Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Akış sitometrik ölçüm makrofajlar FcγR Cross-linking yanıt ROS üretim

15.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/59167

⸱

7 Mart 2019

 , 
1Division of Immunity and Pathogenesis, Burnett School of Biomedical Sciences, University of Central Florida

Bu makalede

Özet

Bu çalışmada FcγR etkinleştirilmesinden kaynaklanan Reaktif oksijen türleri (ROS) üretim algılamak için Akış Sitometresi kullanımını gösterir. Bu yöntem değişiklikleri antimikrobiyal ve fagositler yanıt bağışıklık kompleksleri, opsonized mikroorganizmalar veya doğrudan FcγR cross-linking fonksiyonlu Redoks değerlendirmek için kullanılabilir.

Özet

Oksidatif veya solunum aşırı oksijen tüketiminin hızlı ve Reaktif oksijen türlerine (ROS) nesil açıklamak için çeşitli bağışıklık uyaranlara yanıt olarak fagositler tarafından kullanılır. ROS bağışıklık etkinleştirme sırasında oluşturulan aracılığıyla öncelikle ROS yeteneklerini DNA ve proteinler, zarar vermek için güçlü antimikrobiyal aktivitesi mikroorganizmaların ölümüne neden olan uygular. ROS üretim tekrarlanarak ve kolaylıkla ölçmek için güçlü olmak çeşitli yollar ve bu konak savunma mekanizmasının moleküllerine katkısını değerlendirmek için gereklidir. Bu kağıt, floresan problar kullanımını gösteren ve Akış Sitometresi ROS üretim algılamak için. Her ne kadar yaygın olarak kullanılan, ROS floresan ölçümü rootkitler, özel ve değil mitogenic uyaranlara tarafından indüklenen ROS ölçümü açısından özellikle problemlidir. Biz makrofaj üretimi, astar, Boyama, FcγR cross-linking ve akış sitometrik çözümlemesi ile biten başlayarak belirli FcγR uyarılması sonucu olarak oluşturulan ROS algılamak için detaylı bir metodoloji mevcut.

Giriş

Reaktif oksijen türleri (ROS) reaktif molekülleri veya serbest radikallerin yan ürünleri ( 1' de gözden) Aerobik solunum vardır. Bunlar, süperoksit anyon, peroksit, hidrojen peroksit, radikal hidroksil ve hidroksil iyonları, diğerleri arasında içerir. Normal fizyolojik şartlarda ROS esas olarak mitokondri ve Nikotinamid adenin dinükleotit fosfat (NADPH) oxidases tarafından üretilen ve çeşitli enzimler ve protein süperoksit dismutaz ve glutatyon gibi hızla detoxified. ROS veya ROS çıkarılması yeteneğini bir üründe abartılı bir üretim oksidatif stres, mademki proteinler, lipidler ve hücresel stres ya da ölüm ve patolojik hastalık durumlarında yol DNA hasar Reaktif oksijen türleri teşvik neden olabilir. Ancak, bu şu anda ROS de sinyal molekülleri (redoks sinyal) hareket edebilir ve çeşitli moleküller ve yolu ara ürün ROS-aracılı değişiklik etkileyebilir hücresel metabolizma, nükleer silahların yayılmasına karşı hayatta kalma, inflamatuar beğeni topluyor sinyalizasyon ve2yaşlanma. Fagositik hücreleri, ROS antimikrobiyal aktivite sırasında sözde "solunum patlama"1,3,4,5,6sağlayan önemli bir rol oynar. Dış uyaranlara karşı fagositler tepki sırasında NADPH oksidaz karmaşık (p40phox, p47phox, p67phox) bileşenlerinin sitozol gp91phox ve p22phox içeren phagosomal membran translocate alt birimleri, ve Rac1/2 eylemleri ile birlikte, bir tam işlevsel NADPH oksidaz enzimi karmaşık form. Birleştirilmiş NADPH oksidaz sonra NADPH oksijen süperoksit phagosomal çarpıtması içinde azaltmak için kullanır. Süperoksit anyon doğrudan zarar verebilir ya da hidrojen peroksit dismutated. Süperoksit ve hidrojen peroksit büyük ölçüde reaktif hidroksil radikalleri oluşturmak için diğer molekülleri ile tepki verebilir. Hasar bu ROS proteinler kümelerde demir-kükürt ile reaksiyon veya sonuçta kısıtlı mikrobiyal metabolizma veya mikrop5ölüm önde gelen DNA'ın temel oksidasyon neden aracılık ettiği. ROS esnasında solunum patlamış üretilen ve NADPH oksidaz enzimi karmaşık önemi resimli klinik hastalarda kronik Granulomatous hastalığı (ÇGD)7,8,9, 10. CGD olan bireyler sahip gp91phox, mutasyonların ROS üretim ve bakteri ve mantarlar genellikle immün bireyler ile bir endişe olmayan tekrarlayan enfeksiyonlara yatkınlık eksikliği sonuçlanan. Bu nedenle, oksidatif stres, Redoks Sinyal veya ana savunma, varlık ölçmek mümkün eğitim ROS üretim gerçek zamanlı olarak yararlı bir çaba olup.

Tedbir ROS üretim veya oksidatif stres11,12,13sonuçlarını birden çok testleri kullanılmıştır. Bunlar arasında en çok kullanılan biridir floresan sonda 2', 7' dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH2-DA)14. Bu renksiz ve lipofilik moleküldür. DCFH2-DA hücre zarı arasında Difüzyon hücre içi esterazlar tarafından üzerine hareket hangi hücre geçirimsiz işleme DCFH2, deacetylates sağlar. ROS (hidrojen peroksit, peroxynitrite, hidroksil radikalleri, nitrik oksit ve peroxy radikaller) DCFH2 üzerinde birden çok türde eylemler floresan olan DCF okside (Ex bildirilen / Em: 485-500 nm/515-530 nm) ve bir akış kullanarak tespit edilebilir sitometresi floresein (FL1 kanal) için ayarla Standart filtre ile donatılmıştır. Süperoksit şiddetle DCFH2 ile cevap vermiyor ama floresan ürün 2-hydroxyethidium (yanı sıra diğer floresan süperoksit bağımsız oksidasyon ürünleri)15verim için başka bir sonda dihydroethidium ile (DHE) tepki verebilir. DHE oksidasyon floresan ürünlerin bir uyarma dalga boyu 518 kullanarak tespit edilebilir nm ve emisyon dalga boyu 605 nm (FL2 kanal). Bu sondalar ROS algılanması için kullanımı gerektirir onların sınırlamalar bilgi ve yordamlar ve denetimleri geçerli olması için gerçekleştirilen özel tahlil içine deneysel boyama dikkatli ana kullanmak nispeten basit olmasına rağmen sonuçları ve sonuçlara. Aşağıdaki iletişim kuralı tarafından Akış Sitometresi ROS ölçmek için tasarlanmış bu 2 probları istihdam bir ticari olarak mevcut kit kullanımı gösterilmiştir. Bu sonda ile astarlanmış kemik iliği türevi makrofajlar leke ve FcγR cross-linking aracılığıyla ROS üretim teşvik. Bu iletişim kuralı kullanılarak elde temsilcisi verileri sunmak ve başarılı deneme için üstlenilen uygun önlemler stres.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

İletişim kuralı işleme hayvan için kurumsal hayvan bakım ve kullanım komite Central Florida Üniversitesi tarafından (IACUC) kabul edildi.

