İzoleli Malignant ve sigara-Malignant B hücreleri lck:eGFP Zebra balığı

Özet

Transgenik lck:eGFP Zebra balığı GFP son derece T lenfosit hızlı ve T hücre gelişimi ve Akut lenfoblastik lösemi çalışmaya kullanılmıştır. Bu satırı lck daha alt düzeylerde hızlı çalışma B hücreleri için kullanılabilir. Bu iletişim kuralı arıtma lck:eGFP Zebra balığı kötü huylu ve kötü huylu olmayan B hücre açıklar.

Özet

Zebra balığı (Danio rerio) lenfosit geliştirme eğitim için güçlü bir model vardır. Memeliler gibi D. rerio B ve T lenfositleri içeren bir adaptif bağışıklık sisteminin sahip. D. rerio hücre yüzey işaretleyicileri tanıma antikorlar genellikle yalıtım ve karakterizasyonu B lineage dahil olmak üzere farklı lenfosit nüfusun karmaşık hale getiren, olmaması nedeniyle Zebra balığı lymphopoiesis çalışmaları zor hücreleri. Transgenik satırları lineage özgü fluorophore ifade ile sık sık bu zorluğu aşmak için kullanılır. Transgenik lck:eGFP satırı D. rerio T hücre gelişimini incelemek için kullanılan ve aynı zamanda modeli T hücre gelişimi ve Akut lenfoblastik lösemi (T-ALL) kullanıldığında vardır. LCK:eGFP balık yaygın olarak T-lineage çözümlemek için kullanılan olsa da, bunlar B hücreleri çalışmaya kullanılmıştır değil. Son zamanlarda, birçok Zebra balığı B hücreleri de lck, hızlı da olsa daha alt düzeylerde keşfettik. Sonuç olarak, lck:eGFP B hücreleri aynı şekilde GFP seviyesinin düşük hızlı. Bu bulgu üzerinde bağlı olarak, biz burada rapor lck:eGFP Zebra balığı B lineage hücrelerden arındırmak için bir protokol geliştirdik. Bizim yöntem lck:eGFP balık veya çift transgenik rag2:hMYCgibi ilgili satırları B hücreleri arındırmak için bir floresan aktif hücre sıralayıcısı (FACS) kullanmak açıklar; LCK:eGFP balık. Bu satırları, B hücreleri, özellikle olgunlaşmamış B hücreleri, düşük ama algılanabilir seviyede hızlı GFP GFP son derece hızlı T hücrelerden ayırt edici olmalarını sağlar. B hücreleri kemik iliği, timus, dalak, kan veya diğer dokularda ayrılmış olabilir. Bu iletişim kuralı D. rerio B hücreleri, B hücre gelişimi ve B lenfosit maligniteler gibi konular üzerinde duruldu çalışmalar etkinleştirme arındırmak için yeni bir yöntem sağlar.

Giriş

Zebra balığı genetik yaklaşımlar kullanarak eğitim omurgalı geliştirme kolaylaştırmak güçlü öznitelikleri genetik manipulability, yüksek verimlilik, optik kalınlığı ve hızlı bir gelişme gibi sunuyoruz. Teleost ve memeli hematopoiesis, paylaşılan özellikleri ile birlikte bu avantajları D. rerio larva yetişkinlik boyunca erken kendi görünümünü gelen lymphopoiesis ve lenfosit fonksiyon içinde vivo analizleri için ideal kılar. Zebra balığı kan geliştirme memeliler ile paylaşılan iyi korunmuş genetik işlemleri üzerine dayanır ve bunlar edinilmiş bağışıklık sistemi genişletmek. Ayrıca, moleküler mekanizmaları lenfoid geliştirme yöneten Zebra balığı ve memeliler

Protokol

Zebra balığı içeren tüm yordamları kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Oklahoma Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi tarafından kabul edildi.

1. Non-Malign B ve T lenfositleri transgenik lck:eGFP balık izole

1. %0,02 tricaine (MS-222) Balık sistem su kullanarak balık anestezi.
2. Zebra balığı ve diğer teleosts¹⁴bransiyal boşluğuna dorsomedial yönü de bulunan 2-6 ay eski balık floresan thymi için inceleyin. Bir epifluorescence mikroskobu (470/40 uyarma dalga boyu ve 525/50 emisyon filtre) GFP algılamak için kullanın.
3. Önceden filtre sterilize 1 Roswell ....

Sonuçlar

Biz analiz etmek için Akış Sitometresi ve FACS GFP^lo ve GFP^Merhaba hücrelerden timus, böbrek kemik iliği ve dalak lck:eGFP transgenik Zebra balığı, izole etmek için kullanılır. 3 aylık balık analizini timus çoğunlukla GFP⁺ lenfosit içerdiği ortaya koydu. GFP⁺ hücreler büyük ölçüde lenfoid kapıyı Traver vd.¹⁷tarafından daha önce açıklanan sınırlı. İki ayrı GFP⁺ nüfus, GFP^love GFP^{Merhaba<.......}

Tartışma

Biz gelişmiş ve bu B-lineage etiketleri^3,4ile diğer D. rerio modeller ekleme lck:eGFP transgenik Zebra balığı, B hücreleri izole etmek için bir protokol sağlar. Biraz şaşırtıcı, GFP^lo B hücreleri bu satırdaki tanımlaması açıklamasını 2004 yılında beri gözden kaçmış gitmiş. Genel olarak, lck T hücre özgü⁶olarak kabul edilir, ama beklenmedik lck ifade doğal öldürücü ve myeloid de

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
35 ve mikro; m mesh	Sefar Filtre teknolojisi	7050-1220-000-13
5 mL Polistiren yuvarlak-Hücre süzgeç kapaklı alt tüp	Falcon Corning Marka	352235
50 mL konik tüp	VWR uluslararası	525-0448
AZ APO 100 Floresan mikroskop	Nikon
Cytoflex	Beckman Coulter
DS-Qi1MC camara	Nikon
Etil 3-aminobenzoat metansülfonat; MS-222	Sigma	E-10521
FACSJazz	BD Biosciences
Fetal sığır Serumu	Thermo Fisher	10437028
FlowJo v10.2	FlowJo, LLC
lck:eGFP			Bkz. Langeneu ve diğerleri, 2004
NIS Elements yazılımı	Nikon	Sürüm 4.13
Penicilin-Streptomisin	Sigma	P4333
Havaneli mikro tüp homojenizatörler	Elektron Mikroskobu Bilimleri	64788-20
Plastik Transfer pippetes
rag2:hMYC-ER			Bkz. Gutierrez ve diğerleri, 2011
RPMI Media 1640 1x	Yaşam Teknolojileri	11835-030