Kombine nükleotit ve Caenorhabditis elegans Protein çekimi

Multiomics, omics, genom, Proteom, transcriptome, epigenome, microbiome veya lipidome, gibi bir arada kullanan analitik yaklaşım büyük veri kümeleri için hastalık karakterizasyonu^{1işlerken giderek daha popüler hale geldi, 2}. Montaj kanıt yaklaşımlar tek bir "ome" sınırlı (Rotroff ve Motsinger-Reif¹tarafından gözden) eksik bir moleküler analiz sağlar göstermiştir. Özellikle yüksek üretilen iş teknikleri kullanarak ekranlar gerçekleştirirken büyük veri kümeleri oluşturulur, ancak tam bir resim "boyamak için" ya da en uygun hedefler belirlemek için multiomic yaklaşımlar tercih edilir. Multiomics yaklaşımlar kullanımı ile ancak, mRNA ve protein düzeyleri^3,4,5,6arasındaki farklılıkları sık gözlem yoktur. Özellikle, mRNA ve yan yana transcriptomic ve RNA sıralama (RNAseq) ve sıvı Kromatografi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS), proteomik analizleri için sırasıyla, kullanılan protein kez aynı şekilde tedavi örneklerinden elde edilen farklı çoğaltır, varyasyon aynı arasında potansiyel olarak tanıtan^3,4,5,6koşulları. Harvald ve ark. gerçekleştirilen bir zarif transcriptome ve vahşi-türü (WT) Proteom göre C. elegans açlık zaman-ders çalışmada solucanlar bu uzun ömürlü ^{bir önemli transkripsiyon faktör eksikliği hlh-30 mutant solucanlar 7}. Not, RNA ve protein aynı örnekten çok değil aynı koşul çoğaltır üzerinden hasat edildi. Onların bulgular mRNA düzeyleri ile her zaman bir noktada protein düzeyleri düşük bir korelasyon göstermektedir (r = 0.559-0.628). Aslında, onların heatmap dört kümeleri kurdu: mRNA büyük bir düşüş vardı küme düzeyleri ama az veya hiç karşılık gelen protein düzeyleri azalma, küme II mRNA düzeylerinde artış protein düzeyleri ama az veya hiç artış vardı, küme III mRNA bir artış vardı düzeyleri ancak protein düzeyleri ve küme IV bir düşüş bir mRNA düzeylerinde artış ama protein düzeyleri⁴sadece ince bir değişiklik vardı. Ayrıca, bu intersample varyasyon nerede aynı durumda örnekleri tam olarak aynı zamanda toplanan değil durumlarda tanıttı. Örneğin, mRNA ve proteinler sirkadiyen döngüsü tarafından düzenlenmiş bağlı olarak gün^8,9saat veya daha ayrıntılı olarak, C. elegans pozlama ışık⁹dalgalanma; ifade bu sirkadiyen proteinlerin gen ifade indüksiyon¹⁰sonra 8 saat kadar gecikebilir. Yine de, bu gözlem yaygınlığı mutlaka yanlış bir şey gelmez; Aslında, bu bilgilendirici olarak kanıtlamak. Protein ve mRNA dinamik devamlı oluşumu ve yıkımı arasında bulunmaktadır. Ayrıca, proteinler kez posttranslationally istikrarı artırmak veya onların yıkımı¹¹ikna etmek için değiştirilir. Örneğin, ubiquitination durumlarını etkinleştirme veya proteasome veya lysosome bozulması¹²için hedefleme yol açabilir. Ayrıca, kodlamayan RNA'ların transkripsiyon ve posttranscriptional aşamaları¹³gen ifadesinin düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Böylece, soru biz nematodunun bu çalışmalarda gözlemlemek tutarsızlıkları gerçek olduğunu doğrulamak için değişkenleri sınırlamak nasıl olduğunu.

