Burada, iki orta-den geçerek deneyleri Ca2 +etkileri değerlendirilmesi için-sinyalizasyon ve acrosome tepki insan sperm olarak açıklanmıştır. Bu deneyleri bileşikler üzerinde Ca2 +etkileri için büyük miktarda hızlı ve kolay bir ekran için kullanılabilir-insan sperm sinyal ve acrosome reaksiyon.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Orta-den geçerek deneyleri Ca2 +etkileri değerlendirilmesi için eleme-sinyal ve insan Sperm Acrosome reaksiyon
Bu makalede
Özet
Özet
CA2 +-sinyal normal sperm hücre işlevi ve erkek üreme için gerekli. Benzer şekilde, acrosome tepki zona pelusida nüfuz ve yumurtayı döllemek için insan bir sperm hücresi yetenek için çok önemlidir. Bu nedenle büyük ilgi için onların etkisi Ca2 +bileşikleri (örneğin, çevresel kimyasal madde veya ilaç adaylarının) test etmek için-insan sperm sinyal ve acrosome reaksiyon ya insan sperm hücre işlevi üzerinde olası olumsuz etkileri incelemek için veya bir gebelik önleyici olarak olası bir rol araştırmak için. Burada, iki orta-den geçerek deneyleri açıklanmıştır: 1) bir floresan tabanlı tahlil Ca2 +etkileri değerlendirilmesi için-insan sperm ve 2) bir görüntü sitometrik tahlil acrosome tepki insan sperm olarak değerlendirilmesi için sinyal. Bu deneyleri bileşikler üzerinde Ca2 +etkileri için çok sayıda ekran için kullanılabilir-insan sperm sinyal ve acrosome reaksiyon. Ayrıca, deneyleri çok özel doz-yanıt eğrileri bireysel bileşiklerin oluşturmak, iki veya daha fazla bileşikler için potansiyel additivity/synergism belirlemek için ve eylem yoluyla rekabetçi inhibisyon farmakolojik modu çalışmaya kullanılabilir CatSper inhibitörleri ile deneyler.
Giriş
Burada açıklanan iki deneyleri amacı Ca2 +etkileri incelemektir-sinyalizasyon ve acrosome tepki insan sperm için gösterildiği gibi çeşitli yayınlar bunlar istihdam içinde birden çok bileşikleri deneyleri1,2, 3,4,5,6,7. CA2 +-sinyalizasyon ve acrosome tepki hayati normal insan sperm hücre işlevi ve erkek üreme vardır.
Bir insan sperm hücre genel yumurtayı döllemek için hedeftir. Başarıyla ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Toplama ve analiz protokolleri insan meni örnekleri Danimarka başkenti bölge araştırma Etik Komitesi kuralları takip eder. Tüm sperm örneği Onam sonra gönüllü bağış elde edilmiştir. Doğumdan sonra örnekleri tam anonimleştirilir. Onların rahatsızlık için her donör 500 DKK (yaklaşık $75 dolar) örnek başına bir ücret aldı. Örnekleri teslim günü analiz ve laboratuvar deneyleri hemen sonra yok etti.