1. kemik iliği nesil makrofajlar (BMDMs) türetilmiş

  1. Kültür medyası hazırlama
    1. D10F temel ortam hazırlamak: Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM için), % 10 ısı inaktive fetal sığır serum (FBS), 1 mM sodyum pyruvate, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES) ve 0.05 mM β-mercaptoethanol ekleyin.
      Not: her ne kadar taze D10F medya kullanmak en iyisidir, D10F temel medya kadar iki hafta önceden birden çok deneyler için bir hafta içinde kullanılmak üzere hazırlanabilir. Bir fare için gerekli (25 kemikleri temizlemek için mL) ve makrofaj farklılaşma medya yapmak için 150 mL yaklaşık 175 mL D10F temel medya olduğunu
    2. LADMAC büyüme ortamı hazırlamak: kartal için en az gerekli orta (EMEM), Ekle % 10 ısı inaktive FBS ve 2 mM L-glutamin. Medya taze, kültürler başlatmak için planladığınız günde hazır olun.
      Not: Bir litre LADMAC büyüme ortamının yaklaşık (19) 50 mL aliquots LADMAC klimalı ortam içinde sonuçlanır.
    3. Tam DMEM ortam hazırlamak: DMEM için % 10 ısı inaktive FBS ve 1 eklemek x antibiyotik Antimycotic. Medya taze BMDMs hasat günü hazırla.
      Not: bir fare için yaklaşık 100 mL DMEM tam ortam gerekli olacaktır. Bu hücreleri priming için kullanılan ortam içerir.
  2. LADMAC klimalı orta hazırlanması
    1. Confluency 10 mL LADMAC büyüme ortamının (1.1.2 içinde tanımlanan) kullanarak bir 10 cm tabak için LADMAC hücrelerin büyümesine. Hücreleri 37 ° C, % 5, kuluçkaya CO2.
    2. Confluency hücre hücrenin üzerine zorla medya dağıtımı tarafından bağlantısını kesin. Müstakil hücre 1 mL 100 mL LADMAC büyüme ortamının içeren T-175 şişeler ekleyerek geçiş hücreleri. Kuluçkaya hücreleri tamamen Konfluent kadar 37 ° c, % 5 CO2 (yaklaşık bir hafta). Bu şekilde, bir 10 cm çanak on T-175 şişe veya klimalı ortam yaklaşık 1 litre yol açabilir.
    3. Sonra hücreleri hazır, klimalı ortam ve santrifüj 350 x g istenmeyen hücrelerin cips 5 min için de toplamak. Toplanan supernatants 0.2 mm filtre ile filtre ve 50 mL aliquots-80 ° C'de depolayın Aliquots LADMAC klimalı ortam-80 ° C'de etkinliği en az kayıp ile aylarca tutulabilir.
      Not: büyük deneyler beklenen, medya LADMAC klimalı büyük toplu işlemleri tutarlılığı sağlamak için aynı zamanda hazırlamanız. Bu mümkün değilse, aynı toplu iş veya LADMAC klimalı ortam her deneme için çok türetilen aliquots kullanın.
  3. Kemik iliği hazırlanması makrofajlar türetilmiş
    1. Deneme günü, önceden hazırlanmış D10F medya (1 Bölüm şartına LADMAC medya 3 parçaya D10F) içine şartına LADMAC medya % 25'i ekleyerek taze makrofaj farklılaşma ortam hazırlamak. Bu medya önceden hazırlamak! Sadece BMDM kültür için gerektiği gibi kadar ortam hazırlamak.
    2. Gün 1: izole fare kemik iliği hücreleri kemik iliği kalça ve D10F temel medya kullanarak yırtılmalarıteşhis temizlemek için bir değişiklik ile yukarıda açıklanan protokol16 göre. D10F medya 2.5 mL (4) kemikleri her iki ucuna temizlemek için kullanın. Floş kemik iliği hücreleri doğrudan bir önceden ıslak 40 mm hücre süzgeç üstünde tepe-in 50 mL tüp yerleştirilir. Diğer medya (~ 5 mL) hücre süzgeç durulama için kullanılabilir.
    3. 350 x g 5 dk. atma için toplanan kemik iliği hücreleri süpernatant santrifüj kapasitesi ve makrofaj farklılaşma medya (fare) başına 30 mL toplamda hücrelerde resuspend.
    4. Hazırlamak ve (6) 10 cm steril Petri yemekler etiket. Plaka makrofaj farklılaşma medya her Petri çanak içine içine 5 mL. Makrofaj farklılaşma medya her Petri çanak çanak başına 10 mL toplam hacmi için içine resuspended kemik iliği hücrelerinin aliquot 5 mL. 37 ° C, % 5, 5 gün kuluçkaya CO2.
    5. Gün 5: medya hücrelerden Aspire edin. Bir kez 1-2 mL PBS ile yıkama ve 10 mL taze hazırlanmış makrofaj farklılaşma medya ekleyin. Bir ek 3 gün kuluçkaya.
    6. Gün 8: Aşağıda açıklandığı gibi BMDMs hasat için devam edin.