Burada, intersample değişkeni aynı örnekten farklı oluştururlar analizlerini izin vererek siler bir yöntem öneriyorum. Bu iletişim kuralı sürekli bir çaba varyasyon azaltmak, tekrarlanabilirlik geliştirmek için DNA, RNA ve protein (solucan da bilinir) C. elegans tek bir örnek üzerinden izole etmek için bir yöntem sağlar ve yorumların kolaylaştırmak için hedeftir. Zaman ve kaynak tasarrufu kazanıyor ve büyümek ve korumak zor olan suşları dahil olmak üzere değerli ve sınırlı örnekleri, kesitsel analizini kolaylaştıran örnek toplama sırasında aynı örnek kullanarak ek yararları içerir farklı düzenleme intrasample değişimler mRNA ve protein düzeyleri temel oluştururlar, anlayışlar.

Bu yöntem gen ifadeleri ve solucanlar, moleküler işleme kadar birden çok düzeyde daha kapsamlı bir değerlendirme için izin tek bir örnek protein düzeyleri değerlendirmek için uygundur. Guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform (GTCp) Reaktif¹⁴, RNA, izole etmek için yaygın olarak kullanılan bir kimyasal solucanlar, sonraki yağmur damlaları, çamaşır ve solubilization her ile nükleik asitler ve protein çıkarılması için kullanılır. Bu iletişim kuralı C. elegans, odaklanarak tasarlanmış küçük değişiklikler ile çeşitli protokolleri^15,16 derlenmiştir ama biz de başarıyla DNA RNA ve protein takip HeLa hücreleri Pelet izole ettim aynı adımları. Her ne kadar burada test değil, bu dokular üzerinde de^17,18çalışma olasılığı bir protokoldür.

Not: Her makromolekül yağış adım ardışık olarak, aynı anda yapılan yıkama tarafından takip gerçekleştirilir; Ancak, bu RNA izolasyon tamamlamak için önerilir önce özünde kararsız olduğu gibi.

1. örnek koleksiyonu

1. 1000 solucan yumurta uygun büyüme koşullar¹⁹ile 10 cm plaka başına tohum. 72 h için 20 ° C'de kuluçkaya.
   Not: Daha önce yumurta toplamak için çamaşır suyu yumurta taşıyan yetişkin¹⁹açıklanan.
2. Yaklaşık 5 mL M9 arabelleği ile tabak yıkama ve 1.000 yetişkin solucanlar bir tüpün içine toplamak.
   Not: M9 arabellek 35 mM sodyum fosfat dibasic, 102 mM Sodyum Klorür, 22 mM potasyum fosfat yem mono ve 1 mM Magnezyum sülfat steril su¹⁹oluşur.
3. 1000 x g 1 dk. için de solucanlar santrifüj kapasitesi, süpernatant atın ve 1 mL M9 arabelleği pelleted Kurtlarla 1.5 mL microcentrifuge tüp transferi.
4. Bir daha vasıl 845 x g 1 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant çoğunu atın. Pelleted solucanlar en az 4 h-80 ° C'de depolayın.
   Not: Donmuş bir Pelet kullanarak bir taze Pelet daha daha yüksek bir verim elde edilir. Sıvı nitrojen ya da % 95 etanol solucan kütikül çatlamak için Kuru buza kullanarak donma/çözülme döngüsü bir dizi tavsiye edilir bir taze Pelet kullanıyorsanız. M9 az miktarda Pelet üzerinde bırakarak manikür dondurma zaman break yardımcı olur.