Not: Orta verimi Ca2 +-tahlil adım 4-5 ve 6 ile 7 orta üretilen iş acrosome tepki tahlil açıklanan sinyal. Protokol insan tubal sıvı (HTF+) orta hazırlamak için 1. adımda anlatılan ve arıtma sperm hücre deneyleri için 2-3 adımda....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Temsilcisi sonuçları pozitif (progesteron) ve negatif (arabellek) denetimi [Ca2 +]i ile birlikte 4 bileşikler (A, B, C ve D) etkisini orta-den geçerek Ca2 +kullanarak insan sperm testi bir deneme-sinyal tahlil şekil 4agörülebilir. Şekil 4b', progesteron bir doz yanıt eğrisi, en yüksek ΔF/F0 ile (%) elde gösterilir progesteron, seri olarak seyreltilmiş konsantrasyonları tarafından indükl.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Tahlil Floresans tek microwells üzerinden tedavinin temel sinyal orta üretilen iş Ca2 + yaklaşık 250.000 sperm hücreleri içeren. Yakalanan sinyal iyi tüm bireysel sperm hücrelerinden ortalama. Tahlil böylece sperm hücre [Ca2 +]ben özellikle neresinde hakkında bilgi kayma yok değişti, [Ca2 +]i bir değişiklik yer, ya da ne kadar türdeş olmayan yanıttır alır sperm hücrelerinin bir kısmı ne büyüklükte sağlar tek tek hücreleri arasında. Bu tür bilgiler edinmek için tek hü.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Yazarlar Timo Strünker laboratuvar laboratuarına onların kalır sırasında AR ve DLE gözetiminin kabul etmek istiyorum. Ayrıca, bizim meslektaşları bölümü büyüme ve üreme, Kopenhag Üniversitesi Hastanesi, Rigshospitalet kadar bu iki deneyleri ayarı ile onların yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser hibe yenilik Fonu Danimarka (grant numaraları 005-2010-3 ve 14-2013-4) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
3
Santrifüjiçin plastik kapglukoz 0.6 M NaHCO ve %0.37 (h/h) formaldehit içeren HTF + İmmobilize edici çözeltiye ek olarak 50 mL plastik tüpleri 45 derece açıyla yerleştirmek için arıtılmış su hacimsel şişeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0.2 ve mikro; m gözenek filtresi | Thermo Fisher Scientific, ABD | 296-4545 | |
| 1 L ölçüm silindiri | Thermo Fisher Scientific, ABD | 3662-1000 | |
| 1, 4 ve 2 mL plastik tüpler | Eppendorf, Almanya | 30120086 ve 0030120094 | |
| 12 kanallı pipet | Eppendorf, Almanya | 4861000813 | |
| 384 çok kuyulu plaka | Greiner Bio-One, Almanya | 781096 | |
| 15 ve 50 mL platik tüpler | Eppendorf, Almanya | 0030122151 ve 30122178 | |
| A2 slaytlı | ChemoMetec, Danimarka | 942-0001 | |
| Otomatik tekrarlayıcı pipet | Eppendorf, Almanya | 4987000010 | |
| CaCl2 | |||
| Temiz, geniş ağızlı semen örneği | |||
| Dimetil sülfoksit (DMSO) | |||
| Pisum sativum'un FITC'ye bağlı lektini (FITC-PSA) | Sigma-Aldrich, Almanya | L0770 | |
| Fluo-4 AM | Thermo Fisher Scientific, ABD | F14201 | |
| FLUOstar OMEGA floresan mikroplaka okuyucu | BMG Labtech, Almanya | ||
| Susuz | |||
| HEPES | |||
| Hoechst-33342 | ChemoMetec, Danimarka | 910-3015 | |
| İnsan serum albümini (HSA) | Irvine Scientific | 9988 | |
| Damıtılmış suda | |||
| Kuluçka makinesi | |||
| KCl | |||
| KH2< / sub>PO4< / sub> | |||
| Manyetik karıştırıcı | |||
| MgSO4< sub> | |||
| Na-Laktat | |||
| NaCl NaHCO | |||
| 3 | |||
| NC-3000 görüntü sitometresi | ChemoMetec, Danimarka | 970-3003 | |
| Pipetler ve boru uçları | |||
| propidium iyodür (PI) | ChemoMetec, Danimarka | 910-3002 | |
| rafı | |||
| S100 tampon | ChemoMetec, Danimarka | 910-0101 | |
| SP1 kaset | ChemoMetec, Danimarka | 941-0006 | |
| Uygun boyutlarda | |||
| Vortexer |
Kaynaklar
- Schiffer, C., et al. Direct action of endocrine disrupting chemicals on human sperm. EMBO reports. , (2014).
- Rehfeld, A., Dissing, S., Skakkebæk, N. E. Chemical UV Filters Mimic the Effect of Progesterone on Ca(2+) Signaling in Human Sperm Cells. Endocrin....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
