Kantitatif analiz düz kas hücre soy izleme farelerin gelişmiş aterosklerotik lezyonları içinde hücresel kompozisyon

Ateroskleroz morbidite ve mortalite dünya çapında koroner arter hastalığı, periferik arter hastalıkları ve felç çoğunluğu temel önde gelen nedenidir. Son aşama koroner ateroskleroz miyokardiyal bozma muhasebe Dünya nüfus ölüm^1,2yaklaşık % 16 gibi ciddi komplikasyonlara yol açabilir. Halk sağlığı üzerindeki yıkıcı etkisi nedeniyle, önemli çaba ateroskleroz ilerleme roman tedavi stratejileri geliştirmek için sürüş mekanizmaları deşifre etmek için yapılmış. Henüz, onay olasılığını (LOA) klinik kardiyovasküler hastalık için en düşük arasında sadece ben (%8,7 için faz) klinik diğer alanları ile karşılaştırıldığında³oranıdır. Bu açıklanabilir kısmen birçok engellerin tarafından o ateroskleroz, neredeyse her yerde doğa, klinik olarak sessiz ilerleme ve önemli hastalık heterojenite dahil olmak üzere etkili ilaç geliştirme için poz veriyor. Ayrıca, preklinik hayvan çalışmaları suboptimal tasarımını da klinik çeviri başarı eksikliği oluşturuyor. Özellikle, müdahale çalışmaları mümkün olduğunda tedavi stratejileri etkinliğini araştırmak uygulamak için gerekli olduğunu düşünüyoruz. Ayrıca, son aşama Aterosklerotik Lezyonu hücresel kompozisyon gelişmiş karakterizasyonu kader haritalama ve fenotipleme tarafından da dahil olmak üzere lezyon analizleri için standart yordamları gerçekleştirmek için kritik bir ihtiyaç vardır.

Ateroskleroz çalışmaları büyük çoğunluğu uyuşturucu tedavi veya gen manipülasyon (nakavt veya çakma) hastalık başlama ve ilerleme önce sağlıklı genç farelerde oluşan ateroskleroz önleme modellerinin odaklanmak. Bu çalışmalar, genler ve ateroskleroz gelişmede rol sinyal molekülleri çok sayıda ortaya çıkardı. Ancak, bu hedeflerin çoğunu insan etkili tedaviler için çevirmek başarısız oldu. Gerçekten de, bir terapi gelişmiş aterosklerotik lezyonları olan yaşlı hastalar için sağlıklı genç fareler üzerinde etkisini tahmin etmek zordur. Bu nedenle, müdahale çalışmaları preklinik deneysel boru hattı büyük olasılıkla uygulanması alaka düzeyini ve etkinliğinin yeni bir tedavi daha doğru bir tasviri sağlar. Fikri bir önleme^4,5,6 veya müdahale stratejisi⁷istihdam pro-inflamatuar sitokin İnterlökin-1β (IL-1β) inhibe çarpıcı farklı etkileri tarafından desteklenir. Önleme ve müdahale çalışmaları arasındaki farklar öneririz farklı hücresel süreçler farklı ateroskleroz geliştirme aşamalarında ortaya ve önleme çalışmaları muhtemel olduğu gerçeği vurgulamaktadır yetersiz klinik senaryo modellemek yeterli.

Amerikan Kalp Derneği son zamanlarda uygun deneysel tasarım, yordam standardizasyon, analiz ve hayvan ateroskleroz çalışmalar⁸/ raporlama için öneriler ayrıntılı bilimsel bir açıklama yayınladı. Faydaları ve kısıtlamaları baskın teknikleri alanında kullanılan vurgulamaktadır. Örneğin, aorta Sudan IV tr yüz boyama genellikle ilk okuma gerçekleştirilir. Lipid birikimi Sudan IV tr yüz boyama küresel plak yükünün değerlendirmesi için uygun bir yöntem olsa da, daha gelişmiş son aşama lezyon aşamasındaki yağlı çizgi lezyonlar ayırt edemiyor. Bu nedenle, tr yüz boyama yorumu kez belirsiz ve yüzeysel⁹' dur. Dikkatli analiz dokusunun kesitleri Miktar Endeksi lezyon istikrar ve morfolojik parametreleri gemi, lezyon ve Lümen boyutu kullanarak bir deneme etkisini daha doğru bir anlayış sağlar.

