Bu çalışmada kullanılan fareler travma yönergelere uygun olarak günlük bakım ötenazi hayvanlar için alınan: 2013 Edition16. Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Wisconsin-Madison Üniversitesi değerlendirildi ve proje başlamadan önce bu deneysel protokol onayladı.
1. hayvanlar
- Yaklaşık 350 gr ağırlığında outbred Sprague-Dawley erkek rats kullanın.
2. hazırlık, kemik morfogenetik Protein-2 (rhBMP-2) batırılmış sünger iskele
Not: İskele hazırlık femur implantasyon hemen önce gerçekleşmesi gereken (bkz. Adım 6,14).
- Kollajen sünger, liyofilize rhBMP-2 ve sulandırma17için steril su içeren bir kurulan rhBMP-2 kemik greft kit kullanımı için üreticinin yönergelerini izleyin. Kısırlık Bakımı, rhBMP-2 için bir konsantrasyon 1.5 mg/mL steril su ile yeniden oluşturma.
- Steril makas ve steril bir cetvel, 5 mm x 3 mm x 3 mm kusur sığacak şekilde yeniden şekillendirmek için rhBMP-2 sırılsıklam kollajen sünger gelene dek kırpın.
- Böylece bu emilir kullanarak, rhBMP-2 çözüm kollajen sünger üzerinde eşit olarak dağıtabilmenizi.
3. özel eksternal fiksasyon aygıt hazırlanması
Not: 1A rakam boyutları daha tam listesi için bkz.
- Alüminyum levha stok (türü 6061, 0,088" kalınlığı) 2-kesilmiş parçalar (1.4" x 6") bir Yapboz veya diğer uygun aracı kullanarak.
- Freze makinesi tek parça monte ve bir 1/8" 90 °-nokta karbür matkap değirmen kullanılarak, dört 'V' grooves (0.035" derin) kesme boyuna. Diğer parça keser özgür bırakın.
- Genişliğinin 0.3" iki bireysel plakalar kesilmiş parçalar (şekil 1B). Ölçü ve Matkap üzerindeki vida delikleri 4-40 iş parçacığı için. 4-40 iplik ile 'V' yivli plaka dokunun. #4 vida vücut tatbikat oluklar olmadan plaka matkap.
- Köşeleri yuvarlak ve ağırlığı (şekil 1 c) azaltmak için iki adet kum.
- Oluklar düz plaka (şekil 1 d) karşı aynı hizada olması ile birlikte 4-40, 18-8 paslanmaz çelik düğmesini baş cap vidaları (0,25") adet vida
4. anestezik yordam ve Analjezi
- Anestezi indüksiyon Odası 4 L O2/min ile % 4 isoflurane teslim fareyi yerleştirerek neden.
Dikkat: Araştırma personeli anestezik gaz zehirlenmesinden önlemek ve uygun başlık ve havalandırma Laboratuvarı korumak gerekir.
- Fareyi iyileştiren refleks kaybeder sonra fareyi odasından kaldırın, burun konisi eklemek ve idame dozu anestezi (O2 teslim oran için 2-3 L/dak ve % 0,8 isoflurane) burundan yerleştirin.
- Fareyi Isıtma yastığını veya hipotermi önlemek için Isınma ışık altında ekleyin.
- Anestezi yeterli derinliği parmak pinching veya palpebral refleks testi onaylayın.
- Yağlama gözleri kornea dışarı kurutma önlemek için geçerlidir.
- Genişletilmiş sürüm buprenorfin (1 mg/kg) bir subkutan enjeksiyon gövde/patolojisi analjezi sağlamak ilâ 3 gün boyunca ameliyatı takiben cerrahi siteye, uzakta sıçan sunmak.
5. aseptik hazırlık ve antibiyotik preventatives
- 13inci kaburga, ayak, dorsal orta hat ve ventral orta hat kenar boşluklarını kullanmak hindleg çevresini tıraş.
- Traş fırçalayın alanı % 10 povidone-iyot % 70 oranında takip ile batırılmış steril 2 x 2 gazlı bez kullanarak alkol (4 kez her biri, alternatif).
- Sülfadiyazin (20 mg/kg) bir kas içi enjeksiyon içine operatif kuadriseps yönetmek.
- Enrofloksasin (0.25 mg/ml) içme suyunda postoperatively sürekli antibiyotik koruma için 7 gün için yönetmek.
- Fareler PIN yolu enfeksiyonları önlemek için çalışma süresi için tıbbi besleme (örneğin, Uniprim) yerleştirin.
- Çift Kişilik antibiyotikli bir krem cilt-pin arabirim için bir kez her gün postoperatively 3 gün boyunca geçerlidir.
Not: herhangi bir harici fiksasyon PIN önlemek veya hangi enfeksiyon gelişmesine katkıda bulunabilir gevşeme kelepçe.