2. hasat, tohum ve BMDMs ile priming

  1. Makrofaj farklılaşma medya BMDMs büyüyen 7 gün sonra süpernatant kaldırın. Bir kez 1-2 mL PBS ile yapışık makrofajlar yıkayın. PBS Aspire edin.
  2. 1 mL % 0.25 dağıtmak tripsin-EDTA her makrofaj içine plaka ve sık dokunarak ile hücreleri ayırmak için 5-10 dk 37 ° C kuluçka bırak. P1000 pipet kullanarak yukarı ve aşağı pipetting tarafından trypsinized makrofajlar ayırmak ve 50 mL tüpler 10-15 mL tam DMEM medya içeren makrofajlar toplamak. Plaka kalan herhangi bir makrofajlar hasat için ek 2 mL tam DMEM medya ile yıkayın.
    Dikkat: makrofajlar tripsin için daha--dan 10 dk içinde bırakmayın.
  3. 350 x g 5 dk. atmak için de 50 mL tüpler süpernatant santrifüj kapasitesi. Yavaşça Pelet ayırmak ve komple DMEM medya 10 mL hücrelerde resuspend. Bir hemasitometre bir canlılık huzurunda kullanarak sayısı makrofajlar gibi trypan aşağıdaki gibi mavi boya:
    1. Örneğin, Trypan mavi, 90 µL 1:10 için hücreleri 10 µL ile karıştırın seyreltme.
    2. Bu karışımdan bir hemasitometre 10 µL yük ve merkezi kare (5 x 5 kılavuz) saymak. Toplam hücre sayısı = count x 104 x seyreltme faktörü (10) x cilt (10 mL).
  4. 1 milyon/mL tam DMEM medya ve plaka bu hücre süspansiyon her 6 cm çanak içine 4 mL olmak hücre süspansiyon ayarlayın.
    Not: En az 3 tabak deneme gereklidir. Hücreleri bir tabak-ecek var olmak sol unstimulated, ikinci bir hücre kümesi FcγRs cross-linking aracılığıyla teşvik ve hücre üçüncü plaka tüm ek için kullanılacak olan deneysel ve akış sitometrik denetimleri.
  5. Gecede, 37 ° C, % 5 CO2tabak kuluçkaya.
  6. Ertesi gün, süpernatant, PBS 1-2 mL ile bir kez yıkama hücreleri Aspire edin. 4 mL 100 ng/mL fare IFN γ her plaka içeren komple bir medya ekleyin. Gecede, 37 ° C, % 5 CO2tabak kuluçkaya.
  7. İstenirse, bir aliquot hücrelerinin BMDMs uygun üretimi Akış Sitometresi tarafından değerlendirmeye alın. 1 x 106 hücre test başına kullanabilir ve polistren FACs tüpler hazırlamak için aşağıdaki koşullar: izotip kontrol, F4/80 ile lekeli (veya alternatif olarak, CD11b ile lekeli).
  8. Akış Sitometresi arabellek % 0,1 ekleyerek boyama hazırlamak FBS 1 x PBS içine. FBS yalnızca bu miktarda serum-açlık sonraki adımda etkileri inkâr etmemek için kullanın.
  9. Tüp ve 5 min için 750 x g , santrifüj başına aliquot 1 x 106 hücre.
  10. Bir kez decanting veya süpernatant alıyorum ve Akış Sitometresi arabellek 2 mL hücrelerde resuspending yıkayın. 5 min için 750 x g , santrifüj.
  11. Süpernatant Aspire edin ve tampon boyama Akış Sitometresi 100 µL hücrelerde resuspend. Anti-fare CD16/32 Fc engelleme antikor 1 µL her tüp için ekleyin. 5 min için buz üzerinde kuluçkaya.
  12. Çamaşır olmadan 2 µL FITC Anti-fare F4/80 veya APC Anti-fare CD11b antikor 1 µL "lekeli" tüpler ve karşılık gelen izotip kontrol antikor "izotip" tüpler için benzer bir miktarda ekleyin. Buz, karanlıkta, 30 dk üzerinde kuluçkaya.
  13. Hücreleri doğrudan hücrelere PBS 2 mL ekleyerek yıkayın. 5 min için 750 x g , santrifüj.
  14. Süpernatant Aspire edin ve PBS 150 µL hücrelerde resuspend.
  15. Faiz kapıda bir durdurma koşulu 100 µL veya 10,000 olayları kullanarak Akış Sitometresi örneği elde etmek ve sağlamak bu FSC, SSC, FL1 (FITC Anti-fare F4/80) veya FL4 (APC Anti-fare CD11b) kanalları çözümlenmesi parametreleri için seçilir.
  16. Akış Sitometresi yazılım kullanarak, bir nokta arsa için FSC (x ekseni üzerinde) vs SSC (y ekseni üzerinde) açın ve ölü hücreleri ve enkaz hariç faiz, hücrelerin etrafında bir kapı çizin (ölü hücreleri ve enkaz ana hücre nüfusundan çok daha küçük olaylardır ve lowe üzerinde görünür r arsa yaptı).
  17. Faiz, hücreleri üzerinde perdeleme bir çubuk grafik arsa ile FL1 açın (FITC Anti-fare F4/80) veya FL4 (APC Anti-fare CD11b) x ekseni üzerinde.
  18. "İzotip" örnek çalıştırın. Böylece "izotip" örnek olaylar çoğunluğu geçidi soluna bir işaretleyici kapısı oluşturmak (< % 1 pozitif). Bu şablon lekeli örnek dosyaya uygulanacak.
  19. "Lekeli" örnek çalıştırın. BMDMs başarılı nesil neden olacaktır > % 95 ifade (yanlış kültür koşulları makrofajlar (şekil 1B) alt-optimal nesil neden olabilir ikenşekil 1A), FITC Anti-fare F4/80 veya APC Anti-fare CD11b.
    Not: Birden fazla genotip BMDMs üreten, bu işaretleri, oluşturulan bu ROS üretimi yanıt uyarıcı olarak değerlendirirken bir örnek analiz dışlamak için zemin olabilir durumda BMDM her dizi için ifade dikkat.

