Yöntem makalesi

Sitogenetik teknikle Bemisia tabaci yumurta döllenme oranı belirleme

DOI:

10.3791/59213

⸱

1 Nisan 2019

 , 
1Graduate Interdisciplinary Program in Entomology and Insect Science, University of Arizona, 2Department of Entomology, University of Arizona

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz ' 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI fertilizasyon oranını belirlemek için) ve haplodiploid invaziv haşere Bemisia tabacibirincil seks oranını kullanarak basit bir sitogenetik teknik mevcut.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Su emme whiteflies birkaç türün en zarar verici karasal zararlıları dünya çapında onlar yamamak ürün hasar ve onlar vektör bitki virüs nedeniyle bazılarıdır. Çok sayıda çalışma farklı ortamlarda bu türlerin biyolojinin rağmen bir anahtar yaşam öyküsü parametresi, çoluk çocuk seks oranları, az ilgi aldı, henüz nüfus dinamikleri tahmin için önemlidir. Bemisia tabaci birincil seks oranı (oviposition seks oranı) asla bildirilmiştir ama bu haplodiploid böcek yumurta döllenme oranı belirlenerek bulunabilir. Teknik çamaşır suyu, fiksasyon adımlar bir dizi ve genel DNA floresan leke, DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole, DNA'ya bağlanıcı floresan boya), kadın ve erkek pronuclei bağlamak için uygulanması ile yumurta dechorionation içerir. Burada, teknik ve endosimbiyotik bir bakteri olup olmadığını Rickettsia'nin sp. nr sınamak için kendi uygulamalarına örnek olarak mevcut. bellii, B. tabacibirincil seks oranı etkiledi. Bu yöntem, whiteflies nüfus çalışmaları veya seks ayırma ile bazı çevresel uyaranlara varsa belirlemede yardımcı.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Seks ayırma çalışma veya göreli yatırım içinde erkek ve kadın çoluk çocuk, bir davranışsal ekoloji1,2,3temel taşıdır. Davranış adaptif modelleri sınama gücünü yanı sıra, seks ayırma stratejisi bir organizmanın bilerek onun nüfus dinamikleri modelleri iyileştirebilir. Birçok tür seks ayırma anneler tarafından kontrol edilir. Seks ayırma belirlemek için birincil seks oranı veya kadın oranı yumurta yükünün zaman belirlemek önemlidir. Yetişkin ortaya çıkması seks oranında seks ayırma ipuçları sağlayabilir rağmen diferansiyel gelişim mortalite erkek ve dişi gençler arasında yaygın olarak yetişkin seks oranı önemli ölçüde çarpık. Hymenoptera, karıncalar, arılar ve eşekarısı, içeren sipariş böceklerin bazı türleri içinde birincil seks oranı embriyolar genetik DNA görüntülemek için boyama sitogenetik deneyleri ile tespit edilmiştir. Hymenopterans haplodiploid olduğundan, yeni başlayan bir erkek yumurta haploit ve yeni başlayan kadın yumurta diploit ve hem erkek hem de dişi pronuclei (2n) içeren iken sadece kadın pronucleus (n), içerir. Aleyrodidae, true whiteflies bilinen böcek (Hemiptera) sap besleme Aile olmakla birlikte aynı zamanda haplodiploid, birincil seks oranı bu böcekler için kurulan bir tahlil olmamıştır. Bu belki de bu ailenin kaç kozmopolit ciddi zararlıları, çalışma ve cinsiyet oranları whiteflies4,5,6,7 rekabetçi etkileşimleri önemini yoğunluğu göz önüne alındığında şaşırtıcı olduğunu ,8,9,10 ve nüfus dinamikleri genellikle. Haplodiploid böcekler de seks belirlenmesi sistemleri, seçici döllenme ve çevre ile2farklı değişken seks oranları imkanı sağlayan tarafından seks oranları serbest. Burada topluca sweetpotato whitefly bilinen whiteflies türler kompleksinin birincil seks oranını belirlemek için bir teknik mevcut B. tabaci. Bu bir tür ismi birden fazla 28 tür dünya çapında11kapsar ve en zarar verici küresel invaziv zararlıları12,13bazılarını içerir. Bu tekniğin uygulanması seks ayırma şablonlarını B. tabaci ve diğer Aleyrodidae belirlemek için sıcaklık, ana bitki, endosimbiyotik bakteri veya bitki/whitefly gibi değişkenlerin daha titiz bir araştırma sağlayacak patojenler, whitefly birincil seks oranları ve whitefly nüfus dinamikleri etkileyebilir.