6. cerrahi müdahale
Not: uyumlu bir çaba bir steril alan ve çalışma alanı korumak ve steril tekniği kasanın tamamı boyunca takip edin.
- Delikli, açık yapışkan örtüsü ve steril bir alan oluşturmak için steril havlu kapak cerrahi tezgah traş bacak uzatmak.
- Uyluk kemiği muayene et ve proksimal femur, büyük trochanter patella uzanan deri yoluyla anterolateral kesik oluşturmak için #15 bıçak kullanın.
- Dikkatle yanal bacak fasya yanal uyluk maruz kadar vastus okuli kas kuadriseps, anteriorly hamstrings özafagusu ayırmak için intermuscular septum boyunca deşmek. Büyük trochanter tarihinde kaçıran gluteal tendon ekleme korumak.
- Dikkat et, Atravmatik sirkumferansiyel yumuşak doku diseksiyon gerçekleştirmek ve yanal yüzeyde başlayan onun orta diaphysis, femur bulaşmasına neden. Bunu yapmak için #15 bıçak bıçak kemik yüzeyine kontur karşı paralel tutarak temel kemik uzak kas hafifçe kesmek için kullanın. Kas maruz kemik uzak disseke gibi kaldırıp ulaşana kadar 7-10 mm Merkezi diaphysis, yumuşak doku ostectomy için hazırlamak için tüm tarafların temizlenmiş oldu femur şaft devam periosteal asansörü kullanın.
Not: medial femoral nörovasküler demet yaralanma kaçının.
- Dört 1.0 mm Kirschner (k) teller takın: 2 proksimal ve 2 lateral femur dikey femur distal medial için düz lateral yönetti. Her iki cortices (bicortical) yeterli istikrar (şekil 2A) için tüm pins meşgul olun.
- En distal iğne ile ilk, sadece lateral epicondyle düzeyinde başlar. Yer jig yanal distal femur boşaltır ve 1.0 dişli ucu k-dinleme cihazı takın.
- Kemikteki jig konumunu koruyarak, en proksimal PIN jig delikleri alan kemik girmek nerede tanımlayın. Konum belirlendikten sonra dikkatle paralel gluteal tendon lifleri için doku geçmesine, proksimal pin için küçük bir boşluk oluşturmak için gerektiğinde böylece tendon iyatrojenik zarar en aza indirerek deşmek. 1.0 mm evreli olmayan k-tekrar pin her iki cortices (şekil 2B) yürütmektedir sağlanması dinleme cihazı bu boşluğu içinde matkap.
- Kemik ile temas halinde görürse oyun konumunu korumak ve iki 1.0 mm dişli k-telleri, gelecekteki kusuru sitesinde her iki tarafında bir matkap. Her iki cortices (şekil 2C) iğne meşgul olun.
- Düzey 1 cm cilt üzerinde bar eksternal fiksatör yerleştirin ve sıkıca, yer çubuğunda kilitleme canı cehenneme. Aşırı PIN uzunlukları (şekil 2B) küçük.
- Ostectomy (kusur oluşturma) için küçük, eğri Retraktörü anterior ve posteiror uyluk çevresinde yerleştirerek çevreleyen yumuşak dokusu, kas ve nörovasküler demet korumak için hazır olun. ~ 5 mm sagittal salınan kullanan testere, çok dikkatli bir 5 mm segmental kusur orta diaphysis aracılığıyla oluşturun. Bir ışık, gereksiz kırığı (şekil 2E) önlemek için testere ile bile basınç uygulayın.
- Termal Kemik nekrozu önlemek için kusur oluşturulurken sulama (oda sıcaklığında % 0,9 steril normal salin (NS)) gerektiği gibi az miktarda uygulayın.
- Defekt oluşturduktan sonra NS 10 mL kullanarak yara floş.
- 0.1 mL % 0.25 bupivacaine epinefrin (1: 200, 000) ile bir analjezik ve vasoconstrictor olarak yara için yönetmek.
- INSERT kollajen sünger veya rhBMP-2 (5 x 3 x 3 mm) İskele defekt içine ( Adım 2) üzerinden sünger batırılmış. Her iskele uzunluğu ve konumda kalın sünger yardım kusur, hacmi yayılmasını uygun boyutta olması.
Not: Bu noktada, mRNA kompleksleri hazırlanacak ve bioluminescence görüntüleme gerçekleştirmek eğer 7,1-7,3 aşağıdaki adımlarda açıklandığı şekilde enjekte.
- 4-0 absorbe dikiş ile basit kesintiye uğramış desen kullanarak kas uçak kapatın. 4-0 absorbe dikiş ile çalışan bir subcuticular düzeni kullanmak cilt katman kapatın ve çıkıntılı pimleri etrafında boşlukları kapatmak için tutkal cilt.