3. reaktif ve malzeme hazırlığı ROS ölçümü için

  1. 5 mM hisse senedi çözüm vermeye susuz DMF 60 µL oksidatif stres liyofilize algılama reaktif sulandırmak. Kullanmadan önce karışımı yavaşça.
    Not: O ROS-ID seti el kitabında Sulandırılan reaktif raf ömrü yaklaşık 1 hafta-20 ° C'de olduğu belirtilen 's Aliquoting reaktif hemen sonra sulandırma küçük ışık geçirmez tüpleri içine onun oksidasyon en aza indirir ve raf ömrü-20 ° C'de en üst düzeye çıkarır
  2. 5 mM hisse senedi çözüm vermeye susuz DMF 60 µL liyofilize süperoksit algılama reaktif sulandırmak. Kullanmadan önce karışımı yavaşça.
    Kit kılavuzunda belirtilen dikkat: her iki algılama reaktifler mümkün mutajen tedavi, düzgün her bakım ve elden ele.
  3. ROS uyarıcı (Pyocyanin) bir 50 mM hisse senedi çözüm vermeye susuz DMF 20 µL içinde yeniden oluşturma.
  4. ROS 0,5 M hisse senedi toplama vermeye engelleyici (N-asetil-L-sistein) 123 µL deiyonize su içinde yeniden oluşturma.
  5. 5 mL yuvarlak polistren tüpler (Akış Sitometresi tüpler) deneysel kontrolleri ve koşulları ile etiketleyin. (Bkz. 4. Tahlil koşulları ve kontrol)
  6. Düşük serum hazırlamak % 0,1 ekleyerek DMEM (fenol red) FBS fenol red ücretsiz DMEM için.
  7. Aliquot (kullanım) bağlı olarak küçük aliquots içine anti-BSA antikor ve onları-80 ° C'de depolayın
  8. HBSS 100 mg/mL BSA hisse senedi çözüm hazırlamak (Hanks dengeli tuz solüsyonu) veya PBS. 100 µL aliquots ve mağaza-20 ° C'de aliquot
  9. ROS problar (2 prob çözüm x) 2 x çözeltisi hazırlamak: düşük serum DMEM her 10 mL için 4 µL oksidatif stresi algılama reaktif (yeşil boya) ve 4 µL süperoksit algılama reaktif (turuncu boya) ekleyin.
  10. 2 x sadece içeren sonda çözümleri hazırlamak oksidatif stresi algılama reaktif (2 x sonda çözüm, sadece yeşil) veya içeren sadece süperoksit algılama reaktif (2 x sonda çözüm, sadece portakal). Sadece deneme için gerekli reaktif miktarı ve her zaman 2 x çözüm kullanmak için hemen önceden hazırlayın.
    Not: 2 x algılama çözüm daha küçük birimler hazırlamak için bir ara 1:10 kullanın DMEM son seyreltme önce yeşil ve turuncu algılama reaktifler seyreltme. Örneğin, bir 2 x algılama çözüm 1 mL hazırlamak için DMEM 9 µL her sonda 1 µL seyreltik (1:10 Orta seyreltme). Bu 4 µL seyreltik 1:10 Orta DMEM 1 mL içine seyreltme.

4. tahlil koşulları ve denetimleri

  1. Her deneme için akış sitometrik tazminat için aşağıdaki deneysel denetimler içerir:
    a) günahı ve unstimulated hücreleri.
    b) hücreleri sadece oksidatif stresi algılama reaktifi ile (yeşil reaktif) lekeli ve ROS uyarıcı ile tedavi.
    c) hücreleri sadece süperoksit algılama reaktifi ile (turuncu reaktif) lekeli ve ROS uyarıcı ile tedavi.
  2. Her fare veya biyolojik çoğaltma için aşağıdaki 6 durumlardan bazıları şunlardır:
    a) günahı ve unstimulated hücreleri
    b) lekeli ve unstimulated hücreleri
    c) renkli hücreleri ile olumlu uyarıcı tedavi
    d) lekeli hücreleri olumlu uyarıcı ve ROS inhibitörü ile tedavi
    e) lekeli hücreleri FcγR cross-linking ile aktive
    f) lekeli hücreleri FcγR cross-linking aracılığıyla harekete geçirmek ve ROS inhibitörü ile tedavi
  3. Fareler ve koşullar (2 sonda çözüm x 200 µL boyama gerektiren her koşul için kullanılacak) 2 x sonda çözüm gerekli miktarda sayısına hesaplayın.
    Not: fare 5 koşullar probları ile boyama gerektiren 6 fare kullanarak bir tahlil için gerekli olacaktır. Bu koşullar toplam sayısı 30'a getiriyor. Böylece, toplam 2 x sonda çözüm gerekli en az 6 mL (30 * 200 µL) miktarıdır.

5. hücre hazırlık

  1. Makrofajlar priming sonra bir gecede, süpernatant Aspire edin. Hücreleri bir kez PBS ile yıkayın.
  2. Serum düşük serum DMEM aynı birimle medya değiştirerek hücreleri açlıktan. Diğer kalır iken her fare için bir plaka ile anti-BSA IgG1 serum aç iken, kabul edilir tedavi edilmemiş. Sadece düşük serum DMEM tedavi edilmezse plakaları için ekleyin. Düşük serum fare anti-BSA IgG1 tedavi plakaları ile 2,5 µg/mL içeren DMEM ekleyin.
    Not: Bir ek tedavi edilmezse plaka akış sitometrik tazminat denetimler için her deneme için gereklidir.
  3. Plakayı 37 ° C, % 5 CO24 h için kuluçkaya.
  4. Açlıktan serum sonra nazik kazıma veya 0.2 mM EDTA içinde PBS kullanarak hücreleri hasat. Onları alt tüpler yuvarlak etiketli 5 ml toplamak ve onlara 750 x g 5 dakika süreyle hangi hücrelerin izlemek santrifüj fare anti-BSA IgG1ile tedavi.
  5. Hücre topakları bir kez herhangi bir kalıntı anti-BSA tedavi hücrelerden kurtulmak için PBS 2 mL ile yıkayın.
  6. Hücre Pelet düşük serum DMEM 600 µL içinde resuspend.
  7. 600 µL hücre süspansiyon önceden etiketli 5 mL içine aliquot 200 µL yuvarlak alt tüpler aşağıdaki gibi:
    1. "Unstimulated", tüpler etiketli "olumlu uyarıcı" için 200 µL ve etiketli "olumlu uyarıcı + inhibitörü" tüpler için 200 µL etiketli tüpler için 200 µL tedavi edilmezse hücrelerden al
    2. Anti-BSA IgG1 den işlem görmüş hücreleri, al "FcγR crosslinking/FcγR XL" ve 200 etiketli tüpler için 200 µL µL tüpler için etiketli "FcγR XL + inhibitörü"
    3. Tazminat denetimlerinde kullanılmak üzere tedavi edilmezse hücrelerden al "unstimulated günahı" 200 µL etiketli tüpü, "yeşil + uyarıcı" için 200 µL kontrol ve "portakal + uyarıcı" için 200 µL kontrol.
      Not: aynı fare 5.7.1 ve 5.7.3 hücrelerden türetilir, aynı "unstimulated günahı" hücreleri deneysel ve tazminat denetim için kullanılabilir. Değilse, ek bir 200 µL hücre bir "unstimulated günahı" deneysel kontrolü için gerekli olacak bir).
  8. Buz üzerine boruları boyama ve stimülasyon kadar tutun. Serum açlık ve IgG1, bağlama sırasında probları, belirli uyaranlara ve indükleyicileri aşağıda açıklandığı şekilde hazırlayın.
    Not: tahlil için performans herhangi bir şablon veya hiçbir gerçek sonra tazminat Akış Sitometresi ve karşılık gelen yazılım, kullanılabilir ilk kez teşvik ve tazminat denetimleri leke ve bunları gerçekleştirmek için Akış Sitometresi çalıştırın el ile tazminat önce deneysel örnekleri uyaranlara eklenmesi.