Biz herhangi bir karşılaştırılabilir yumurta boyama teknikleri B. tabaciiçin farkında değiller. Bir gecede fiksasyon adım atlar ve bu nedenle, içinde 3 h tamamlanmış olması gibi diğer böcek yumurta14 için kullanılan boyama yöntemleri ile karşılaştırıldığında uygun iletişim kuralıdır. Bir uygulama, bir endosimbiyotik bakteri, Rickettsia'nin sp. nr bir örnek olarak. bellii, laboratuvar hatlarımız B. tabaci Orta Doğu Asya küçük 1 (MEAM1)15,16kadın önyargı ile ilişkilidir. Bir B. tabaci MEAM1 laboratuvar satırda ("MAC1," Maricopa tarım Merkezi'nden toplanan), biz test olup olmadığını Rickettsia'nin-virüslü (R+) kadın döllemek bulaşmamış (R-) dişilerden daha çok yumurta.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: Oda sıcaklığında iyi havalandırılmış bir alanda veya duman başlık altında gerçekleştirilmiş tüm işleri emin olun. Bu iletişim kuralı tüm 'damla' ın işleç tercihinize bağlı olarak 5-20 µL olarak tanımlanır.

1. ilk kurulum

  1. Kadın whiteflies temiz yapraklarda Hayır izin. Küçük kafes veya agar bir petri içinde sığacak şekilde kes yaprakları örnekler oviposition arenalarda için. Coverable bir delik küçük kafes veya ekleyebilir veya kaldırabilir yetişkinler için Petri kabına kapağı açın. Alternatif olarak, hızlı bir gemi toplanan yetişkinlerin buza koymak ve sonra onları yaprak üzerinde mevduat. Yumurta baba tarafından pronucleus içine sperm geçiş gözlenmesi sağlamak için oviposition ve en fazla 60 dk, yumurta fiksasyon arasındaki süreyi sınırlayın.
    Not: Yumurta yaprak kaldırılmaz yetişkinliğe yetişkin seks oranları kaydetmek için yetiştirilen.
  2. Önce veya whitefly oviposition sırasında mikroskop slayt sabun ve su, kurutma ile temizleyerek iyi ve parafin film bir parça bir ucuna, (şekil 1) parafin film yüzey değil kırmak emin germe hazırlayın.
    Not: Parafin filmidir hidrofobik ve yarı opak, damla ve daha kolay görülmesi için yumurta sıvı formu için sağlar.

