Bir roman insan epitel Enteroid nekrotizan enterokolit modeli

Özet

Enteroids insan hastalık insan yeni bir model olarak ortaya çıkıyor. Protokol insan nekrotizan enterokolit yenidoğan dokusundan üretilen enteroids tedavisinde lipopolysaccharide (LPS) kullanarak bir enteroid modeli benzetimi açıklar. Toplanan enteroids benzer-e doğru o insan nekrotizan enterokolit görülen iltihabi yapılan değişiklikleri göstermektedir.

Özet

Enterokolit Nekroze edici (NEC), yeni doğan bebeklerin yıkıcı bir hastalıktır. Artan bağırsak geçirgenliği için önde gelen insan bağırsak epitel içinde birden çok Etyopatogenezi değişiklikler ile karakterize, restitüsyon engelliler ve hücre ölümü arttı. NEC çok sayıda hayvan modelleri olmakla birlikte, yaralanma ve tedavi müdahaleler karşısında türler arasında son derece değişken olabilir. Ayrıca, hastalık patofizyolojisi veya insan denekler, özellikle çocuklar doğrudan roman terapötik ajanlar çalışmaya etik meydan okuyor. Bu nedenle, insan dokusu kullanarak NEC yeni bir model geliştirmek için son derece arzu edilir. Enteroids bağırsak epitel hücrelerinden elde edilen 3 boyutlu organoids vardır. Karmaşık fizyolojik etkileşimleri, hücre sinyallemesi ve ana bilgisayar-patojen savunma çalışma için idealdir. Bu el yazması biz o kültürlerin insan enteroids bağırsak rezeksiyonu geçiren hastaların bağırsak kök hücreleri izole sonra bir iletişim kuralı tanımlamak. Crypt hücre farklılaşması çeşitli hücre türleri yerli bir insan bağırsak epitel içine teşvik büyüme faktörleri içeren medya kültürlü. Bu hücreler ekstra hücresel membran taklit eden bir iskele hizmet proteinler kolajen, sentetik karışımı yetiştirilmektedir. Sonuç olarak, enteroids demiri apikal polarite geliştirmek. Lipopolysaccharide (LPS) medya ortak yönetim enteroids, histolojik, genetik için önde gelen ve protein ifade değişiklikler bu insan NEC görülen benzer bir enflamatuar yanıt neden olur. Biz bu hastalık için bir tedavi tanımlamak için çalışıyoruz gibi insan dokusu kullanarak NEC deneysel bir model uyuşturucu ve insan denemeler önce test tedavi için daha doğru bir platform sağlar.

Giriş

İnsan enteroids olan ex vivo 3 boyutlu kültür sistem kök hücreleri insan intestinal doku örnekleri bağırsak kriptalarının izole. Bu çığır açan model 2007 aşağıdaki fareler¹bağırsakta kriptalarının, Lgr5 + kök hücre keşfi Hans Clevers vd tarafından öncülük. İşlerini eski bir kurmak için temeli atıldı vivo bağırsak epitel kültür önemli genetik veya fizyolojik değişiklikler²olmadan passaged birden çok hücre tiplerinin. Keşfinden bu yana enteroids, normal sindirim fizyolojisi ve inflamatuvar barsak hastalığı, ana bilgisayar-patojen etkileşimleri ve rejeneratif tıp²gibi bağırsak hastalıkları Patofizyoloji çalışmaya yeni bir model olarak kullanılmıştır.