2. nükleotit ve Protein yalıtım

1. Herhangi bir süpernatant çözdürülen Pelet kaldırın ve 1 mL soğuk GTCp reaktif ekleyin. Mix de yukarı ve aşağı pipetting. Örnek buz 10 min için yer ve zaman zaman ters çevirip tarafından karıştırın.
   Uyarı: Fenol aşındırıcı, Nörotoksik ve yüksek derecede toksik ve kimyasal yanık ve körlüğe neden.
   Not: 5. 000'e kadar yetişkin solucanlar bildirilen birimleri ile başlangıç malzemesi olarak kullanılan; her birim 1 mL GTCp reaktif kullanımına dayanır. Daha büyük bir örnek kullanırken, büyütmek için gerekli olabilir.
2. Solucanlar ve GTCp, soğuk kloroform 200 µL ekleyin. Seninkine parmakları arasında kontrol ve şiddetle 15 s. izin için bu oda sıcaklığında (RT) 3 dakika çalkalanır.
   Uyarı: Kloroform bir toksik tahriş edici, Cilt yaralar ve diğer organ hedefli zarar neden olabilir ve olası bir kanserojen olduğunu.
3. Tüp, 13.500 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi
   Not: Üç katmandan sonra bu spin kurdu: üst, açık sulu faz, alt, pembe organik faz ve lipidler ve DNA içeren küçük, bulutlu Interphase.
4. Bir micropipette kullanarak, alkol yağış (olarak detaylı içinde adım 2.5) üzerinden RNA yalıtmak ve pembe Katmanı (organik faz) kalan Pelet taşımak için yeni bir tüp (için bir yeni RNase free 1.5 mL microcentrifuge tüp (a tüp) açık üst tabaka (sulu faz) taşımak tüp B) ve buz üzerinde yerleştirin.
   Not: Pembe organik faz-80 ° C'de DNA ve protein bu örnekten yalıtım kadar donmuş olabilir. Daha büyük örnekleri sulu ve organik faz arasında kalın bir beyaz tabaka üretecek. Bu kesir DNA içerir. Bu katman-ebilmek var olmak çıkarmak diğer aşamalarında bozmadan, bunu yapmak ve bir ayrı tüp (tüp B2) koydu.
5. RNA aşağıdaki gibi izole et.
   1. Tüp A temiz sulu faz 500 µL % 100 isopropanol ile RNA çökelti. 10 dakika dik, kuluçkaya Sonra santrifüj tüpü A 13.500 x g 4 ° C'de 10 dk de
      Not: RNA'ın küçük bir beyaz Pelet tüp alt kısmında görünür olmalıdır.
   2. Süpernatant çoğunluğu dikkatle boşaltmak. Kalanı 1 mL şırınga ile bir iğne ile kaldırmak ve süpernatant atın.
      Not: İğne büyüklüğü önemli değildir; Ancak, daha büyük bir iğne ölçüm Pelet rahatsız etmek daha fazla denetim sunar. İğneler yoksa bir micropipette kullanılabilir.
   3. % 75 etanol 1 mL tüp Pelet yıkamak için A ekleyin. Tüp 5300 x g 4 ° C'de 5 min için de spin
   4. Süpernatant Pelet decanting ve bir iğne ile 1 mL şırınga kullanarak adım 2.5.2 konusunda açıklanan şekilde kaldırın ve bu atın.
   5. Pelet izin için 5-10 dk kuruması, ama overdry izin vermeyin. 50 µL RNase free su tamamen saydam olur önce RNA Pelet yeniden oluşturmak için kullanın.
      Not: Bu yeterli bir başlangıç birim 1000-3000 solucanlar için ama ne kadar başlangıç materyali kullanılan yönteme bağlı olarak ayarlanması gerekebilir.
   6. Bunu halletmek için 55-60 ° c 10 min için Pelet kuluçkaya.
   7. Konsantrasyonu ve bir Spektrofotometre kullanarak saflığı ölçmek. Kayıt absorbances 260 nm RNA yoğunlaşması ve herhangi bir yabancı maddeleri tanımlamak için 230 ve 280 nm.