2. Dechorionation

  1. Bir cam Pasteur pipet, parafin filmin damla çamaşır suyu çözüm (%0,83 sodyum hipoklorit) ekleyin.
    Not: Yumurta 2-3 yumurta içinde her damla eğer sadece izlemek daha kolaydır. Alternatif olarak, bir büyük yumurta sayı yönetmek için 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x damlaları içinde yumurta toplamak.
    Uyarı: Çamaşır suyu aşındırıcı; Ne zaman işleme çamaşır suyu ve değil nefes eldiven giymek.
  2. Yetişkin whiteflies yaprak kaldırın.
  3. Yaprak yumurta açıkça görmek ve tek başına yumurta toplamak için mikroskop altında ve ince bir sonda ile dikkatli bir şekilde yerleştirin. 45 ° veya erimiş pipet ucu (Şekil 2) bir rahat çalışma açıyla minuten nadel çiviyi yerleştirmeden bir araştırma yapmak için.
  4. Yumurta çamaşır suyu veya 1 x PBS aktarın. 1 x PBS kullanarak, PBS bir cam Pasteur pipette bir kez tüm yumurta toplanır ve çamaşır suyu yumurtalara ekleyin 1 x kaldırın.
    Not: Pedicel yaprak kaldırılana kadar yumurta toplarken, yavaş yavaş onun temel yumurtadan kaldır. Pedicel yapış yapış ve çamaşır suyu daldırma kadar yumurta genellikle sonda ucuna kadar sopa.
    Not: Bu tüm Kimyasalları Pasteur Pipetler ayrı cam kullanmak için tavsiye edilir ve Pipetler ipuçları daraltmak ve yanlışlıkla whitefly yumurta alıyorum riskini azaltmak için ısı ile değiştirilebilir. Kalıntı ve kontaminasyonu önlemek için her kullanımdan sonra Pipetler deiyonize su ile temizleyin.
  5. 10 dk bekle. Embriyo yumurta 1s büyük bir ilgi ise, yumurta çamaşır suyu ilâ 15 dakika bırakın.
    Not: En fazla 1 saat eski olan yumurta için 10 dakika yeterlidir.

3. fiksasyon

Not: Bu adımlar bir Hymenopteran protokolü17alınır.

  1. (Koryon parçaları içeren) çamaşır suyu bir bardak Pasteur pipet ile kaldırmak ve o atın. Buzul Asetik asit bir cam Pasteur damlaları pipet ve 3 dakika bekleyin ekleyin.
    Uyarı: Bu adım bir duman başlık altında devam etmek. Buzul Asetik asit aşındırıcı; Ne zaman eldiven giymek buzul Asetik asit işleme ve, özellikle de artık çamaşır suyu ile birlikte nefes değil.
  2. Buzul Asetik asit bir cam Pasteur pipet ile kaldırın ve Clarke'nın çözüm damla ekleyin (3:1 mutlak etanol: buzul Asetik asit) ile bir bardak Pasteur pipet. Çözüm çoğu buharlaşıp kadar bekleyin (veya 10 min max).
  3. Bir cam Pasteur pipet ve etanol çoğu buharlaşıp kadar bekleyin (veya 10 min max) yumurta için % 70 etanol damla ekleyin.

4. boyama

  1. Bir cam Pasteur pipet ile herhangi bir kalıntı etanol kaldırmak ve bir cam pH 7,0 yakın almak için Pasteur pipet ile yumurta için 1 x PBS damla ekleyin. Mikroskop slayt kurutulma, örneğin, bir boş pipet ucu kutusunda (şekil 3) içinde ıslak kağıt havlu ile önlemek için nem odası ayarlayın. En az 30 dakika bekleyin.
    Not: Bir duraklama kullanılmıyorsa, nem odası kuruma engelleyebilirsiniz sürece bu en iyi noktasıdır.
  2. 1 x PBS bir cam Pasteur pipet, kaldırmak ve 0,1 μg/mL DAPI, bir DNA floresan leke damla ekleyin, bir cam Pasteur pipet. Mikroskop slayt bir karanlık nem odasında ayarlayın ve en az 15 dakika bekleyin.
    Uyarı: DAPI tahriş edici, eldiven ile hallederim.

5. çamaşır

  1. Bir cam Pasteur pipet ile DAPI kaldırın.
  2. 1 damla ekleyin x TBST (5 x çözüm 30 g Tris, NaCl 43.8 g, polysorbate 20 5 mL ve NaN3 [pH 7,5] 1.0 g yapılmış ve PCR sınıf su ile 1 L getirdim) yumurta bir cam Pasteur için pipet. 1 kaldırmadan önce 5 dakika bekleyin bir cam Pasteur pipet ile x TBST. Bu 2 kez tekrarlayın.