Kullanım eski bir olarak enteroids in vivo modeli bağırsak patofizyolojisi incelenmesi için alternatif teknikleri üzerinde birçok avantajı vardır. Son birkaç on yıl için hayvan modelleri ve ölümsüzleştirdi bağırsak kanseri türetilmiş hücre hatları bağırsak fizyolojisi^3,4,5eğitim için kullanılmaktadır. Tek hücre kültürleri böylece hücre-hücre çapraz-hadis ve segment-özgüllük protein ifade, sinyal ve patojen kaynaklı hastalık⁶eksik hücre tipleri içinde normal bağırsak epiteli, mevcut çeşitliliği temsil etmemektedir. Enteroids kök hücre Binbaşı epitel hücre tipleri enterositler, Paneth hücreleri, goblet hücreleri, enteroendocrine hücreleri ve daha fazla³gibi ayırt etmek. Onlar polarite sergi, epitel taşıma iþlevlerini ve bağırsak segment özgüllük⁶için izin. Enteroids insan bağırsak epitel birden çok hücre türleri özetlemek beri onlar kanser hücre tabanlı sistemler tanınan bu sınırlamayı aşmak mümkündür. Zamanla, hücre hatları türevleri subcloned ve protein ifade ve Yerelleştirme³daha fazla çeşitlilik gösteren gelişmeye. Aksine, enteroids önemli genetik veya fizyolojik değişiklikler²olmadan passaged. NEC için çok sayıda hayvan modelleri mevcut olmasına rağmen yaralanma ve tedavi müdahaleler karşısında türler arasında son derece değişken olabilir. Bu sınırlamalar bir sonucu olarak, hayvan modellerden elde edilen tedavi başarısız zaman % 90 toksisite veya etkinliği³farklılıkları nedeniyle insan çalışmalarda test edilirken. Enteroids daha iyi bir karmaşık bağırsak patofizyolojisi ve bu nedenle, daha fazla anlayış için önde gelen bu yetersizliklerin üstesinden gelebilir umut verici önceden klinik modelleri hizmet başarılı ve uygun maliyetli tedavi yenilikler. Biyolojik açıdan önemli⁷yaşında bir enteroid kaynaklandığı doku kalır son kanıtlar da vardır. Enteroids böylece NEC ile hastaların fizyolojik alaka Bakımı, Yenidoğan dokusundan üretilen bu yana bu modelimiz için özellikle önemli bir ayrıntı var.

Enteroids yardımcı programı gibi modelleri insan hastalıkların tedavileri şiddetli ve yaygın koşullarına inanışı genişletmeye devam ediyor. Enterokolit Nekroze edici (NEC) tarafından bağırsak nekroz ile karakterize ventilasyon yıkıcı bir bağırsak hastalığı ve sık sık için bağırsak duvarı, septisemi ve ölüm⁸delikli açar. NEC karmaşık ve multifaktöriyel Patofizyoloji nedeniyle hastalığın kesin mekanizması henüz tam aydınlatılmamıştır değil; Ancak, artan bağırsak geçirgenliği açıkça hastalık süreci⁸' karıştığı olmuştur. Verilen, NEC ve potansiyel terapötik ajanlar insan denekler, özellikle çocuklar etik meydan okuyor, bu insan yenidoğan dokusu kullanarak NEC biyolojik ilgili enteroid modeli kullanmak için son derece arzu edilir. Şimdiye kadar enteroids NEC çalışmada sınırlı bir role sahip. Bu iletişim kuralı ex vivo modeli nekrotizan enterokolit çalışma için bir roman olarak insan bağırsak dokusu örneklerinden elde edilen enteroids açıklar.

Protokol

Kurumsal inceleme kurulu onayı (IRB #2013-15152) elde edilen bağırsak rezeksiyonu Ann ve Robert H. Lurie Çocuk Hastanesi, Chicago, Chicago, Il geçiren hastaların doku örnekleri topluluğu için. Tüm iletişim kuralları kurumsal ve ulusal kurallara ve düzenlemelere insan refahı için uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Yazılı bilinçli ebeveyn onayı gerekli ve örnek koleksiyon her durumda önce elde.