6. tahlil gerçekleştirme

  1. 2 olumlu uyarıcı çözüm x 500 µM pyocyanin 2 x konsantrasyon elde etmek için sonda çözüm (3,9 adımda hazırlanan) x 2'Pyocyanin 1: 100 sulandrarak hazırlamak (son konsantrasyonu 250 µM olacak). Ayrıca, pyocyanin 1: 100 her "2 x sonda çözüm, yeşil sadece" ve 3.10 içinde hazırlanan "2 x sonda çözümü, sadece portakal" tüpler içine oranında seyreltin.
    Not: etiketli "olumlu uyarıcı" ve "olumlu uyarıcı + inhibitörü ile" koşulların her ikisi de olumlu uyarıcı ile tedavi edilebilir. Buna göre plan hazırlamak için 2 x olumlu uyarıcı çözüm miktarını hesaplarken. Örneğin: Eğer tahlil 3 fareler ile gerçekleştirme, 6 koşulları (3 * 2) olumlu uyarıcı ile işlem görür, 6 * 200 µL hazır olun 2 olumlu uyarıcı çözüm x 1.2 mL =.
  2. 2 BSA çözüm x 2 x 2 µg/mL konsantrasyonu elde etmek için sonda çözüm BSA hisse senedi çözümde sulandrarak hazırlamak (son konsantrasyonu 1 µg/mL olacak).
    Not: 2 adet BSA çözüm ile etiketli "FcγR XL" ve "FcγR XL + inhibitörü ile" koşulların her ikisi de işlem görür. Buna göre plan hazırlamak için çözüm miktarını hesaplarken. Örneğin: 3 fareler, 6 (3 * 2) kullanarak tahlil gerçekleştirme BSA çözüm ve bu yüzden 6 * 200 µL koşulları tedavi veya 2 BSA çözüm x 1.2 mL gerekecektir.
  3. Belirli stimülasyon (FcγR crosslinking) başlamadan önce tüm reaktifler ve hücreleri hazır olduğundan emin olun. Tüpler buz onlar-ecek var olmak uyarmak sırayla yerleştirin.
  4. Akış cytometers ile bir Otomatik Örnekleyici sitometresi bir örneğini analiz ve diğerine taşımak için gereken süre dikkat çekmek için herhangi bir karıştırma ve sonda adımları (örneğin 3,5 dk) yıkama dahil olmak üzere.
    Not: Bu tahlil için zamanlama çok önemlidir. İyi kontrol için her koşulu stimülasyon her koşul için kesin süre (30 dk) gerçekleştirilmesi gerekir. Hücreleri uyarmak ve örnek alma Akış Sitometresi tarafından arasındaki gecikme süresini dahil. Bir örneğini analiz ve sonraki hareket sitometresi zamanı 3,5 dk ise, örneğin, her 3,5 dk incelenecek hücreleri uyarmak.
  5. El ile tazminat bu noktada performans Eğer kontrol tüpleri için tazminat (Adım 5.7.3) kullanılmak üzere teşvik. "2 x sonda çözüm, yeşil sadece" 200 µL eklemek uyarıcı (6.1) üzerinden tüpler içine içeren "yeşil + uyarıcı" işaretli (Adım 5.7.3). "2" sonda çözüm, sadece turuncu x 200 µL eklemek uyarıcı (adım 6.1) tüpler içine içeren "portakal + uyarıcı" işaretli (Adım 5.7.3).
  6. 37 ° C'de 30 dk, % 5 CO2 karanlıkta için hücreleri kuluçkaya.
  7. Akış Sitometresi yazılım kullanarak oluşturmak ve Denetim "günahı, tedavi edilmezse", "yeşil + uyarıcı" için 3 örnek dosyaları etiketleyin ve "portakal + uyarıcı" örnekleri, kanalları/parametrelerin analiz (FSC, SSC, FL1, FL2) belirtmek emin ve durdurmak istenen koşullar (100 µL, 3 dk, vs.). Oluşturmak ve dosyaları deneysel örnekleri için benzer bir dizi etiket.
  8. "Günahı, tedavi edilmemiş" örnek çalıştırın. Bir nokta arsa için FSC (x ekseni üzerinde) vs SSC (y ekseni üzerinde) açmak ve faiz, ölü hücreleri ve enkaz hariç hücrelerin etrafında bir kapı çizin (ölü hücreleri ve enkaz ana hücre nüfusundan çok daha küçük olaylardır ve arsa sol alt köşesinde görünür).
  9. Başka bir nokta arsa FL1 açmak için bu "hücre" gate, ı (x ekseni) vs FL2 (y ekseni). Bir ilk çeyreği kapı çizin. Çeyrek daire kapıları FL1 vs FL2 arsa sol alt çeyrekte olaylar görünür şekilde ayarlayın.
  10. "Yeşil + uyarıcı" örnek çalıştırın. Gerilim olaylar alt sol ve sağ tarafta FL1 vs FL2 arsa üzerinde görünür şekilde ayarlayın. Bu tazminat matris tüm 3 örnek dosyalar için geçerlidir.
  11. "Portakal + uyarıcı" örnek çalıştırın. Alt ve üst olaylar görünür gerilim ayarlamak çeyrek daire FL1 vs FL2 arsa için yorum yaptı. Bu tazminat matris tüm 3 örnek dosyalar için geçerlidir.
  12. Her tazminat dosyasını denetleyin ve olun "günahı, tedavi edilmezse" olaylar görünür üzerinde sol alt çeyrekte, "yeşil + uyarıcı" olaylar üzerinde alt sol ve sağ tarafta görünür ve "portakal + uyarıcı" olaylar görünür alt ve üst tarafta FL1 vs yaptı FL2 arsa. Tazminat matris tüm deneysel örnek dosyaları uygulanır.
    1. Tazminat matris deneysel örnek dosyaları tümüne uygulamadan önce uygun tazminat için tüm denetim örnek dosyaları geçerli emin olun. Şekil 2 ' ye uncompensated gösteren temsilcisi veri ve doğru bir şekilde telafi örnekleri için bakın.
      Not: Birçok cytometers FL1 standart (mavi 488 nm lazer tarafından heyecan ve 530/30 filtre kümesi ile tespit) FITC/GFP kanal FL2 (mavi 488 nm lazer tarafından heyecan ve 585/40 filtre kümesi ile tespit) standart PE kanalı olarak atayın. Biz onların sitometresi benzer şekilde yapılandırılmış ve uygun kanallar bu sondalar algılamak için kullanılan emin olmak için kendi Akış Sitometresi çekirdek Yöneticisi ile danışmak için dikkat yeni Akış Sitometresi kullanıcılar ama aynı bu kuralını kullanır. Akış Sitometresi ve yazılıma eşlik eden modeline bağlı olarak, önce veya sonra örnekleri elde etmiş tazminat gerçekleştirmek mümkün olabilir. Aslında sonra tazminat olanaklı olsa bile, tüm deneysel örnekleri sitometresi tarafından elde etmiş sonra tazminat adım gerçekleştirilebilir. Nerede Devresel_ödeme gerilim ayarlamalar gerekmez, bir dinamik aralık ile cytometers için tazminat deney da ayrı bir günde gerçekleştirilebilir ve deneysel şablonu (tazminat matris de dahil olmak üzere) gerçekleştirmek için gereken süreyi azaltmak için kaydedilebilir el ile tazminat.
  13. El ile tazminat sahne aldı ve deneysel bir şablonu alındıktan sonra deneysel örneklerinin tedaviye başlayın. Olumlu uyarıcı ya da FcγR cep stimülasyon ile tedavi daha önce hangi tüpler ROS inhibitörü almak mark. Bu hücreler ROS inhibitörü en az 30 dk önce olumlu uyarıcı veya FcγR stimülasyon ile tedavi.
  14. ROS inhibitörü eklemek için (ezelî anti-BSA IgG1) resuspended hücrelerinin 200 µL engelleyici 1 µL ekleyerek 5 mM son bir konsantrasyon hazırlayın.
  15. Uyarıcı (veya olumlu uyarıcı) hücrelerle tedavi ve yük hücreleri ROS probları ile aşağıdaki gibi:
    1. Unstimulated hücreler için: 2 sonda çözüm olmadan herhangi bir uyarıcı x 200 µL etiketli "lekeli, unstimulated" hücre süspansiyon 200 µL için ekleyin.
    2. Pozitif denetimler için: 2 (6.1 adımda hazırlanan) olumlu uyarıcı çözüm x 200 µL etiketli "olumlu uyarıcı" ya da "olumlu uyarıcı + inhibitörü" hücre süspansiyon 200 µL için ekleyin.
    3. Hücreler için teşvik FcγR cross-linking (belirli tarafından uyarıcı): 2 x BSA çözüm (6.2 hazırlanmış) 200 µL etiketli "Fcγr XL" ya da "FcγR XL + inhibitörü" hücre süspansiyon 200 µL için ekleyin.
      Not: x edinimi bir örnek ve sonraki arasındaki gecikme süresini nerede her x dakikada uyarıcı ekleyerek örnek analiz arasındaki gecikme süresini dahil unutmayın.
  16. 37 ° C'de 30 dk, % 5 CO2 karanlıkta için hücreleri kuluçkaya. Bir otomatik örnekleyici ile donatılmış bir Akış Sitometresi kullanarak uyarılmış oldukları sırada örnekleri analiz. İlk tazminat adımları sırasında oluşturulan analiz şablonları kullanın. Hücreleri analiz önce yıkama yok.