Son olarak, insan histopatoloji çalışmalarda hücresel kompozisyon rüptürü daha iyi bir tahmin boyutundan lezyon kendisi, düz kas hücreleri (SMC) içinde lezyonlar yoksul ve makrofajlar^{10rüptürü daha duyarlı olmak zengin olduğunu düşündürmektedir, 11}. Bu gözlemler klasik hücre kimliği için kullanılan işaretleri boyama dayalı idi (yani, SMC ve LGALS3 veya CD68 makrofajlar için ACTA2). Ancak, bu işaretleri ifade kesinlikle tek hücre türü için birden fazla soy SMC, endotel hücreleri ve myeloid hücrelerin¹²gibi plastisite nedeniyle aterosklerotik lezyonları içinde sınırlı değildir. Özellikle, SMC benzersiz tanımlaması Aterosklerotik Lezyonu içinde son on yıl kadar dedifferentiate ve soy özgü marker genleri (bir süreç denir bastırmak için bu hücre özelliği nedeniyle neredeyse imkansız fenotipik anahtarlama) yaralı ya da hastalıklı gemiler¹³' te. Bu sınırlama SMC tanımlama soy izleme^{7,14,15,16,17,18,} geliştirme tarafından hile ^{19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24}. o oluşmak-in kalıcı olarak etiketleme SMC ve onların döl onların kaderi ve fenotipik evrim ateroskleroz ilerleme sırasında SMC özel rehberleri tarafından tahrik Cre recombinase ifade kullanarak izlemek için (yani, Myh11^{7,15,17,18,19,20,21,22,23 , 24}, Acta2^25,26 ve, SM22α^14,16) ve [Bentzon ve Majesky gözden gazetecilere (örn, floresan proteinler, β-galaktozidaz) harekete geçirmek 2018²⁷]. Bir SMC soy izleme embriyogenez ayarı dışında istihdam ilk çalışmalar, SMC onların fenotip ve transdifferentiate chondrogenic hücrelere sırasında Vasküler kalsifikasyon kullanarak modüle ki kanıt Speer vd.¹⁴ sağlanan bir SM22α Cre R26R LacZ soy izleme modeli. Bu çalışmalar SMC soy izleme öncülük rağmen herhangi bir belirli olmayan SMC ifade SM22α hastalığın ortamda tarafından muhabir olarak etiketlenmiş olacak ki onlar kısmen belirsiz vardı. Bu sınırlama geliştirme ve kullanımı, Tamoksifen indüklenebilir Cre ERT/hücre etiketleme zamansal bir denetim erişimine izin verme LoxP tarafından baypas edilmiş. Sadece tamoxifen teslim sırasında oluşur ve izleme Cre içinde etkinleştirme alternatif hücre tiplerinin kaçınarak Cre ERT ifade tamoxifen pozlama, zaman sürüş hücre türüne özgü organizatörü ifade hücre sınırlı hücre etiketleme hastalığın ilerlemesini ayarlama. SMC ateroskleroz, floresan gazetecilere (eYFP^7,15,17,18 ile ilişkili tamoxifen indüklenebilir Myh11- Cre/ERT2 transgene içinde soy izleme için ^{, 21}, mTmG^19,25, klonal genişletme çalışmaları için konfeti^20,22,23 ) olağanüstü verimliliği ve özgüllük SMC etiketleme göstermiştir ve vardır Kader harita SMC nüfus son yıllarda yapılan çalışmalarda aterosklerotik lezyonları için kullanılmıştır. Önemlisi, bu çalışmalar bu açığa: 1) SMC % 80'i içinde aterosklerotik lezyonları yapmak gelişmiş değil ifade immunohistological analizinde kullanılan herhangi bir geleneksel SMC işaretleri (ACTA2, MYH11) ve bu nedenle soy izleme olmadan tanımlanmış ¹⁷; 2) SMC kümelerine işaretleri makrofaj işaretleri veya Mezenkimal Kök hücre işaretleri^16,17,19da dahil olmak üzere diğer hücre tiplerinin hızlı; ve 3) SMC yatırım ve Aterosklerotik Lezyonu oligokonal genişleme doldurmak ve SMC klonlar korumak plastisite geçiş phenotypically farklı popülasyonlar^20,23. Özetlemek gerekirse, bunu şimdi düz kas hücreleri bir dikkat çekici fenotipik çeşitlilik aterosklerotik lezyonlarının sunmak ve faydalı veya zararlı rol lezyon Patogenez onların fenotipik geçişler niteliğine bağlı olarak üzerinde olabilir açıktır. Bu keşifler SMC athero teşvik fenotipik geçişler son aşama ateroskleroz hedefleme için dikkate değer yeni bir tedavi cadde temsil eder.

Burada, biz hayvan diseksiyon, gömme, kesit, boyama ve brachiocephalic damar tutulumu miktar için sistematik yöntemleri de dahil olmak üzere son aşama fare aterosklerotik lezyonları analiz etmek için standart bir protokol öneriyoruz. İnterlökin-1β inhibisyon SMC kader ve fenotip üzerindeki etkisini belirlemek için SMC lineage ApoE^{- / -} fareler bir anti-IL1β antikor veya IgG izotip eşlemeli denetimin haftalık enjeksiyonları almadan önce 18 hafta boyunca Batı diyet beslenen izleme kullanılır.

Hayvancılık, işleme ve yordamlar Virginia Üniversitesi ve Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı Komitesi tarafından kabul edildi.

