).

6. confocal mikroskobu

Not: Bir confocal mikroskop ve z-yığın edinme kullanımı tek hücre sayım için önemlidir.

  1. Set çalışma kullanılmak üzere satın alma Parametreler: görüntü çözünürlük (1024 x 1024 veya 2048 x 2048 piksel); Optik yol ve ikincil antikorlar seçili arada bir fonksiyonu olan kanal sayısı; tarama hızı (önerilen tarama hızı: 7-8); ve fark girişim kontrast (DIC) kanal.
  2. Birincil antikorlar ve IgG denetim ile lekeli bölümleri kullanarak, Dedektör hassasiyeti, lazer güç ve ofset bireysel her kanal için ayarlayın. IgG denetimin arka plan sinyal en aza indirmek için kullanılır.
  3. Üst ve alt pozisyonlar z-yığın edinme için ayarlayın. Kazanmakla kalınlığı ve elde etmek için yığın sayısından. Bu parametreleri çalışma tutarlı kalması gerekir.
    Not: 1 µm kalınlık görüntüleme 8-10 yığınları önerilir. Çalışma yansıma yığın sayısından tutarlı kalmak.
  4. Görüntü doku bölümleri birincil antikorlar IgG için ve denetim DIC de dahil olmak üzere tüm kanallar ile lekeli.
  5. En az bir görüntü ile bir ölçek çubuğu tek hücre sayımı sırasında görüntü kalibrasyonu için etiket.