- Burun konisi, Isıtma yastığını üzerinde kalan fareyi kaldırın ve sürekli fare sürekli dik bir duruş korumak için güçlü olana izlemek. Bu noktada, kurtarmak için temiz bir kafese koyun.
7. complexed mRNA ve bioluminescence görüntüleme hazırlanması
Not: Transfection mRNA kompleksleri ile ameliyat 1 gün öncesine ışıldama görüntüleme sırasında yapılmalıdır. Steril teknikleri mRNA işlerken kullanın.
- Mix 10 µL mRNA lipidik transfecting Aracısı 30 µL ile Gaussia luciferase (hisse senedi konsantrasyon 1 µg/µL) için kodlama.
- Forma mRNA-lipid kompleksleri için oda sıcaklığında en az 5 min için kuluçka tarafından izin. Lipidik transfecting Ajan mRNA molekülleri onları istikrarı ve transfection verimliliği arttırmak yoğunlaşmak.
Not: kompleksleri hemen kullanılmazsa, onları buz en fazla 1 saat için saklayın.
- Filtre uygulanmış ipuçları ile donatılmış bir 20 µL pipet kullanarak, mRNA kompleksleri defekt, distal ve proksimal uçları birimin sırasıyla enjekte et.
- Ertesi gün, görüntüleme önce 3 dk inhale isoflurane adım 4.1 daha önce açıklandığı gibi kullanarak fare anestezi.
- Fareyi bir bakım isoflurane (% 0,8 isoflurane, O2 teslim oranı 2-3 L/dak) teslim bir burun konisi ile donatılmış oda Imaging vivo yerleştirin.
- Coelenterazine 4 mg/kg vücut ağırlığı defekt birbirine bir doz, serum resuspended enjekte.
- Bioluminescence görüntüleri görüntüleme sistemi (İVIS) göre üreticinin yönergeleri18 in vivo elde.
8. görüntüleme Protokolü
- Düz Radyografi makine, bir x-ışını sistemi19, ayarlama sonra anestezi inhale isoflurane yukarıda açıklanan (bkz: Adım 4.1) kullanarak fare ve fare ile inhale isoflurane (% 0,8 isoflurane, O2 burun konisi yerleştirin teslimat oranı 2-3 L/dak) için bir hastanın (AP) uyluk grafisi.
- Fareyi sternal recumbency, cerrahi hindlimb ileri, kalçada esneme ilerlemek ve ortak bastırmak. Yaklaşık 90 ° bastırmak ortak esnek. Pençe plantar yan aşağı, vücut duvara yakın teyp. Uyluk kemikleri superimposing olasılığını ortadan kaldırmak için gelen tibia öne getirin. Kalça hafif kaçırma sağlamak için kasık bölgesinde yarı saydam sünger (yaklaşık 15 mm kalınlığında) yerleştirin. Sonra uyluk ön-arka (Kaudal kafatası) görüntüsünü elde etmek.
- Bu AP uyluk radyografik görünümü hemen ardından cerrahi, 4 hafta ve 12 hafta tekrarlayın. Gazlı bez ve bant hayvanın ekstremite kalite ve tutarlı görüntüleme için uygun şekilde konumlandırmak için kullanın.
- Burun konisi fareyi kaldırın ve sürekli fare sürekli dik bir duruş korumak için güçlü olana izlemek. Sonra kafesin içine yerleştirin.
9. histolojik yordamı
- Fareler ile inhale CO2 travma etik standartları16göre bir odasında ötenazi.
- Aşağıdaki ötenazi, hindlimb tıraş, Cilt operatif ekstremite kaldırmak ve uyluk, kalça disarticulate. Dikkatli bir şekilde tüm yumuşak doku (tüm kas, tendon ve bağ da dahil olmak üzere) operatif uyluk çıkarın. Şifa bölge diseksiyon sırasında yanlışlıkla zararlardan korumak için kusur sitesi çevreleyen kas sadece ince bir tabaka bırakın.
- Uyluk kemiği % 10'luk yer tarafsız arabelleğe alınmış fiksasyon için izin vermek için Formalin 3-4 gün için oda sıcaklığında. 15:1 formalin doku hacim oranı için tutun. Çözüm fiksasyon işlemi boyunca yarıya kadar bir kez değiştirin.
- Uyluk kemiği bir çözümde % 15 Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) pH 6,5 3-4 hafta boyunca decalcify. Kalsiyumun bitiş noktası belirlemek için seri halinde ilerlemenin toplamak.
- Uyluk kemiği boyuna bir kesim anterior posterior-sagittal düzlemde ile bisect. Doku standart parafin gömme ve Hematoksilen ve Eozin (H & E) boyama için gönderin.
- H & E slaytlar bir patolog histolojik değerlendirme için gönder.