1. nesil SMC soy izleme fareler

1. Myh11- Cre/ERT2 erkek²⁸ doğurmak (Jackson laboratuvar; #019079) R26R-EYFP kadın ile (Jackson laboratuvar; #006148) Myh11- Cre/ERT2⁺ R26R-EYFP elde etmek için^{+/ +} erkekler.
2. Myh11- Cre/ERT2⁺ R26R-EYFP doğurmak^{+/ +} erkek ApoE^{- / -} dişi fareler ile (Jackson laboratuvar; #002052). Döl çapraz ve Genotipleme Myh11- Cre/ERT2⁺ R26R-EYFP tarafından seçin^{+/ +} ApoE^{- / -} erkek ve R26R-EYFP^{+ / +} ApoE^{- / -} dişi fareler son doğurmak olarak. Kuyrukları klip ve Genotipleme littermates üzerinde gerçekleştirin. Tüm erkek fareler-meli var olmak Myh11- Cre/ERT2⁺ R26R-EYFP^{+ / +} ApoE^{- / -} ve deneysel fareler (şekil 1A) kullanılabilir.
   Not: Genotipleme protokolleri Jackson laboratuvar Web sitesinde bulunabilir. Myh11 Cre/ERT2 transgene kadın kullanımı engellemek Y kromozom üzerinde yer alır. Diğer soy izleme sistemleri kullanılabilir ama bu sistemi en güvenilir soy izleme stratejisi kader harita SMC ateroskleroz için bugüne kadar.

2. düz kas hücre soy izleme fare diyet ve tedavileri

1. Erkek Myh11- Cre/ERT2⁺ R26R-EYFP var^{+/ +} ApoE^{- / -} fareler altı ila sekiz hafta-in yaş Myh11 kalıcı olarak etiketlemek için gelen bir dizi 1 mg tamoxifen enjeksiyonları almak⁺ SMC YFP ile ve onların kaderi (şekil 1 izlemek için A).
   1. 55 ° C'de ısı fıstık yağı
   2. Tamoxifen bir çözüm 10 mg/mL, hazırlamak ve 55 ° C'de tamoxifen tam dağılmasına kadar kuluçkaya Önceden ısıtılmış fıstık yağı ekleyin.
   3. 10 mg/mL tamoxifen çözüm 0.1 mL ile mayi iğne on iğne bir dizi için iki hafta içinde gerçekleştirmek.
      Not: Tamoxifen bir biohazard ve bakımı ile ele alınması gerekir.
2. 5-7 gün sonra son enjeksiyon ile tamoxifen, Gelişmiş aterosklerotik lezyonların geliştirme için izin vermek için 18 haftalık bir süre (örneğin, Batı diyet yağ dan kcal % 42; % 0,2 total kolesterol) yüksek yağlı diyet yemek diyet yerine hangi sürekli olarak aort, aortik kökü, brachiocephalic arter ve abdominal aorta da dahil olmak üzere birden çok damar yataklarında geliştirir.
3. 18 haftalık yüksek yağlı diyet beslenme, terapötik müdahale istenen süre (şekil 1B) başlar.
   Not: örnek olarak, bir anti-IL1β antikor veya IgG izotip eşlemeli denetim yüksek yağlı diyet 18 ve 26 hafta arasında bir haftalık mayi enjeksiyonlar yapılır.
4. 8-16 h önce plazma kolesterol ve trigliserid için doğru okumalar gerçekleştirmek için hasat doku için hızlı farelere gıda kaldırın.

3. hasat Brachiocephalic arter (BCA)