7. tek hücre sayımı

  1. Yükleyin ve ImageJ açın. Gerekirse, eklentileri bölümünde indir indir > giriş/çıkış ImageJ Web görüntü dosyasını açmak için üretilen confocal mikroskop tarafından oluşturulan görüntüler ve biçiminin bağlı olarak.
  2. Belgili tanımlık imge eğe ImageJ içinde açın.
  3. 6,6içinde oluşturulan görüntü kullanarak bar başvuru ölçekli görüntü kalibre.
  4. Bölge içinde tek hücre sayımı DIC kanal (şekil 4) kullanarak gerçekleştirilecek ilgi betimlemek.
    Not: Bir bölge bir anda belirlenen. Deneysel soruluk bağlı olarak, tek hücre sayımı tüm lezyon alanında gerçekleştirilebilir (bkz: 7.3.1) ve/veya lezyon bölge içinde. Hücresel kompozisyonunu lezyon rüptürü eğilimi önemli bir dizin olduğundan, soruşturma fibröz kap çevrenin ( 7.3.2bakınız) özellikle uygundur.
    1. Lezyon alan Lümen sınır (şekil 4A; beyaz ok) ve iç elastik lamina (şekil 4A; sarı ok) görünür DIC görüntüde takip ederek betimlemek.
    2. Fibröz kap çevrenin analizi, Lümen den 30 µm uzak sınır belirlemek ve kenarlığı ( şekil 4B-D) izleyin.
      Not: Fibröz kap alan klasik ACTA2 + hücreler ve Lümen (şekil 4B) underlaying kollajen zenginleştirilmiş bölge olarak tanımlanır. ACTA2 + hücre ve kollajen zenginleştirme lezyon istikrardır kritik bir rol oynamaktadır. Önceki çalışmalarda belirlenen ACTA2 + hücre zengin lifli kap alan SMC-lineage Lümen den 30 µm kalınlığında Ortalamalar izleme ApoE- / - fareler 18-26 hafta (şekil 4C) için yüksek yağlı diyet beslenir. Böylece, titiz karakterizasyonu genetik manipülasyon veya fibröz kap alan hücresel kompozisyon farmakolojik tedavi etkileri son derece uygundur.
  5. Kanalları araçlar panelini açın (Görüntü > renk > Kanal araçları) ve sözde rengi farklı boyama kanalları (şekil 5A; kutusu 1).
  6. Renk kanalları birleştirme (Görüntü > renk > birleştirme renkleri) (şekil 5A; kutusu 2). Tüm kanallar aynı görüntü (şekil 5B) görünür olmalıdır. Tek tek renk kanallarına (şekil 5A; kutusu 1) Kanal araçlar panelini kullanarak etkinleştirebilir veya devre dışı.
  7. Sayma aracı ayarlayın.
    1. Araç çubuğunda sayım simgesine sağ tıklayın (şekil 5C; kutusu 1) ve Çok noktalı aracınıseçin.
    2. (Şekil 5C; kutu 2) Noktası aracı panelini açmak için aynı simgesine çift tıklayın.
    3. Hücreleri saymak için kullanılan öğelerin boyutunu ve türünü seçin.
    4. Göstermek tümkontrol edin.
  8. DAPI kanal Kanal araçlar panelinde sadece açın ve sayaç kanal 0 (şekil 5C; kutusu 3) seçin. Tıklatın öğesini olabilir bireysel çekirdeği üzerinde (örneğin, Sarı noktalar şekil 5C-D). Tüm çekirdeklerin faiz bölgede lekeli saymak için z-yığınlar ilerleyin. Olay sayısı sayacı kanal Noktası aracı panelinde (şekil 5C; kutusu 4) aşağıda belirtilen.
  9. Başka bir boyama kanalı aç (örneğin, eYFP boyama). Sayaç Kanal 1'i seçin. Bir colocalization DAPI ve boyama arasında olduğu hücreler'i tıklatın. Sitoplazmik boyama, boyama ile select hücreleri çevreleyen çekirdeği tüm derinlik üzerinde çekirdek (birkaç z-yığınlar kontrol edin).