7. Akış Sitometresi veri analizi ve beklenen sonuçları

  1. Akış Sitometresi yazılım içinde deneysel örnekleri için önceden oluşturulan analiz dosyaları açmak (Şablonlar 6,7-6.12 adımda oluşturulan ve örnekleri 6,16 adımda çalıştırmak). El ile tazminat gerçekleştirmesini tazminat matris doğru deneysel örnekleri için geçerli emin olun.
    Not: tazminat matris daha önce deneysel örnek dosyaları için uygulanmadı, akışı cytometers ve Akış Sitometresi yazılım aslında after tazminat, yetenekli için o bu noktada uygulanır.
  2. Doğru el ile tazminat, doğrulama için benzer olun deneysel örnekleri içindeki denetimlerin beklendiği gibi davranır.
    1. "Günahı, tedavi edilmemiş" olaylar FL1 vs FL2 arsa, sol alt çeyrekte "olumlu uyarıcı" olaylar artan Floresans sol üst sağ üst göstermek ve sağ tarafta FL1 vs FL2 arsa ve bu alt gösterilmesine" olumlu uyarıcı + ROS inhibitörü"olaylar bir azalma Floresans içinde üst sol, sağ üst göster ve alt sağ tarafta floresan için karşılaştırıldığında FL2 arsa gözlenen"olumlu uyarıcı"örnek ile FL1 vs.
    2. Deneysel örnekleri içindeki denetimlerin herhangi bir artış Floresans gösterme yoksa, tüm tahlil merdiven were kılınmak kontrol, uygun üretimi ve makrofajlar (2.7-2.19), kemik iliği elde edilen macun doğrulayın ve denemeyi tekrarlamak. Deneysel örnekleri içindeki denetimler beklenen eğilimleri göstermek, deneysel örneklerini FcγR (şekil 3A) teşvik devam edin.
  3. FcγR özel uyarıcı uygun şekilde çalıştığından emin olun. Aşağıdaki örnekleri C57BL/6J WT fareden çalıştırın: "günahı, unstimulated", "lekeli, unstimulated", "lekeli, FcγR aracılığıyla teşvik", ve "lekeli, uyarılmış FcγR + ROS inhibitörü". Bunlar sırasıyla örnekleri 4.2a, 4.2b, 4.2e ve 4.2f bölümünde 4, karşılık.
    1. "Günahı, unstimulated" olay "lekeli, unstimulated" olaylar da FL1 vs FL2 arsa sol alt çeyrekte görünür FL1 vs FL2 arsa sol alt çeyrekte görüntülenir sağlamak o "lekeli, FcγR teşvik" olaylar artan Floresans sol üst sağ üst göstermek ve daha düşük FL1 vs FL2 arsa, ve sağ tarafta "lekeli, uyarılmış FcγR + ROS inhibitörü" olayları azalmış floresan sol üst, sağ üst ve sağ alt gösterecektir Çeyrek daire "lekeli, FcγR ile uyarılan" örnek (şekil 3A) için karşılaştırıldığında FL1 vs FL2 arsa.
    2. Bu beklentileri karşılanmazsa, örneğin, "lekeli, FcγR ile uyarılan" örnek en az gösterir veya hiçbir artan floresan "lekeli, unstimulated" örneği veya "lekeli, unstimulated" örneği zaten karşılaştırıldığında belirgin gösterir Floresan "günahı, unstimulated" örnek için karşılaştırıldığında, daha yüksek düzeyde tüm tahlil adımları düzgün gerçekleştirilen kontrol, macun ve BMDMs (2.7-2.19), işleme uygun üretimi, doğrulamak ve denemeyi tekrarlamak. Bu beklentileri yerine getirilmesi, deneysel örnekleri geri kalanı analiz için devam edin.
      Not: yeşil sonda ile (hidrojen peroksit, peroxynitrite, hidroksil radikalleri, nitrik oksit, peroxy radikaller, vb) tepki ROS üreten hücrelerin sağ üst köşesinde görünür ve daha düşük bir günlük FL1 sağ tarafta (x ekseni) bir günlük FL2 karşı (y ekseni) nokta arsa. (Büyük ölçüde ama değil sadece süperoksit) turuncu sonda ile tepki ROS üreten hücrelerin iki üst çeyrek dairelerin bir günlük FL1 (x ekseni) bir günlük FL2 karşı görünür (y ekseni) nokta arsa.
  4. İlgi için çözümleme-in FL1 ve FL2 floresan hücreleri üzerinde geçişli bireysel çubuk grafikler oluşturun. Öyle ki tüm "günahı, unstimulated" olaylar bu işaretleyici solunda görünür "günahı, unstimulated" örnekleri kullanarak, bir çubuk grafik işaretleyici oluşturmak. Bu arsa marker ile deneysel örnekleri (şekil 3B) dinlenmek için geçerlidir.
  5. Denemenin sonuçları pozitif hücrelerinin yüzde olarak her ROS probları veya denetim (şekil 3 c) karşı uyarılmış örneklerinin ortalama Floresans yoğunluğu (MFI) göstererek için mevcut.