1. Hayvan ötenazi hayvan bakım ve kullanım Komitesi (ACUC) gereksinimleri ve yönetmeliklere uymalıdır. CO₂ boğulma approximatively 5 dakika tarafından deneysel fareler ötenazi ve ölüm tarafından ayak çimdik doğrulayın.
2. Fare tartmak ve kan toplamak.
   1. Fare tartmak
   2. % 70 ile fare ventral yan sprey etanol
   3. Kardiyak ponksiyon 1 mL şırınga ventrikül içinde göğüs boşluğu sol taraftan bağlı 25 G iğne ekleyerek gerçekleştirin. 0.1-1 mL kan toplanabilir.
   4. Şırınga temizlenerek bir EDTA vakum tüp kan aktarmak ve bir rock'çı veya rotator için 10-15 dk tüpü yerleştirin.
   5. Kan bir 1,5 mL tüp ve santrifüj 4 ° C'de 10 dakika 250 x g için transfer Dikkatli bir pipet ve yeterli ipuçları en iyi plazma faz çekilme ve yeni bir tüp aktarın. Kolesterol ve trigliserit ölçme öncesinde-20 ° C'de depolayın.
      Not: tam kan kan hücre sayımları ve sitokinler veya bağışıklık hücre profil oluşturma dahil olmak üzere diğer kan bileşenleri de dahil olmak üzere ek çalışmalar için kullanılabilir.
3. Bir kesik approximatively 2 cm orta Karin kullanarak cilt makas ve karın boşluğu ortaya çıkarmak için cilt çekin olun. Karın zarını göğüs kemiği olmadan zarar verme dokulara kadar kesti. Göğüs, kalp ve akciğer zarar vermemesi için dikkatli olmak ile orta aksiller satırında iki kesim yapmak.
4. Göğüs kemiği cımbız ile kaldırın ve kısmen kalp ortaya çıkarmak için diyafram kesti. Kalp kolayca erişilebilir değilse, Sağ atrium ulaşmak için göğüs kafesi yeterince Kes gitsin.
5. Fare ile bir yerçekimi perfüzyon sistemi (Şekil 2A) sıvı. Öyle ki perfüzyon sıvı basıncı ortalama fare kan basıncı (Şekil 2B) eşdeğerdir yerçekimi perfüzyon sistemi yükleyin. Bu sistem perfüzyon tutarlılık için izin verir ve her ikisi de gemi morfoloji ve floş kırmızı kan hücreleri korur.
   Not: başvuru olarak, fizyolojik bir tansiyon 120 mmHg (ortalama sistolik kan basıncı) ve 70 mmHg (ortalama diyastolik kan basıncı)^29,30C57Bl6 fareler var. Ortalama sistolik ve diyastolik kan basıncı ile fare genetik arka plan değişebilir.
   1. Bir 23 bağlanmak veya 25G yerçekimi perfüzyon sistemi için iğne kelebek ve fosfat tamponlu tuz (PBS) tüpler havadan kovmak için iğne çalıştırın. İğne sol ventrikül yerleştirin ve iğne yerde güvenli. Iris makas kullanarak, küçük bir insizyon attım (< 2 mm) içine Sağ atrium ya da artan aort olun.
   2. 5 mL ile de PBS, sonra 10 mL % 4 Paraformaldehyde (PFA) çözeltisi, sonra PBS ile 5 mL sıvı. PBS ve % 4 İngiltere'de yılın çözüm ortam sıcaklığında kullanın.
   3. Faiz (örneğin, karaciğer, akciğer, dalak) dokuların toplamak ve % 4 İngiltere'de yılın çözümde koyun.
6. BCA maruz
   1. Boyun bölgesi deri ve tükürük bezleri kaldırarak temizleyin.
   2. Bir kesme makası kullanarak ağız sapı Göğüs kafesine midline gerçekleştirin. Makas yakından göğüs kemiğinin altında bulunan damarlara zarar görmesini önlemek için göğüs kemiği arkasında yakın dikkat et. Her iki göğüs kafesi Forseps ile tam olarak göğüs boşluğunu açmak için çekin. Şahdamarı kısmen görünür olmalıdır.
   3. Kas ve bağ dokusu ve yağ iyi cımbızla doğru şahdamarına kadar brachiocephalic hastalığının çatallanma ve aort temizlenmiş ve bağ dokusu ve yağ (şekil çevreleyen izole arter kaldırarak temizle 2C).
7. BCA kaldırmak
   1. Forseps kullanarak, onun çatallanma aşağıda doğru karotis kapmak ve forseps (Şekil 2D) üzerinde ilk bir kesim yapın.
   2. Boyun arterine elinde hala, subklavyan arter ile ikinci bir kesme yapmak. Son iki aort brachiocephalic arter (Şekil 2D) her iki tarafında aracılığıyla kesikler.
   3. Diğer damar doku (örneğin, abdominal aort, aortik kök içeren kalp üstün parçası) ilgi toplamak.
   4. BCA ve diğer dokularda % 4 İngiltere'de yılın çözüm gecede, oda sıcaklığında yerleştirin.
      Not: Fiksasyon saat çalışma tutarlı tutulmalıdır.

4. doku işleme ve kesit

1. %4 PFA ve etiketli doku kaset (şekil 3A) yerde dokuyu. Kullanım köpük yastıkları doku sağlamak için kaset onun yönelimi ve kaset işleme adım (şekil 3B) aracılığıyla, siz bunu baþka korur. Kasetleri kapatın ve doku (24-72 s) işleme kadar % 70 etanol içinde bırakın.
   1. Histolojik ve immünfloresan aşağıdaki gibi (bir işlemci ile vakum nüfuz kullanarak rutin gece yordamı örneği) boyama için toplanan işlem BCA ve diğer doku: % 10 tarafsız arabelleğe alınmış formalin, ortam sıcaklığında (2 x), 30 dk için % 75 etanol 60 dk 30 ° c (1 x), % 90 etanol 60 dk 30 ° c (1 x), % 95 etanol 60 dk 30 ° c (1 x), % 100 etanol 60 dk 30 ° c (3 x), Ksilen 60 dk 30 ° c (3 x) ve parafin 80 dk 62 ° c (3 x) için için için için için.
2. BCA dikey olarak aort blok yüz (şekil 3C) yakın ile embed.
3. Parafin blok bir döner microtome (10 µm kalınlık) katıştırılmış doku erişene dek kesti.
4. Doku görünür olduğunda, bir bölümü konumu belirlemek için mikroskop altında incelemek. Aort hala görünmüyorsa, bir bölümü her zaman aralığında inceleyerek bir anda en fazla on 10 µm bölümleri kaldırın.
5. Aort yoluyla kesitli ve brachiocephalic arter görülür tamamen microtome blade dikey doku konumlandırmak için blok yönünü ayarlanır.
6. BCA 10 µm bölüm kalınlığı kes. Bu noktada, tüm bölümleri slayt başına üç bölümlü seri olarak toplanır. Subklavyan bifurkasyon (şekil 3D) erişene dek toplamak.
   Not: Sonraki z-yığın confocal resim alma ve tek hücre sayımı için 10 µm bölüm kalınlığı, BCA kesmek önemlidir. Bu kalınlık Derneği arasında tek bir çekirdek ve sitoplazmik veya yine de kesit derinliğini boyama membran titiz ve sigara cofounding değerlendirmesine olanak sağlar.