1. reaktif hazırlık

1. Bütün dokusu toplamalarında kültür medya hisse senedi çözüm hazırlamak: 1 L, Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM), 110 mL, Fetal sığır Serum (FBS), 11 mL penisilin-streptomisin (son konsantrasyonu % 1) ve 1.1 mL filtre sterilize insülin (son konsantrasyonu % 0.1.) Hisse senedi çözüm 4 ° C'de depolayın
2. Chelating arabellek #1 hazırlamak: Kültür ortamının, (1. 1'de açıklandığı gibi) 30 mL 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) 600 µL (son konsantrasyonu 10 mM), 300 µL gentamisin (son konsantrasyonu % 1) ve Amfoterisin b (son konsantrasyonu % 0,2) 60 µL. Hisse senedi çözüm 4 ° C'de depolayın
3. Chelating arabellek #2 hazırlamak: Kültür ortamının, (1. 1'de açıklandığı gibi) 30 mL 0.5 M EDTA (son konsantrasyonu 5mM), 300 µL gentamisin (son konsantrasyonu % 1), 300 µL ve Amfoterisin b (son konsantrasyonu % 0,2) 60 µL. Hisse senedi çözüm 4 ° C'de depolayın
4. İnsan Minigut ortam hazırlamak: 41.4 mL DMEM/F-12, 5 mL FBS (son %10), penisilin-streptomisin (son konsantrasyonu % 1), L-glutamine (son konsantrasyonu % 1), gentamisin (son konsantrasyonu % 1), amfoterisin b (final 100 µL 500 µL 500 µL 500 µL konsantrasyonu % 0,2), 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sülfonik asit (HEPES) 500 µL (son konsantrasyonu 10 mM), N-2 100 x 500 µL ek ve 50 x 1 mL B-27 ilave Vitamin A toplam hacmi 50 mL için. Hisse senedi çözüm-20 ° C'de depolayın
5. İnsan Minigut medya tam hazırlayın: 10 mL insan Minigut medya (hazırlanan 1.4), 10 µL 100 µg/ml Wnt3a (son toplama 100 ng/mL), 100 µg/ml kafa (son toplama 100 ng/mL), 1 mg/ml R-Spondin 10 µL 10 µL (son konsantrasyonu 1 µg/mL) , 500 µg/ml Epidermal büyüme faktörü (EGF) (son konsantrasyonu 50 ng/mL), 1 10 µL 10 µL M N-Acetylcysteine (son konsantrasyonu 1 mM), 10 µL 10 mm Y-27632 (son konsantrasyonu 10 µM), 10 µL 500 µM A-83 (son konsantrasyonu 500 nM), 10 mm SB202190 (son 10 µL konsantrasyonu 10 µM), 1 M Nikotinamid 100 µL (son konsantrasyonu 10 mM) ve 100 µM [Leyi] 15-gastrin 1 (son konsantrasyonu 10 nM) 1 µL. Toplam hacmi 10 mL. Hisse senedi çözüm 4 ° C'de depolayın
   Not: Çözümler 48 saat içinde kullanılmalıdır.