8. hücre yüzeyine ROS üretim (isteğe bağlı) akış sitometrik çözümlemesi ile birlikte boyama

Not: Bu adım bir hücre yüzeyine marker önce FcγR ve ROS ölçüm uyarılması ile makrofajlar boyama için bir protokol sağlar. Bu karma hücre popülasyonlarının üretimde ROS değerlendirmede yararlı olabilir. Bir antikor makrofaj yüzey işaretçi Floresans oksidatif stres veya süperoksit algılama reaktifleri gelen engel bir uygun fluor Birleşik için seçmek önemlidir. Bu protokol için bir antikor F4/80 Alexa fluor 647 Birleşik fare için kullanılır.

  1. Hasat ve onları daha önce açıklandığı gibi (Bölüm 1 ve 2) asal BMDMs oluşturur.
    Not: En az üç 6 cm tabak aşağıda açıklandığı gibi koşul ve deneysel denetimleri gerçekleştirmek için ihtiyaç vardır. Diğer iki tabak yaptı iken açlıktan serum tedavi edilmezse iken bir tabak anti-BSA ile IgG1 değerlendirilir.
    1. Akış sitometrik tazminat (deneme) başına kullanılan 4 deneysel denetimler içerir:
      a) günahı ve unstimulated hücreleri.
      b) hücrelerin oksidatif stresi algılama reaktif (yeşil reaktif) ve ROS uyarıcı ile tedavi.
      c) hücreleri süperoksit algılama reaktif (turuncu reaktif) ve ROS uyarıcı ile tedavi.
      d) hücreleri sadece Alexa 647 için F4/80 Birleşik Anti-fare ile lekeli.
    2. Her fare veya biyolojik çoğaltma için aşağıdaki 3 koşullar şunlardır:
      a) yaptı ve F4/80 unstimulated lekeli
      b) F4/80 ile lekeli ve FcγR harekete geçirmek
      c) F4/80 ile lekeli ve FcγR ile aktif ve ROS inhibitörü ile tedavi
  2. Makrofajlar priming sonra bir gecede, süpernatant Aspire edin. Hücreleri bir kez 1-2 mL PBS ile yıkayın. Serum düşük serum DMEM aynı birimle medya değiştirerek hücreleri açlıktan. Her fare için bir tabak anti-BSA ile IgG1 serum açlıktan kabul edilir, diğer iki tabaklar iken sol tedavi edilmezse. Plakayı 37 ° C, % 5 CO24 h için kuluçkaya.
  3. Açlıktan serum sonra nazik kazıma veya 0.2 mM EDTA içinde PBS kullanarak hücreleri hasat. Her plaka alt tüpler yuvarlak etiketli 5 ml toplamak ve onlara 750 x g 5 dakika süreyle hangi hücrelerin izlemek santrifüj fare anti-BSA IgG1ile tedavi.
  4. Hücre topakları kez 1-2 mL herhangi bir kalıntı anti-BSA tedavi hücrelerden kurtulmak için PBS ile yıkayın.
  5. Hangi anti-BSA IgG1 düşük serum DMEM 600 µL içinde alamadım plaka hücre çökeltilerini birini resuspend. Bu hücreler olacak değil tabi hücre yüzey boyama için. Bunlar tazminat denetimler için kullanın. Bu hücre süspansiyon (3) içine aliquot 200 µL 5 mL yuvarlak alt tüpler etiketli bir) günahı, unstimulated b) yeşil oksidatif stres reaktifi + ROS uyarıcı, c) turuncu süperoksit algılama reaktifi + ROS uyarıcı.
  6. Bir hücrenin hangi anti-BSA alamadım plaka granül resuspend IgG1, tampon boyama Akış Sitometresi 300 µL ' (PBS + %0,1 FBS). Bu hücre süspansiyon (2) içine aliquot 100 µL 5 mL yuvarlak alt tüpler Alexa 647 Anti-fare F4/80 ile boyama için.
  7. Anti-BSA IgG1 Akış Sitometresi boyama arabellek 300 µL içinde alınan plaka hücre çökeltilerini resuspend. Bu hücre süspansiyon (2) içine aliquot 100 µL 5 mL yuvarlak alt tüpler Alexa 647 Anti-fare F4/80 ile boyama için.
  8. 8.6 ve Alexa 647 Anti-fare F4/80 buzda karanlıkta 30 dk 5 µL ile 8,7 bölünmemeli hücreleri, leke.
  9. Boyama, yıkama hücreleri de 750 x g, PBS ve santrifüj 2 mL ekleyerek sonra süpernatant Aspire edin ve düşük serum DMEM fenol red olmadan 200 µL her tüp resuspend. Tek başına lekeli FL4 denetimi hizmet için bir tedavi edilmezse tüp bir kenara. Sonda, uyarıcı, FcγR uyarıcı ve ROS inhibitörleri 3.9, 3.10, 6.1, 6.2 ve 6,14 bölümlerde belirtildiği şekilde hazırlayın.
    1. Anti-BSA almayan hücreleri1IgG için etiket aşağıdaki tüplerini: bir) uyarıcı ya da b) ROS uyarıcı yok.
    2. Anti-BSA alınan hücreler1IgG için aşağıdaki ile etiket: bir) Fc XL ya da b) Fc XL + inhibitörü.
  10. Onların anılan sıraya göre tedaviler göre tazminat 6.5-6,6, öteleme süresi arasında bir örnek ve sonraki edinimi birleşmeyle Akış Sitometresi üzerinde okunacak sırayla gösterildiği gibi kullanılmak üzere örnekleri teşvik.
  11. 37 ° C'de 30 dk, % 5 CO2 karanlıkta için hücreleri kuluçkaya. Bir otomatik örnekleyici ile donatılmış bir Akış Sitometresi kullanarak uyarılmış oldukları sırada örnekleri analiz.
  12. 7 bölümünde açıklandığı gibi 6,7-6.12 ve veri analizi açıklandığı gibi el ile tazminat gerçekleştirin.
  13. Akış Sitometresi yazılım kullanarak, oluşturmak ve 4 örnek resimler denetimi için etiket "günahı, tedavi edilmezse", "yeşil + uyarıcı", "portakal + uyarıcı" ve "F4/80 lekeli" örnekleri, olmasını Kanallar/parametreleri belirtmek emin analiz (FSC, SSC, FL1, FL2, FL4) ve istediğiniz durdurma koşullarının (100 µL, 3 dk, vs.).
  14. Örnekleri çalıştırmak ve el ile tazminat gerçekleştirmek için nokta araziler oluşturmak.
    1. Hücre yüzey boyama için iki ek araziler oluşturmak: FL1 (x ekseni) vs FL4 (y ekseni) ve FL2 (x ekseni) vs FL4 (y ekseni). Uygun tazminat 7A rakamgösterildiği gibi uygulanır sağlamak için voltaj ayarlayın. Bir kez tüm tazminat düzgün sahne aldı, tazminat matris tüm deneysel örnek dosyaları uygulanır.
  15. El ile tazminat sahne aldı ve deneysel bir şablonu alındıktan sonra deneysel örnekleri tedavisinde 6.13-6.15.3 içinde belirtildiği şekilde başlatın ve 6,16 içinde açıklandığı gibi bir Akış Sitometresi örneği elde etmek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