   8. Herhangi bir kirletici maddeleri, fenol kalıntı veya DNA, gibi sütun arıtma veya sonraki etanol yıkar ve Dnaz tedavisi kaldırmak için RNA temiz.
      Not: Bu noktada, RNA RNAseq analiz için gönderilmeye hazır veya cDNA RT-qPCR (Ayrıntılar için 3.1 bölümüne bakın) kullanmak için yapmak için kullanılabilir. RNA-80 ° C'de daha fazla kullanılmasını kadar saklanabilir.
6. DNA aşağıdaki gibi izole et.
   1. Tüp B pembe organik aşamasında ve tüp B2, örnek varsa, DNA INVERSION tarafından 300 µL % 100 etanol ve karışımı ekleyerek çökelti. Tüpler RT için 2-3 dakika bırakın.
   2. 375 x g 4 ° C'de DNA cips için 5 min için de B ve B2 tüpler santrifüj kapasitesi.
   3. Süpernatant tüpler B ve B2 yeni 2 mL tüp içine (tüp C) dökerek taşımak ve sonraki protein yalıtım için buz üzerinde bırakın. DNA Pelet tüp B veya B2 ile 1 mL 0.1 M sodyum sitrat 375 x g 4 ° C'de 5 min için de 30 dk santrifüj tüpleri B ve B2 için % 10 etanol içinde yıkayın
      Not: Sodyum DNA daha kolay sodyum sitrat ve etanol, düşük hızlı Santrifüjü tarafından kaldırılacak kirleri izin acele yapma DNA omurga bağlar.
   4. 2.6.3. adımda açıklandığı gibi yıkama adımı yineleyin. Pelet 1,5 mL % 75 etanol resuspend ve upending tarafından zaman zaman karıştırma ile 20 dk için RT bırakın.
   5. Santrifüj 375 x g 4 ° C'de 5 min için de B ve B2 tüp
   6. Süpernatant atın ve 5-10dk için kurumasını bekleyin.
   7. 8 mM sodyum hidroksit 150 µL Pelet geçiyoruz. HEPES ile istenen pH için ayarlayın. 375 x g 4 ° C'de 5 min için örnek spin
   8. Bir micropipette kullanarak, süpernatant (DNA) için yeni bir tüp taşıyın. Konsantrasyonu ölçmek ve saflık bir Spektrofotometre kullanarak belirleyebilirsiniz. Kayıt absorbances 260 nm DNA yoğunlaşması ve herhangi bir yabancı maddeleri tanımlamak için 230 ve 280 nm.
7. Protein aşağıdaki gibi izole et.
   1. Protein çökelti için en fazla 1,5 mL % 100 isopropanol pembe süpernatant tüp C, birkaç kez, ters çevirme tarafından karışımı ekleyin ve RT 10 dakikadır kuluçkaya.
   2. Tüp C 13.500 x g 4 ° C'de 10 dakika için de santrifüj kapasitesi
   3. Süpernatant atmak ve Pelet ile 0,3 M guanidin hidroklorür 2 mL % 95 etanol RT. santrifüj Tube C 5300 x g 4 ° C'de 5 min için de 20 dakika yıkayın
   4. 2.7.3. adımda açıklandığı gibi yıkama adımı yineleyin 2 x.
   5. Yeni bir 1,5 mL tüp (tüp C2) protein Pelet taşıyın ve en fazla 1,5 mL % 95 etanol ekleyin. Girdap ve izin vermek için 20 dk RT otur.
   6. Tüp C2, 5300 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi Süpernatant atın ve RT. erime, 10 dk 60 dk 50 ° C'de % 5 SDS 300 µL Pelet Makinası Pelet izin.
      Not: Daha uzun bir kuluçka süresi tam protein Pelet dağıtılması gerekebilir. Geçmişte, pelet en fazla 6 saat için kalite ödün vermeden inkübe.
   7. Tüp C2 13.500 x g 17 ° C'de 10 dakika için de santrifüj kapasitesi Süpernatant için yeni bir tüp taşıyın.
   8. Deterjan ile uyumlu bir tercih edilen protein miktar tahlil kullanarak toplama ölçmek.
      Not: Protein Batı kurutma ve SDS-sayfa içinde kullanılmak üzere hazırdır. İleride kullanmak için-20 ° C'de depolanabilir. LC-MS/MS gibi diğer teknikleri için deterjan kapalı diyaliz gerekecektir.