2. crypt yalıtım ve kaplama bütün dokusundan

1. Operatif paketindeki toplanması sırasında insan küçük bağırsak doku örneği soğuk Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS içinde) yerleştirin. Örnek içinde soğuk DPBS kadar dışkı ve kan temiz yıkayın. Numune 4 ° C'de crypt yalıtım için hazır kadar RPMI 1640 ortamda depolayın.
   Not: Doku daha 24 h depolanamaz.
   1. Numune kan ve dışkı açık olduğundan emin olun. Hassas diseksiyon makası kullanarak herhangi bir aşırı yağlı veya cerrahi klipleri/zımba vb kaldırın. Numune tartın.
      Not: Bir parça yaklaşık 0,75-2,5 g nişan al.
2. Numune 0.5 cm parçalar halinde kesilmiş ve tampon #1 şelat 30 mL (1.2 adımda hazırlanan gibi) yer.
   1. 4 ° C'de 15 dakika düşük hızda sallamak
   2. Doku 100 µm hücre süzgeç aracılığıyla filtre ve akışı aracılığıyla atın.
3. Doku şelat arabellek # 2 30 mL (Adım 1.3 hazırlanırken) ekleyin.
   1. 4 ° C'de 15 dakika düşük hızda sallamak
   2. Doku 100 µm hücre süzgeç aracılığıyla filtre ve akışı aracılığıyla atın.
4. Membran matris kullanılmak üzere adım 2.8 buzda 500 mL çözülme.
5. Soğuk DMEM 50 mL konik tüp 10 mL doku eklemek ve el 10 tarafından şiddetle çalkalanır s.
   1. 100 µm hücre süzgeç aracılığıyla filtre ve (etiket #1) aracılığıyla akış toplamak. Tüp #1 buz üzerinde tutun.
   2. Başka bir 10 mL soğuk DMEM ayrı 50 mL konik tüp içinde doku eklemek ve el 10 tarafından şiddetle çalkalanır s.
   3. 100 µm hücre süzgeç aracılığıyla filtre ve akış (etiket #2) toplamak.
   4. Dört konik tüpler (etiketli tüpler #1-4) ile akışı ile olana iki ek kere tekrar edin.
6. Filtre #1 solution'ı bir 100 µm hücre süzgeç ve aktarım akış 15 mL konik tüp (etiket #1) içine tüp. #2-4 için yineleyin.
   1. 15 mL tüpler #1-4'te 200 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi
7. Laminar akış başlıklı süpernatant tüpler #1-4 kaldırmak ve atın. Bazı süpernatant geride bırakarak anlamına gelse bile bulut hemen üstündeki Pelet doku engellemeden kaçının.
   1. Yavaş yavaş pipetting tarafından Pelet artık #1-4 tüplerde süpernatant ile karıştırın.
   2. Karışım tüpler #1-4 bir tek 2 mL konik tüp içine aktarın.
   3. Konik tüp vasıl 200 x g 4 ° C'de 20 dk santrifüj kapasitesi
8. Süpernatant kaldırmak ve Pelet membran matris 500 µL içinde yeniden askıya alma.
   Not: membran matris buz üzerinde sürekli ve hızlı bir şekilde çalışmak için sonraki adımlar. Bu ürün çok hızlı bir şekilde oda sıcaklığında polymerizes.
   1. Numune/Bodrum membran matris süspansiyon 50 µL 24-şey plaka bir kuyuda ortasına uygulayın. Bu kubbe seklinde görünmesi gerekir.
      Not: Soğutulmuş pipet ipuçları kullanımını polimerizasyon en aza indirerek daha düzgün aktarımda süspansiyon, yardımcı olur.
   2. 10 toplam wells doldurmak için 9 kere tekrar edin.
9. 24-şey plaka 37 ° C, % 5 CO₂ kuluçka polimerizasyon izin vermek 30 dakika yerleştirin.
10. Bir insan Minigut medya (1.5 adımda hazırlanırken) tam 500 µL her şey için ekleyin. Yerine 2 günde.
11. Enteroids 5-10 gün sonra ne zaman tomurcuklanan görselleştirildiği, toplamak. Adımları 4 ve 5 koleksiyonu yönergeler için bkz:.

3. indüksiyon deneysel NEC

1. 5 mg/mL lipopolysaccharide (LPS) 10 µL 500 µL insan Minigut medya (1.5 adımda hazırlanırken) tam her iyi bir gün 0 ekleyin. 2 günde koleksiyonu kadar değiştirin.

4. parafin katıştırma için hazırlık

1. Medya yavaşça çıkarın.
   1. PBS 1 mL ekleyin ve hafifçe yukarı ve aşağı membran matris enteroids koşullar değil özenle çözülmeye pipet.
   2. PBS/enteroid karisimin santrifüj kapasitesi < 300 x g cips ve PBS kaldırmak 5 min için.
2. 1s için oda sıcaklığında düzeltmek için %4 paraformaldehyde ekleyin.
3. Santrifüj kapasitesi < 300 x g cips ve PBS kaldırmak 5 min için.
   1. Yıkama yavaşça 1 mL PBS ve, santrifüj kapasitesi < 300 x g cips ve PBS kaldırmak 5 min için.
   2. 4.3.1 arasındaki adımları yineleyin.
4. Konik bir tüp içinde istenilen miktarda yerleştirip sıvı kadar bir kuru banyo kuluçka 65 ° C'de 3-10 min için Isınma jel (yaklaşık 300 µL) işleme doku yeterli hacim eritebilir.
   1. Jöleye Pelet işleme doku ekleyin ve karışımı yavaşça.
   2. Bir coverslip küçük bir klonlama halka yerleştirin.
   3. Jel ve enteroid karışımı coverslip monte edilmiş bir klonlama halka içine işleme doku pipette.
5. 1s için 4 ° C'de kuvvetlendirmek için jel ve enteroid karışımı işleme doku sağlar.
   1. Klonlama yüzük katılaşmış karışımı ile % 70 etanol parafin katıştırma için hazırlık içine daldırın.