İçinde özetlenen protokolü kullanarak, biz temsilcisi veri akış sitometrik algılama ROS üretim WT C57BL/6J BMDMs FcγR aracılığıyla uyarılması sonucu gösteren mevcut. Beklendiği gibi biz çok az değişiklik FL1 veya FL2 floresan arka plan düzeylerine unstimulated hücrelerdeki yukarıda içinde gözlemlemek (şekil 3A, "lekeli, unstimulated" vs "günahı, unstimulated" nokta çizer karşılaştırın). Hücreleri cross-linking agent (şekil 3A, "lekeli, unstimulated" nokta çizer ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

DCFH2-DA ve DHE tabanlı algılama ROS, yaygın olarak kullanılan teknik14,15var. Kullanım kolaylığı ve Kinetik Mikroplaka biçimleri için bu ROS probları adaptasyon, floresan mikroskopi veya akış sitometrik analiz onların popülerlik için katkıda bulunmuştur. Ancak, çalışmalarımız FcγR-aracılı makrofaj fonksiyonların, değil gibi görünüyor bu tahlil için FcγR çapraz bağlı hücre akış sitometrik çözümlemesi gerçekleştirmek için standart bir protokol. Değerlen...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Teşekkürler

Yazarlar Tigno-Aranjuez Laboratuvar Laboratuvar bakım ve fare koloni bakım yardım için Madelyn H. Miller, Omar Cardona, Andjie Jeudy ve Roopin Singh gibi diğer üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu araştırma için destek hibe R00 HL122365 ve J.T.T-A. başlangıç fonlar tarafından sağlanan

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Anti-BSA IgG1Yenilikçi AraştırmaIBSA9E2C2
Alexa Fluor 647 Sıçan IgG2b, κ Isotype Ctrl AntibodyBioLegend400626
Anti-fare CD16/32BioLegend101302
BD Biosciencesilekonjuge anti-fare F4/80 antikoru
BioLegendile konjuge anti-fare F4/80 antikoru123108
Alexa Fluor 647 ile konjuge anti-fare/insan CD11b antikoru;BioLegend101218
beta-merkaptoetanol (BME)SigmaM3148-100ml
Sığır Serum Albümini (BSA) FraksiyonVFisherBP1600-100
C57BL / 6J & nbsp;Jackson laboratuvarlarıStok No.000664
CM-H2DCFDAMoleküler ProblarC6827Enzo kitinde oksidatif stres tespit reaktifinin yerine geçebilir
Dihidroetiyum (DHE)Moleküler ProblarD11347Enzo kitinde süperoksit tespit reaktifinin yerine geçebilir
DMEM 1xCorning10-013-CV
DMEM fenol içermez kırmızıGibco31053-028
DMF Susuz Acros Organics61094-1000
Fetal Sığır Serumu (FBS)VWR97068-085
FITC Sıçan IgG2a, κ İzotip Ctrl AntikoruBioLegend400506
HEPES (1M)Gibco15630-080
L glutaminGibco25030-081
LADMAC hücreleriATCCCRL-2420
MEMCorning10-010-CV
fare IFN-gGoldBio1360-06-100
N-Asetil-L-sisteinEMD Milipore106425Enzo kitinde ROS inhibitörü/çöpçüsünün yerine geçebilir
Otomatik örnekleyicili Novocitte akış sitometresiAcea2060R
Piyosiyanin (ROS indükleyicisi)Cayman kimyasal10009594Enzo kitindeki indükleyicinin yerine geçebilir
ROS-ID toplam ROS / süperoksit tespit kitiENZOENZ-51010
Sodyum piruvat (100mM)Gibco11360-070
Tripsin-EDTA (% 0.25)Gibco25200-056
Alexa Fluor 647 565853 FITC

Kaynaklar

  1. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
  2. Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).
  3. Robinson, J. M. Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes. Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).
  4. Thomas, D. C. The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances. Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).
  5. Fang, F. C. Antimicrobial actions of reactive oxygen species. MBio. 2 (5), (2011).
  6. Iles, K. E., Forman, H. J. Macrophage signaling and respiratory burst. Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).
  7. Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease. New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).
  8. Good, R. A., et al. Fatal (chronic) granulomatous disease of childhood: a hereditary defect of leukocyte function. Seminars in Hematology. 5 (3), 215-254 (1968).
  9. Holmes, B., Page, A. R., Good, R. A. Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function. Journal of Clinical Investigation. 46 (9), 1422-1432 (1967).
  10. Windhorst, D. B., Page, A. R., Holmes, B., Quie, P. G., Good, R. A. The pattern of genetic transmission of the leukocyte defect in fatal granulomatous disease of childhood. Journal of Clinical Investigation. 47 (5), 1026-1034 (1968).
  11. Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
  12. Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells. White Paper. , (2015).
  13. Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
  14. Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
  15. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).
  16. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586(2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Akış SitometrisiROS ÖlçümüMakrofaj AktivasyonuFc Gama ReseptörüOksidatif Stres TespitiFloresan ProblarKemik İliği Kökenli MakrofajlarKompansasyon KontrolleriROS İnhibitörüPiyosiyanin Stimülasyonu
Akış sitometrik ölçüm makrofajlar FcγR Cross-linking yanıt ROS üretim
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.