  10. Kombinasyonları boyama ve hücre popülasyonlarının ilgi saymak için yeni sayaç kanalları seçme değiştirerek yineleyin. Her nokta rengi farklı hücre nüfus (şekil 5D) temsil eder. Sonuç hücreleri DAPI toplam sayısı veya bölge alanına hücre sayısı olarak ifade edilebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe- / - fareler altı ve sekiz hafta-in yaş yüksek yağlı diyet beslenen ediliyor önce arasında tamoxifen ile enjekte. 18 haftalık yüksek yağlı diyet beslenme, sekiz fareler iki grup haftalık bir fare monoklonal anti-IL-1β antikor veya 10 mg/kg 8 hafta (şekil 1)7için izotip eşlemeli IgG denetimi ile tedavi edildi. Fare feda etti ve % 4 PFA-PBS Çözümle periosteum. Brachiocephalic arterler di...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onlarca yıllık araştırma ve ateroskleroz eğitim teknik gelişmeler rağmen alan klinik tedaviler34,35bilimsel bulgular çeviri hayal kırıklığı bir geçmişi vardır. Bu olay kısmen hayvan modelleri, Deneysel Tasarımlar ve lezyon analizleri tutarsızlıklar tarafından açıklanabilir. Burada, soy izleme fareler7kullanarak gelişmiş aterosklerotik lezyonları hücresel bileşiminde çözümlemek için kullanılan deneysel bir boru hattı açıklar. Hücre kader eş...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz Merkezi biyolojik (NIH 1S10OD019973-01 tarafından desteklenen) görüntüleme için Pittsburgh Üniversitesi onların yardım için teşekkür ederim. Bu eser desteklenmiştir bilimsel kalkınma hibe D.G. R.A.B. için Amerikan Kalp Derneği'nden 15SDG25860021 tarafından desteklenen tarafından desteklenmektedir NIH F30 HL136188 verin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
% 16 Paraformaldehit sulu çözeltiElektron Mikroskobu BilimleriRT 15710Doku perfüzyonu ve fiksasyonu
23G kelebek iğneFisherBD367342
25G iğneFisher14-821-13D 
A1 Konfokal mikroskopNikonKonfokal mikroskop
ACTA2-FITC antikoru (fare)Sigma AldrichF3777Birincil Antikor
Alexa-647 anti keçiInvitrogenA-21447İkincil antikor
Antijen Maskeleme solüsyonu, Sitrik asit bazlıVector LabsH-3300Antijen alma solüsyonu
Chow DiyetiHarlan TekladTD.7012
LamelFisher12-544-14Herhangi bir 50 x 24 mm kapak camı
DAPI (4 ',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroklorür)InvitrogenD1306Nucleus floresan karşı boyama
Eşek Alexa-488 anti-tavşanInvitrogenA-21206İkincil antikor
Eşek Alexa-555 anti-sıçanAbcamab150154İkincil antikor
DPBS 10X, Kalsiyum ve MagnezyumGibco14200166çözelti seyreltmeleri ve yıkamaları için PBS. Deiyonize suda 1 kata seyreltin
Gömme kasetiFisher15-182-701D
ETDA vakum tüpüFisher02-685-2B
Etanol 200 geçirmezDecon2701
Köpük pedFisher22-222-012
Soğuk su balık derisinden jelatinSigma AldrichG7765
GFP antikoru (keçi)abcamab6673Birincil antikor
keçi IgG kontrolüVektör LaboratuvarlarıI-5000IgG kontrolü
Yüksek Yağlı DiyetHarlan TekladTD.88137
ImageJNIHBilgisayar programı https://imagej.nih.gov/ij/ 
LGALS3 antikoru (sıçan)Cedarlane CL8942APBirincil antikor
LSM700 konfokal mikroskopZeissKonfokal mikroskop
Mikroskop Slaytları, Superfrost PlusFisher12-550-15
Mikrotom bıçaklarıFisher30-538-35
Fare IgG kontrolüVektör LaboratuvarlarıI-2000IgG kontrolü
NIS elemanı görüntüleme yazılımıZ-stack görüntü alımı içinNikon
Normal At serumuSigma AldrichH1270
Pap PenFisher50-550-221
Fıstık yağıSigmaP2144
Altın Antifade mountantInvitrogenP36930Montaj ortamı 
Tavşan IgG kontrolüVektörLaboratuvarları I-1000IgG kontrolü
Sıçan IgG kontrolüVektörLaboratuvarları I-4000IgG kontrolü
RUNX2 antikoru (tavşan)Abcamab192256Primer Antikor
ŞırıngaBD3096281 ml şırınga
TamoksifenSigmaT5648
KsilenFisherX55K-4
Zen görüntüleme yazılımız-stack görüntü alımı içinZeiss
Görüntüleme yazılımı Imaging yazılımı