3. mRNA ve Protein düzeyleri değerlendirilmesi

1. RT-qPCR
   1. 1 ters transkripsiyon cDNA hazırlayın ng RNA, aşağıdaki thermocycler iletişim kuralını kullanarak: 25 ° c (5 dk), ters transkripsiyon (20 dk 46 ° c) ve RT inactivation (95 ° C'de 1 dk) priming.
   2. CDNA hisse senedi bir tabak bir 96-şey plaka bireysel wells için her cDNA Örnek 1: 100 dilutions 100 µL ekleyerek getirin. Hiçbir şablon/su-sadece wells ve 1: 400 (tüm analiz örnekleri havuza alınan cDNA ile kökenli) 1:25 seri olarak seyreltilmiş numune uygun denetimler içerir astar verimlilik analiz her gen için kurmak standart bir eğri için izin vermek için.
      Not: Bu biçim bir RT-qPCR tabak bir tabak içinde tüm örneklerini aktarmak için ve iyi iyi pipetting varyasyonları azaltılması için sağlar 96-şey microdispenser ile kullanılabilir. Uygun ana mix (örneğin, SYBR + astar) her için de bundan sonra bir çok kanallı pipet ile eklenebilir. Genel olarak, bu yaklaşım el pipetting-her örnek, böylece daha fazla değişkenlik azaltarak zaman tanıttı hataları azaltır.
   3. CDNA 3 µL hisse senedi plaka RT-qPCR plaka wells için ekleyin.
   4. İleri ve ters astar ve örnek başına 7 µL su ana mix 1 x supermix bir DNA enterkalasyon siyanür boya, her 5 mikron içeren içerir astar kümelerine olun. 7 µL bir RT-qPCR plaka uygun kuyu ekleyin ve hafifçe karıştırmak için tahrik.
      Not: Sonuçları²⁰normalleştirmek için bir referans olarak kullanmak üzere temizlik genler ölçmek için örnekleri içerir.
   5. Kalenin kullanılan astar için uygun bir RT-qPCR protokolünü kullanarak çalıştırın.
2. Batı leke
   Not: Batı açıkları hakkında ayrıntılı bilgi için lütfen Mahmud ve Yang²¹' e bakın.
   1. Örnekleri ile eşit bir güç 2 x Laemmli örnek arabellek ve 95 ° c 10 dakika kaynatın protein 20 µg birleştirerek SDS-sayfa için hazır olun.
   2. Örnekleri % 4-% 15 Tris-glisin jel üzerine yük ve 1 h için veya alt jel boya açık ulaşıncaya kadar 150'den V çalıştırabilirsiniz.
   3. Proteinler jel 25 V 30 dk içinde bir semidry transferi aparatı için nitroselüloz membran aktarın.
   4. Uygun transfer membran ile Ponceau S leke boyama tarafından onaylayın.
   5. Iyice leke membran Tris arabelleğe alınmış serum (TBS) % 0,01 polysorbate 20 (TBS-T) ile yıkayın.
   6. Blok membran RT. 1 h için TBS-T % 5 yağsız süt ile
   7. Tedarikçinin öneriler göre uygun seyreltme, birincil antikor membran kuluçkaya. Gece 4 ° C'de rocker üzerinde bırakın.
   8. Membran 3 yıkama x 5 dk her, TBS-T. ile
   9. Tedarikçinin öneriler göre uygun seyreltme, uygun ikincil antikor membran kuluçkaya. Rocker RT. 1 h için açık bırak
   10. Membran 3 yıkama x 5 dk her, TBS-T. ile
   11. Görüntü ve tercih edilen yöntemler kullanarak Batı leke ölçmek.