5. immünfloresan boyama

Not: Aterosklerotik lezyonları tam bir karakterizasyonu morfolojik parametreleri değerlendirilmesi ve plak veya istikrarsızlık ve mevcut Protokolü odak olmayacaktır hücresel kompozisyon dizinleri içerir. Lezyon Morfoloji, kollajen içerik ve intraplaque kanama Movat^7,17, PicroSirius kırmızı ^7,31, Ter119 boyama ^7,18, sırasıyla analiz edilebilir. Burada, lezyonlar hücresel bileşimi analiz etmek için iletişim kuralı anlatacağım.

1. Aşağıdaki çözümlerden bir kimyasal başlık altında oda sıcaklığında slaytları kuluçkaya: Ksilen 5 dk (2 x), 5 min (2 x) için % 100 etanol, 5 min (2 x) için % 95 etanol, 5 min (2 x) ve deiyonize H2O için % 70 etanol (diH₂O) 5 min (2 x) için.
2. Antijen alma çözüm üreticinin yönerge göre slaytları kuluçkaya.
   1. Sitrik asit ile antijen maskesinin çözüm tabanlı (bkz. Tablo malzeme), bir boyama rezervuar ve dolgu slaytlara üst hazır antijen alma çözümü ile çözüm diH₂O. yer 320 ml 3 mL seyreltik.
   2. Herhangi bir boş yuva slayt rafa bile Isıtma sağlamak için boş slaytlar ile doldurun. Antijen alma çözüm buharlaşma kaynamaya izin vermek için bir kapak ile konteyner kapağı.
   3. Bir mikrodalga fırında yaklaşık 675-700 Watt 20 dk slaytları ısı. Kontrol düzenli olarak slaytlar ve yerine buharlaşan sıvı ile öyle ki bölümleri kalır diH₂O maskesinin çözümde her zaman sular altında.
   4. Slaytlar, oda sıcaklığında 1 h için çözüm soğumasını sağlar.
3. 6 g balık cilt jelatin (FSG) 1 litre PBS çözülür. PBS/FSG arabellek yıkama olarak kullanılır. PBS/FSG % 10 normal serum engelleme çözeltisi hazırlamak.
   Not: Balık cilt jelatin engelleme arabellek hazırlanmasında kullanılır. FSG memeli antikorlar ile cross-react serum proteinleri arka plan gürültü en aza indirerek içermiyor. Ancak, FSG endojen biotin içerir gibi diğer engelleme seçeneğini biotin algılama sistemleri ile tercih edilmelidir. Normal serum kullanılan türü kullanılan ikincil antikor üzerinde temel alır. Eşek ikincil antikorlar kullanıldığında, normal at serum engelleme ve antikor dilutions için seçilmelidir.
4. PBS slaytları, oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. Daire doku bölümleri ile hidrofobik bir kalem. Engelleme arabellek için 1S oda sıcaklığında PBS/FSG/normal serum bölümlerle kapsar. Süre belgili tanımlık doku engelleme PBS/FSG/normal serum birincil antikor çözümde bu adımı sırasında hazır olun.
5. Gecede 4 ° C'de bir nem odasında PBS/FSG/normal Serumda seyreltilmiş birincil antikorlar ile kuluçkaya. Bir bölüm başına slayt IgG denetim antikorlar denetlemek için birincil antikor özgüllük için birincil antikor olarak aynı konsantrasyon, bir karışımı ile inkübe.
6. Slaytları aşağıdaki gibi oda sıcaklığında yıkama: PBS/FSG 5 min (3 x), o zaman PBS için 5 dk (1 x) için.
7. İkincil antikorlar fluorophore Birleşik ( Tablo malzemelerigörmek) ve diamidino-2-phenylindole (DAPI) ile oda sıcaklığında 1 h için PBS/FSG/normal Serumda seyreltilmiş çekirdeği counterstaining için kuluçkaya. Slaytlar ışıktan korumak.
8. Slaytlar 5.6 adımda anlatıldığı gibi yıkayın.
9. Montaj medya floresan için uygun kullanarak slaytları mount ( Tablo malzemelerigörmek).

6. confocal mikroskobu

Not: Bir confocal mikroskop ve z-yığın edinme kullanımı tek hücre sayım için önemlidir.

1. Set çalışma kullanılmak üzere satın alma Parametreler: görüntü çözünürlük (1024 x 1024 veya 2048 x 2048 piksel); Optik yol ve ikincil antikorlar seçili arada bir fonksiyonu olan kanal sayısı; tarama hızı (önerilen tarama hızı: 7-8); ve fark girişim kontrast (DIC) kanal.
2. Birincil antikorlar ve IgG denetim ile lekeli bölümleri kullanarak, Dedektör hassasiyeti, lazer güç ve ofset bireysel her kanal için ayarlayın. IgG denetimin arka plan sinyal en aza indirmek için kullanılır.
3. Üst ve alt pozisyonlar z-yığın edinme için ayarlayın. Kazanmakla kalınlığı ve elde etmek için yığın sayısından. Bu parametreleri çalışma tutarlı kalması gerekir.
   Not: 1 µm kalınlık görüntüleme 8-10 yığınları önerilir. Çalışma yansıma yığın sayısından tutarlı kalmak.
4. Görüntü doku bölümleri birincil antikorlar IgG için ve denetim DIC de dahil olmak üzere tüm kanallar ile lekeli.
5. En az bir görüntü ile bir ölçek çubuğu tek hücre sayımı sırasında görüntü kalibrasyonu için etiket.