5. Enteroid koleksiyonu için RNA ve Protein çıkarma

1. Yavaşça insan Minigut medya tam her kuyudan çıkarın.
2. 1 mL PBS ekleyin ve hafifçe yukarı ve aşağı membran matris çözülmeye pipet. Enteroids ayırmak değil dikkatli olun.
   1. PBS/enteroid karışımı bir steril 2 mL konik tüp içine yerleştirin.
   2. Santrifüj kapasitesi < 300 x g cips 5 min için.
   3. PBS, dikkat çekici enteroids değil çıkarmak için yavaşça çıkarın.
3. Adım serisi 5.2 iki kez daha tekrarlayın.
4. Protein ve/veya RNA ayıklama için hazır kadar-80 ° C'de dondurmak.
5. Gen ifade ve protein izole edilmesi enteroids köklü qRT-PCR ve Western Blot teknikleri kullanarak gerçekleştirin.

Sonuçlar

Hemen sonra kaplama, taze izole bağırsak kriptalarının uzun çubuklar görüntülenir. Saat içinde bir yuvarlak görünüşüne (şekil 1bir) enteroid alacak. Önümüzdeki birkaç gün boyunca, enteroids küre Resim 1bgörüldüğü gibi şekillendirme başlar. Tomurcuklanma (şekil 1c) 5-10 gün arasında oluşması ve enteroid koleksiyonu o zaman olmamalıdır.

Tartışma

Bu roman ex vivo insan bağırsak enteroid modeli bağırsak bariyer disfonksiyonu Nekroze edici enterokolit (NEC) içinde çalışma için yararlı bir yöntem olarak hizmet vermektedir. Burada sunulan enteroid işleme yöntemleri Drs. Misty iyi, Michael Helmrath ve Jason Wertheim^10,11,12önceki işten uyarlandı.

Ayrıntılar tüm çevreleyen doku toplama ve zamanlama crypt yalıtım bu protokolündeki kritik adım vardır....

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
%4 Paraformaldehit	ThermoFisher	AAJ19943K2
A-83	R& D Tocris	2939/10
Amfoterisin B	ThermoFisher	15290026
B-27 takviyesi eksi A Vitamini	ThermoFisher	17504-044
Bodrum Membran Matrisi (Matrigel)	Corning	CB-40230C
DMEM/F-12	ThermoFisher	MT-16-405-CV
Dulbecco' s Modifiye Eagle Orta (DMEM)	ThermoFisher	11-965-118
Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Salin (DPBS)	ThermoFisher	14190-144
Epidermal Büyüme Faktörü (EGF)	Sigma	E9644-.2MG
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)	Sigma	EDS-500G
Fetal Sığır Serumu (FBS)	Gemini Bio-Pro	100-125
Gentamisin	Sigma	G5013-1G
GlutaMAX ( L-glutamin)	ThermoFisher	35050-061
İnsülin	Sigma	I9278-5mL
[leu] 15-gastrin 1	Sigma	G9145-.1MG
Lipopolisakkarit (LPS)	Sigma	L2630-25MG
N-2 takviyesi	ThermoFisher	17502-048
N-2-hidroksietilpiperazin-N-2-etan sülfonik asit (HEPES)	ThermoFisher	15630-080
N-Asetilsistein	Sigma	A9165-5G
Nikotinamid	Sigma	N0636-100G
Noggin	R& D Systems INC	6057-NG/CF
Penisilin-Streptomisin	ThermoFisher	15140-148
Fosfat Tamponlu Salin (PBS)	Sigma	P5368-5X10PAK
RPMI 1640 Orta	İnvitrojen	11875093
R-Spondin	PEPROTECH INC	120-38
SB202190	Sigma	S7067-5MG
Doku İşleme Jeli (Histogel)	ThermoFisher	22-110-678
Wnt3a	R& D Sistemleri A.Ş	5036-WN-010
Y-27632	Sigma	Y0503-1MG

.