RNA, DNA ve protein örnekleri analiz edildi ve RNA ve protein yalıtır kullanarak temsilcisi sonuçları burada sunulmuştur. Ayrıca, ortak RIPA lizis yöntemi22GTCp yöntemini kullanarak hasat protein örnek karşılaştırın. Deneyimiz için biz her WT (N2) solucanlar ve iki uzun ömürlü mutant solucanlar, yemek-2 ve rsks-123,24dört bağımsız çoğaltır kullanılır.

RNA ve DNA miktar ve kalite

Ne zaman su 50 µL içinde resuspended RNA konsantrasyonu arasında değişiyordu 0.2-2 den µg/µL, solucanlar gibi başlangıç materyali yaklaşık 3.000 yetişkin kullanarak. Saflık belirtmek, Absorbans oranları fenol veya guanidin hidroklorür gibi GTCp bileşenleri ile kirlenme olmadan RNA'ın çıkarma başarılı gösteren 2.0 2.2 için A260/A280 ve 1.9-2.5 A260/A230 (Tablo 1), için için arasında değişiyordu.

DNA ekstraksiyon başarılı oldu, ancak kalite değişken oldu. 1.1 µg/µL 0,04 değişiyordu NaOH 150 µL resuspended zaman DNA toplama. DNA'ın başarılı ayıklama gösteren 1.8 2.1 için A260/A280 ve 0,9-1.6 için değişiyordu (Tablo 1), A260/A230 için Absorbans oranları; Ancak, bazı örnekleri fenol veya guanidin hidroklorür gibi GTCp bileşenleri ile kontamine. DNA izolasyon gerekli ise, Orta tabaka GTCp faz ayrılması ayıran zaman bakım alınması gerekir ve daha fazla yıkamak gerekli olabilir.

RT-qPCR seçilen hedeflerin

Dört bağımsız örnekleri RNA izolasyonu her solucan baskı başarılı oldu ve RNAseq analiz için sonraki RT-siyanür boya içeren bir supermix kullanılarak yapılan qPCR ile gönderildi. RT-qPCR tarafından analiz hedefleri bir veri kümesinden yaygın olarak her iki mutantlar WT solucanlara kıyasla en differentially düzenlenmiş genler dayalı büyük RNAseq seçildi. F07C4.1225, homolog insan neuroligin 3, izoformu b, için Seçili paylaşılan upregulated hedef oldu. Biz de her iki mutantlar, mrp-126, yemek-2 kurt upregulated ama downregulated rsks-1 solucanlar, ek çözümleme arasında differentially düzenlenmiş bir gen dahil. Mrp-1 ' in ifade değişiklikleri RT-qPCR yolu ile teyit edildi; Ancak, rsks-1 solucanlar göre RNAseq analiz tahmin F07C4.12 upregulation RT-qPCR tarafından (şekil 1) görülen değildi.

Solucanlar için doğrulanmış antikorlar ile ek hedefleri de araştırıldı. Bu Hadwiger vd.27' karakterize birkaç organel işaretleri dahil. Bu işaretler bir dizi differentially mutant solucanlar mRNA düzeyinde ifade edildi. Şekil 1' de görüldüğü gibi lmp-128 ve dlg-129 upregulated yemek-2 solucanlar vardı; HSP-4 30, hsp-7030ve lmp-1 rsks-1 solucan upregulated vardı; HSP-60 31 ve pas-732 downregulated yemek-2 solucanlar vardı; HSP-60 ve tac-133 downregulated rsks-1 solucan vardı.