7. tek hücre sayımı

1. Yükleyin ve ImageJ açın. Gerekirse, eklentileri bölümünde indir indir > giriş/çıkış ImageJ Web görüntü dosyasını açmak için üretilen confocal mikroskop tarafından oluşturulan görüntüler ve biçiminin bağlı olarak.
2. Belgili tanımlık imge eğe ImageJ içinde açın.
3. 6,6içinde oluşturulan görüntü kullanarak bar başvuru ölçekli görüntü kalibre.
4. Bölge içinde tek hücre sayımı DIC kanal (şekil 4) kullanarak gerçekleştirilecek ilgi betimlemek.
   Not: Bir bölge bir anda belirlenen. Deneysel soruluk bağlı olarak, tek hücre sayımı tüm lezyon alanında gerçekleştirilebilir (bkz: 7.3.1) ve/veya lezyon bölge içinde. Hücresel kompozisyonunu lezyon rüptürü eğilimi önemli bir dizin olduğundan, soruşturma fibröz kap çevrenin ( 7.3.2bakınız) özellikle uygundur.
   1. Lezyon alan Lümen sınır (şekil 4A; beyaz ok) ve iç elastik lamina (şekil 4A; sarı ok) görünür DIC görüntüde takip ederek betimlemek.
   2. Fibröz kap çevrenin analizi, Lümen den 30 µm uzak sınır belirlemek ve kenarlığı ( şekil 4B-D) izleyin.
      Not: Fibröz kap alan klasik ACTA2 + hücreler ve Lümen (şekil 4B) underlaying kollajen zenginleştirilmiş bölge olarak tanımlanır. ACTA2 + hücre ve kollajen zenginleştirme lezyon istikrardır kritik bir rol oynamaktadır. Önceki çalışmalarda belirlenen ACTA2 + hücre zengin lifli kap alan SMC-lineage Lümen den 30 µm kalınlığında Ortalamalar izleme ApoE^{- / -} fareler 18-26 hafta (şekil 4C) için yüksek yağlı diyet beslenir. Böylece, titiz karakterizasyonu genetik manipülasyon veya fibröz kap alan hücresel kompozisyon farmakolojik tedavi etkileri son derece uygundur.
5. Kanalları araçlar panelini açın (Görüntü > renk > Kanal araçları) ve sözde rengi farklı boyama kanalları (şekil 5A; kutusu 1).
6. Renk kanalları birleştirme (Görüntü > renk > birleştirme renkleri) (şekil 5A; kutusu 2). Tüm kanallar aynı görüntü (şekil 5B) görünür olmalıdır. Tek tek renk kanallarına (şekil 5A; kutusu 1) Kanal araçlar panelini kullanarak etkinleştirebilir veya devre dışı.
7. Sayma aracı ayarlayın.
   1. Araç çubuğunda sayım simgesine sağ tıklayın (şekil 5C; kutusu 1) ve Çok noktalı aracınıseçin.
   2. (Şekil 5C; kutu 2) Noktası aracı panelini açmak için aynı simgesine çift tıklayın.
   3. Hücreleri saymak için kullanılan öğelerin boyutunu ve türünü seçin.
   4. Göstermek tümkontrol edin.
8. DAPI kanal Kanal araçlar panelinde sadece açın ve sayaç kanal 0 (şekil 5C; kutusu 3) seçin. Tıklatın öğesini olabilir bireysel çekirdeği üzerinde (örneğin, Sarı noktalar şekil 5C-D). Tüm çekirdeklerin faiz bölgede lekeli saymak için z-yığınlar ilerleyin. Olay sayısı sayacı kanal Noktası aracı panelinde (şekil 5C; kutusu 4) aşağıda belirtilen.
9. Başka bir boyama kanalı aç (örneğin, eYFP boyama). Sayaç Kanal 1'i seçin. Bir colocalization DAPI ve boyama arasında olduğu hücreler'i tıklatın. Sitoplazmik boyama, boyama ile select hücreleri çevreleyen çekirdeği tüm derinlik üzerinde çekirdek (birkaç z-yığınlar kontrol edin).
10. Kombinasyonları boyama ve hücre popülasyonlarının ilgi saymak için yeni sayaç kanalları seçme değiştirerek yineleyin. Her nokta rengi farklı hücre nüfus (şekil 5D) temsil eder. Sonuç hücreleri DAPI toplam sayısı veya bölge alanına hücre sayısı olarak ifade edilebilir.

Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe- / - fareler altı ve sekiz hafta-in yaş yüksek yağlı diyet beslenen ediliyor önce arasında tamoxifen ile enjekte. 18 haftalık yüksek yağlı diyet beslenme, sekiz fareler iki grup haftalık bir fare monoklonal anti-IL-1β antikor veya 10 mg/kg 8 hafta (şekil 1)7için izotip eşlemeli IgG denetimi ile tedavi edildi. Fare feda etti ve % 4 PFA-PBS Çözümle periosteum. Brachiocephalic arterler disseke, işlenen ve (Şekil 2 ve şekil 3) açıklandığı gibi kesitli.