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. GBD DALYs and HALE Collaborators. Global, regional, and national disability-adjusted life-years (DALYs) for 315 diseases and injuries and healthy life expectancy (HALE), 1990-2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015. Lancet. 388 (10053), 1603-1658 (2016).
  2. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2018 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 137 (12), 67-92 (2018).
  3. Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nature Biotechnology. 32 (1), 40-51 (2014).
  4. Bhaskar, V., et al. Monoclonal antibodies targeting IL-1 beta reduce biomarkers of atherosclerosis in vitro and inhibit atherosclerotic plaque formation in Apolipoprotein E-deficient mice. Atherosclerosis. 216 (2), 313-320 (2011).
  5. Isoda, K., et al. Lack of interleukin-1 receptor antagonist modulates plaque composition in apolipoprotein E-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (6), 1068-1073 (2004).
  6. Kirii, H., et al. Lack of interleukin-1beta decreases the severity of atherosclerosis in ApoE-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 23 (4), 656-660 (2003).
  7. Gomez, D., et al. Interleukin-1β has atheroprotective effects in advanced atherosclerotic lesions of mice. Nature Medicine. 24, 1418-1429 (2018).
  8. Daugherty, A., et al. Recommendation on Design, Execution, and Reporting of Animal Atherosclerosis Studies: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 121 (6), 53-79 (2017).
  9. Baylis, R. A., Gomez, D., Owens, G. K. Shifting the Focus of Preclinical, Murine Atherosclerosis Studies From Prevention to Late-Stage Intervention. Circulation Research. 120 (5), 775-777 (2017).
  10. Kolodgie, F. D., et al. Pathologic assessment of the vulnerable human coronary plaque. Heart. 90 (12), 1385-1391 (2004).
  11. Virmani, R., Kolodgie, F. D., Burke, A. P., Farb, A., Schwartz, S. M. Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for atherosclerotic lesions. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 20 (5), 1262-1275 (2000).
  12. Gomez, D., Owens, G. K. Smooth muscle cell phenotypic switching in atherosclerosis. Cardiovascular Research. 95 (2), 156-164 (2012).
  13. Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiological Reviews. 84 (3), 767-801 (2004).
  14. Speer, M. Y., et al. Smooth muscle cells give rise to osteochondrogenic precursors and chondrocytes in calcifying arteries. Circulation Research. 104 (6), 733-741 (2009).
  15. Gomez, D., Shankman, L. S., Nguyen, A. T., Owens, G. K. Detection of histone modifications at specific gene loci in single cells in histological sections. Nature Methods. 10 (2), 171-177 (2013).
  16. Feil, S., et al. Transdifferentiation of vascular smooth muscle cells to macrophage-like cells during atherogenesis. Circulation Research. 115 (7), 662-667 (2014).
  17. Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nature Medicine. 21, 628(2015).
  18. Cherepanova, O. A., et al. Activation of the pluripotency factor OCT4 in smooth muscle cells is atheroprotective. Nature Medicine. 22, 657(2016).
  19. Albarran-Juarez, J., Kaur, H., Grimm, M., Offermanns, S., Wettschureck, N. Lineage tracing of cells involved in atherosclerosis. Atherosclerosis. 251, 445-453 (2016).
  20. Chappell, J., et al. Extensive Proliferation of a Subset of Differentiated, yet Plastic, Medial Vascular Smooth Muscle Cells Contributes to Neointimal Formation in Mouse Injury and Atherosclerosis Models. Circulation Research. 119 (12), 1313-1323 (2016).
  21. Newman, A. A., et al. Irradiation abolishes smooth muscle investment into vascular lesions in specific vascular beds. JCI Insight. 3 (15), (2018).
  22. Dobnikar, L., et al. Disease-relevant transcriptional signatures identified in individual smooth muscle cells from healthy mouse vessels. Nature Communications. 9 (1), 4567(2018).
  23. Misra, A., et al. Integrin beta3 regulates clonality and fate of smooth muscle-derived atherosclerotic plaque cells. Nature Communications. 9 (1), 2073(2018).
  24. Majesky, M. W., et al. Differentiated Smooth Muscle Cells Generate a Subpopulation of Resident Vascular Progenitor Cells in the Adventitia Regulated by Klf4. Circulation Research. 120 (2), 296-311 (2017).
  25. Herring, B. P., Hoggatt, A. M., Burlak, C., Offermanns, S. Previously differentiated medial vascular smooth muscle cells contribute to neointima formation following vascular injury. Vascular Cell. 6, 21(2014).
  26. Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Science Translational Medicine. 7 (308), (2015).
  27. Bentzon, J. F., Majesky, M. W. Lineage tracking of origin and fate of smooth muscle cells in atherosclerosis. Cardiovascular Research. 114 (4), 492-500 (2018).
  28. Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nature Medicine. 14 (1), 64-68 (2008).
  29. Mattson, D. L. Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice. American Journal of Hypertension. 14 (5), Pt 1 405-408 (2001).
  30. Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), 2408-2415 (2004).
  31. Durgin, B. G., et al. Smooth muscle cell-specific deletion of Col15a1 unexpectedly leads to impaired development of advanced atherosclerotic lesions. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (5), 943-958 (2017).
  32. Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness. Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).
  33. Lin, M. E., et al. Runx2 Deletion in Smooth muscle Cells Inhibits Vascular Osteochondrogenesis and Calcification but not Atherosclerotic Lesion Formation. Cardiovascular Research. , (2016).
  34. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving Bioscience Research Reporting: The ARRIVE Guidelines for Reporting Animal Research. PLoS Biology. 8 (6), 1000412(2010).
  35. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
  36. Nishioka, T., et al. Contribution of inadequate compensatory enlargement to development of human coronary artery stenosis: An in vivo intravascular ultrasound study. Journal of the American College of Cardiology. 27 (7), 1571-1576 (1996).
  37. Pasterkamp, G., et al. Paradoxical Arterial-Wall Shrinkage May Contribute to Luminal Narrowing of Human Atherosclerotic Femoral Arteries. Circulation. 91 (5), 1444-1449 (1995).
  38. Galkina, E., et al. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).
  39. Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. Quantitative analysis and characterization of atherosclerotic lesions in the murine aortic sinus. Journal of Visual Experiments. (82), 50933(2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Atherosclerotic Lesion AnalysisSmooth Muscle Cell LineageImmunofluorescent StainingConfocal MicroscopyBrachiocephalic Artery HarvestTissue Sectioning ProtocolSingle Cell CountingImageJ AnalysisIL 1 Beta InhibitionGalectin 3 Positive Cells

Related Articles