Eşzamanlı vs RIPA protein hazırlık

Yukarıda açıklandığı gibi GTCp yöntemi ile verimliliği ve protein kalitesini teyit için biz bu protein RIPA lizis22daha geleneksel yöntemi kullanarak toplanan göre. Malzeme, yani sadece yetişkin (yaklaşık 10.000 solucanlar) ya da yetişkin, larva ve yumurta (yaklaşık 130.000 solucanlar), karışık bir nüfusa başlayan aynı miktarda kullanarak GTCp ile toplanan genel miktarı daha az eşit son birimleri (Tablo 1 resuspended zaman oldu ); Ancak, bir salt yetişkin nüfus çıkarma nüfus daha başarılı oldu. Ayrıca, proteinlerin kalitesini benzer, de olsa GTCp çıkarılan protein daha iyi çözünürlüğe sahip toplam protein, eşit yükleme üzerine büyük proteinler Şekil 2Coomassie leke tarafından gösterildiği gibi gösterdi. Gerçekten de, şekil 3 western blot tarafından değerlendirilen hedefleri benzer düzeyleri çoğu durumda gösterdi; Ancak, 75 kDa büyük protein düzeyi düşük GTCp çıkarılan protein için (şekil 3A, sağ şeride; karşılaştırıldığında RIPA çıkarılan protein gösterdi Şekil 3B, sarı bar).

Burada sunulan ayıklama yöntemi Ayrıca memeli hücre satırı HeLa değerlendirilmiştir. Başvuru için RIPA ile altı milyon HeLa hücreleri (~ 25 µL pelet) kompakt bir Pelet çıkarılan protein miktarı solucanlar (bir ~ 75 µL kompakt pelet) bir 130.000 karışık popülasyondan ayıklanmış karşılaştırılabilir veya yaklaşık yarısı ne ayıklanır 10.000 Yetişkin solucanlar (bir ~ 100 µL yerçekimi yerleşmiş pelet), olarak görülen Tablo 1. Biz RIPA çıkarılan protein HeLa hücreleri, göre GTCp bu teknik daha iyi bir yetişkin nüfusu çalışıyor düşündüren protein ayıklama (Tablo 1) verimliliğini ve daha büyük proteinler (Şekil 2) çözünürlüğe azalma gösterir solucanlar. Protein Pelet HeLa GTCp çıkarılan protein üzerinden eksik solubilization memeli hücrelerinde bu yöntemin bir sınırlaması olabilir.

RT-qPCR tarafından analiz Immunoblotting hedefleri

Daha sonra biz mRNA düzeyleri protein düzeyleri ile ilişkili Eğer belirlemek için RT-qPCR tarafından test gen ürünlerinin protein düzeyleri araştırdık. Şekil 3' te görüldüğü gibi ortalama ifade değişiklikleri protein için birçok hedefleri değişti ortalama mRNA ifadeleri ile korelasyon; Ancak, bazı protein düzeyleri mRNA düzeyleri değişiklikleri yansıtmak değildir. Genellikle, yemek-2 solucanlar mRNA seviyelerinde daha fazla olan diğer suşların daha yüksek, ancak her iki aynı olduğunu veya aynı hedef diğer suşların düşük protein düzeyleri. Dlg-1 çok yüksek düzeyde en önemli gözlemin mRNA daha fazla protein; çevirmek değil yemek-2 solucanlar Aslında, ne zaman diğer suşları için (şekil 3) göre daha düşük dlg-1 protein düzeyleri vardı.

Son olarak, GTCp çıkarılan protein ve RIPA çıkarılan protein düzeyleri çarpıcı bir farklılık göstermiştir. RNA her ikisi için aynı şekilde ayıklandı; Ancak, özellikle için o 75 kDa (şekil 3A, sağ şeride; büyük protein düzeyleri, belirgin gösterdi RIPA lizis tarafından toplanan benzer ama ayrı örnek azaltılmış Şekil 3B, sarı bar).