İmmünfloresan soy izleme gazeteci (YFP) ve fenotipik işaretleri (ACTA2, LGALS3, RUNX2), hedefleme antikorlar ile BCA, 8-10 µm kalınlığında boyama sonra kesit görüntüsü confocal bir mikroskop kullanarak. Her bireysel boyama, DAPI (nükleer boyama) ve DIC görüntüleri elde. Tek hücre (lezyon, fibröz kap) sayım için ilgi bölgeleri tarif DIC görüntüleri (şekil 4) kullanarak gerçekleştirildi. Tek hücre farklı SMC elde edilen nüfus çokluğu belirlemek için sayma ImageJ (şekil 5) kullanılarak gerçekleştirildi.

Biz iki temsilcisi immünfloresan boyama ve hücresel kompozisyon gelişmiş aterosklerotik lezyonları tarihinde IL-1β inhibisyon etkisini değerlendirirken tek sayma mevcut. İlk, boyama SMC soy izleme gazeteci YFP, SMC işaret ACTA2 ve LGALS3 makrofaj işaretleyicisinde kesitleri BCA (480 µm ve aort üzerinden 780 µm) iki farklı yerlerde yapıldı (şekil 6). Bu kesit fibröz kap bölgesinin tek hücre sayım çözümleme yapılır ve dikkate değer farklılıklar arasında anti-IL-1β antikor ile tedavi fareler fibröz kap çevrenin hücresel bileşiminde bulunmuştur ve fareler tedavi ile IgG kontrol (şekil 6A) izotip eşlemeli. IL-1β inhibisyonu YFP + SMC bir düşüş ve LGALS3 + hücreler (şekil 6B) bir artış ile ilişkili idi. SMC nüfus fenotipleri ile ilgili YFP + ACTA2 + SMC bir azalma gözlenen, oysa SMC kaynaklı makrofajlar göreli sayısı (YFP + LGALS3 +) her iki BCA yerlerde (şekil 6C) önemli ölçüde arttı.

Son olarak, biz IL-1β inhibisyon SMC fenotipik geçiş chondrogenic hücreleri üzerindeki etkisini araştırdık. Fenotipik bu geçiş bir Vasküler kalsifikasyon önemli sürücü, son aşama ateroskleroz14,32,33önemli özelliği var. BCA kesit lekeli SMC soy izleme gazeteci YFP, osteochondrogenic işaret RUNX2 ve makrofaj işaret LGALS3 (Şekil 7A). Bereket ve RUNX2 + chondrogenic hücreleri kökeni iki deneysel gruplarımız lezyon alanında içinde karakterize. IL-1β inhibisyonu genel sayısını RUNX2 + hücrelerde lezyon, ne de SMC elde edilen oranda etkisi bulduk (YFP + RUNX2 +) ve makrofaj kaynaklı (YFP-LGALS3 + RUNX2 +) chondrogenic hücreleri (Şekil 7B).

Resim 1 : Müdahale çalışmalarda düz kas hücre soy izleme fareler. (A) Myh11- Cre/ERT2 R26R şematik gösterimi-EYFP Apoe- / - tamoxifen indüklenebilir SMC belirli soy izleme fare modeli. Tamoxifen ile tedavi R26R-YFP odağı rekombinasyon ve bir kodonu eksizyon ve YFP SMC tarafından kalıcı ifadesi indükler. (B) şematik müdahale çalışmaları hangi Myh11- Cre/ERT2 içinde R26R-EYFP Apoe- / - fareler beslenen bir Batı diyet 18 hafta haftalık IL-1β antikor veya bir izotip eşlemeli IgG denetim antikor, 10 mg bir konsantrasyon ile enjekte edildi için / 8 hafta boyunca kg. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 : Brachiocephalic arter diseksiyonu. (A)şeması perfüzyon sistemi tahrikli bir ağırlık. Sistem ortalama sistolik kan basıncı farelerde yakın bir basınçta perfüzyon izin kesin bir yükseklikte ayarlanır. Sıvı yüksekliği h arasında perfüzyon sırasında kullanılan basınç biraz ses yüksekliği ile farklı olmadığı sürece1 ve h2. (B) denklemi statik sıvıların basıncı ve perfüzyon C57Bl6 fare ortalama sistolik kan basıncı için eşit basınç ulaşmaya yüksekliğini belirlenmesi. (C) resimler proksimal aort ve C57Bl6 fare yemek diyet (sol resim) beslenir ve Apoe- / - fare dallanma arterlerde 26 hafta (doğru resmi) yüksek yağlı diyet beslenen. Yıldız işareti aterosklerotik lezyonların varlığı gösterir. Proksimal aort ve dallanma arterler (D) şeması. Kırmızı oklar cuts sağ karotis yalıtım için temsil ve brachiocephalic arter yalıtım ve numaraları kesikler sırasını gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3 : Doku işleme, katıştırma ve kesit. (A)fotoğrafı ile BCA doku gömme bir kaset. BCA bir köpük yastık üzerinde konumlandırılmış. (B) Zoom-in belgili tanımlık Köpük yastık üzerinde konumlandırılmış BCA. BCA aort kaset ve dikey olarak doğruldu karotis etiket parçası yakın ile aydınlatmaktadır. Ölçek çubuğu: 1 cm. (C) şeması parafin blok brachiocephalic arter gömme sonra. (D) şeması aort mesafe göstergesi ile 10 µm kalınlığında seri bölümleri ile seri slaytların. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4 : Aterosklerotik Lezyonu ve fibröz kap alanı tarif. (A) DIC temsilcisi Filmler aterosklerotik lezyon üzerinden Myh11- Cre/ERT2 R26R brachiocephalic arter kesit görüntü-EYFP Apoe- / -. Luminal ve iç elastik lamina Kenarlıklar yanında beyaz yerelleştirilmiştir ve okları, sırasıyla sarı (sol kapı aynası). Lezyon alan bir Kesikli çizgi (doğru kapı aynası) ölçek çubuğu tarafından belirlendi: 100 µm. (B) temsilcisi Filmler DIC ve ACTA2 boyama. Çift kafalı oklar underlaying fibröz kap alanı tanımlar Lümen alanı içinde boyama ACTA2 kalınlığını gösterir. (C) miktar+ ışık ACTA2, Myh11- Cre/ERT2 R26R içinde kalınlık-EYFP Apoe- / - 18, 21 ve 26 hafta boyunca yüksek yağlı diyet beslenen. Bu zorlanma fare kullanarak, fibröz kap önceden aterosklerotik lezyonlarının 25-30 µm ortalama kalınlığı vardır. Sonuçları ortalama ± SEM ifade edilen tek hücre sayımı için sabit bir 30 µm kalınlığında fibröz kap alanı (D) tarif. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5 : ImageJ kullanarak tek hücre sayımı. Ekran tek hücre ImageJ ile confocal mikroskobu tarafından alınan görüntüleri sayma gösteren önemli adımlar yakalar. (Her bireysel boyamaA) kanal ve bireysel z-yığın görünür görüntünün altında c: ve z: barlarda kaydırarak. Staining kanalları sözde renkli kanal (1) Masası Staining kanalları (YFP, LGALS3, ACTA2, DAPI nükleer boyama için ve DIC) (2) kanalını Birleştir panelini kullanarak birleştirilir. (B) kanal YFP, LGALS3, ACTA2, DAPI ve DIC için birleştirme sonuçlarını. (C) çekirdeği DAPI sayım simgesini (1) ve (2) noktası aracı panelini kullanarak boyama üzerinde temel sayma. Farklı sayaç kanal her hücre popülasyon (3) için kullanılır. Sayılan olay sayısı sayacı kanal (4) altında gösterilir. Beyaz dikdörtgen: bölge sağ tarafta genişlemiş. (D) tek hücre fibröz kap alanı (kesik çizgi) içinde DAPI (sarı nokta), YFP+ hücreleri (kırmızı nokta), YFP-LGALS3 de dahil olmak üzere birden çok hücre popülasyonlarının için sayma temsili görüntüsünü+ hücreleri (camgöbeği nokta), YFP+LGALS3+ hücreleri (turuncu nokta), YFP+ACTA2+ hücreleri (yeşil nokta) ve YFP-ACTA2+ hücreleri (koyu mavi noktalar). Beyaz dikdörtgen: bölge sağ tarafta genişlemiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 6 : IL-1β inhibisyon fibröz kap alan iki ayrı BCA yerlerde Apoe/fare izleme SMC soyundan hücresel bileşimi etkileri karakterizasyonu. (A)BCA aort ile IL-1β antikor tedavi fareler üzerinden gelen bölümleri 480 µm ve 780 µm çapraz veya şekil 1 ' de gösterildiği gibi IgG denetim için YFP, LGALS3, lekeli ve DAPI (nükleer boyama) ve bölüm tarafından DIC görüntüsü. İmmünfloresan kanalları birleştirilmiş (yukarıdan aşağıya doğru kapı aynası). Kesik çizgiler fibröz kap bölgeleri betimlemek. Ölçek çubukları: IL-1β inhibisyonu YFP+ hücreleri önemli bir azalma ve LGALS3 bir artış ile ilişkili olduğunu ortaya koymaktadır sayım 100 µm. (B) tek bir hücre+ hücreleri fibröz kap alanı içinde. YFP içinde C)+ hücre nüfus, bir düşüş YFP+ACTA2+ ve YFP+LGALS3+ bir artış gözlenen nüfus. Sonuçları ortalama ± SEM istatistiksel analiz dile getirdi: birden çok t-Testi unpaired. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 7 : IL-1β etkisi RUNX2 + chondrogenic sayısına hücreleri ile gelişmiş aterosklerotik lezyonları. A) BCA kesitleri lekeli YFP, LGALS3, RUNX2 ve (nükleer boyama) DAPI için ve tüm kanallar birleştirildi (alt paneller). Kesik çizgiler lezyon alan betimlemek. Ölçek çubukları: 100 µm. B) tek hücre sayımı gösterir IL-1β inhibisyonu RUNX2 toplam sayısı etki etmez+ hücreleri içinde lezyon ne de RUNX2 oranı+ hücreleri SMC arterin (YFP+RUNX2+; YFP+LGALS3+RUNX2+) ve myeloid kökenli (YFP-LGALS3+RUNX2+). Sonuçları kötü SEM istatistiksel analiz olarak dile getirdi: birden çok t-Testi Unpaired. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Yazarlar ifşa gerek yok.