İntrasample mRNA ve protein düzeylerinin karşılaştırılması

Bu iletişim kuralı amaçlarından biri de değişim mRNA gördüğümüz ve protein seviyesini gerçekti, yoksa bu intersample varyasyon bir obje olabilir belirlemek için yapıldı. Şekil 4' te, bir alt hedefler içinde tek örnekler karşılaştırıldı. Tek tek her örnek aynı gölge ve renk örneği 1 en koyu gölge ve örnek 4 en hafif gölge gri (WT), mavi (ye-2) veya kırmızı (rsks-1) varlık ile nokta olarak gösterilir. Çoğu örnekleri içinde mRNA düzeyleri düşük bir değişkenlik büyük değişkenlik protein düzeyinde bir açığı Batı lekesi semiquantitative analizi ile vardı. Her bir renkli noktalar mRNA ve protein çiftleri arasındaki konumunu bakıldığında, yüksek-için-en düşük sırasını kez aynı değil; Örneğin, WT içinde 4, örnek hsp-60 mRNA sipariş edildi 3, 2, 1, ama protein düzeyleri vardı 1, 2, 3, 4. Böylece, kesinlikle bir örnek içinde mRNA ve protein düzeyleri arasında farklılıklar var, ama koleksiyon gözlenen fark olası bir kaynak olarak zaman kaldırmak için kullanıcılara sunulan yöntem sağlar.

Tablo 1: konsantrasyonları ve emme oranları. RNA ve DNA konsantrasyonları ve saflık oranları bir Spektrofotometre üzerinde ölçüldü. Protein konsantrasyonları Renkölçer protein miktar tahlil kullanılarak belirlenmiştir. Gri, mavi ve kırmızı RT-qPCR ve western blot için kullanılan örnekleri vurgulayın. Sarı RIPA protein çekme ya da solucan protein HeLa protein GTCp karşılaştırmak için kullanılan örnekleri gösterir. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Şekil 1: gen ekspresyonu tarafından RT-qPCR. RT-qPCR analiz RNAseq verilerden ve organel marker gen tespit hedefleri teyit bu yöntemle elde edilen mRNA için. Hata çubuklarını temsil eden standart sapma; n = 4. MRNA konsantrasyonu astar her kümesi için standart bir eğri karşı tanımlanmıştır. Tüm mRNA düzeyleri ortalama altı temizlik genler Yasası-1, cdc-42, ama-1, nhr-23, pmp-3ve cyn-1başvuru genler kullanılan bir dizi için normalleştirilmiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: karşılaştırma GTCp-solucanlar ve HeLa hücreleri protein RIPA ayıklanır karşı. Vahşi-tipi (WT) solucan veya GTCp veya RIPA lizis yöntemi, SDS-PAGE tarafından ayrılmış ve ile Coomassie mavi lekeli ile hasat HeLa hücreleri toplam protein. Her lane 25 µg toplam protein içerir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: Protein düzeyleri solucanlar. (A)Western blot hedeflerinden RT-qPCR ve (B) Dansitometresi analiz için sinyal yoğunluğu tarafından araştırıldı. Her lane 20 µg vahşi-tipi (WT), yemek-2veya rsks-1 mutant solucanlar toplam GTCp çıkarılan protein içerir. Görüntü gösterilen dört bağımsız çoğaltır solucan zorlanma başına bir gösterimidir. Β-aktin (alt) denetimine her hedef için eşit yükleme için kullanılan; yalnızca bir temsilci kümesi gösterilir. Sağ şeride 20 µg rsks-1 mutant solucanlar gelen toplam RIPA çıkarılan protein içerir. (B) sorumlu sinyal yoğunluklarda sayısal ImageJ kullanarak. Hata çubuklarını temsil eden standart sapma; n = 4. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: Intrasample mRNA ve protein düzeyi karşılaştırması. Bir alt kümesindeki her zorlanma için hedefleri bireysel örneklerinden mRNA ve protein düzeyleri hizalanır. Tablo 1temsilcisi rengidir. Gri/siyah WT mavi yemek-2ve kırmızı rsks-1. mRNA ve protein aynı hedef yan yana eşleştirilmiş ve nematodunun zorlanma tarafından ayrılmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Yazarlar ifşa gerek yok.