6. montaj

  1. Son yıkama sonra dikkatle mikroskop slayt temiz bir parçası üzerine parafin filmden tüm yumurta pipette. Fazla 1 çıkarın x TBST; daha sonra medya montaj 20 µL ekleyin (% 80 gliserol ve % 20 1 x TBST ile % 2 n-propil-gallat) ve temiz kapak slayt yumurtaları üstüne yerleştirin.
  2. Uzun süreli depolama için kapak slayt açık oje ile mühür ve, sonra slayt 2 ° C'de karanlıkta saklamak veya hemen floresan mikroskop altında görüntülemek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rickettsia'nin B. tabaci MEAM1 kadın fertilizasyon oranını etkiler olup olmadığını sınamak için biz Rickettsia'ninyetiştirilen-(R+) enfekte veya (R-) bulaşmamış B. tabaci börülce bitkilerde (Vigna unguiculata) üzerinde kafesleri 27 ° C, bağıl nem % 70 ve 16 h ışık/8 s karanlık photoperiod ayırın. R+ ve R- dördüncü INSTAR whiteflies dikkatle yapraklarından kaldırıldı ve 200 µL şerit tüplerde izole. Yet...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu döllenme oranı veya B. tabacibirincil seks oranını yakalamak için ilk kuralıdır. Bu protokol bu değil daha onlar düzeltilinceye kadar yumurta oviposited beri 1 saat geçti sağlamak whitefly yumurta hızlı bir şekilde ele alınacağını öğrenmek araştırmacılar gerektirir mücadeledir. Ön deneyler sırasında 3 h ya da daha fazla postoviposition tespit edildi yumurta döllenme, syngamy meydana gelmiş ve Mitotik bölünmeler devam edildi olarak gözlemlemek için çok yaşlı idi. 1-3 h arasında pronuclei üzerinde biraz daha yu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma için M.S.H. bir NSF grant (DEB-1020460) M.S.H. için ve USDA AFRI grant (2010-03752) tarafından finanse edildi Yazarlar Brennan Zehr whitefly yumurta çok beceri ve Zen ile boyama için teşekkür ederiz. Yazar Mike Riehle onun floresan mikroskop görüntüleme için kullanımına izin için teşekkür ederiz. Yazarlar Suzanne Kelly ve Marco Gebiola yumurta görüntüler için teşekkür ederiz. Yazarlar Suzanne Kelly ve Jimmy Conway deneyler sırasında çok önemli anlarda yardım ettiğin için teşekkür ederim.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1x PBSHerhangi bir
1x TBST30 g Tris, 43.8 g NaCl, 5 mL Tween-20 ve 1.0 g NaN3 pH 7.5'ten yapılan ve PCR dereceli su ile 1 L'ye getirilenherhangi bir
BleachCloroxHerhangi bir ev tipi çamaşır suyu, %0.83'e seyreltilebildiği sürece çalışacaktır. Sodyum hipoklorit
Şeffaf ojeHerhangi bir
DAPI DilaktatSanta Cruz Biyoteknolojisc300415
Etanol%70 EtOH'ye Seyreltilmiş
Floresan mikroskopNikonNikon Eclipse 50i bu deneyde kullanıldı, ancak 340/380 nm uyarma filtreli ve en az 4-10x büyütmeli herhangi bir floresan mikroskop kullanılabilir
Buzlu asetik asitMallinckrodtUN2789
GliserolHerhangi bir
MikroskopVahşiBu deney için bir Vahşi M5A mikroskobu kullanıldı, ancak operatörün beyaz sinek yumurtalarını net bir şekilde görebileceği herhangi bir mikroskop kullanılabilir
Mikroskop slayt kapaklarıHerhangi BirYöntem 18 mm x 18 mm boyutlu slayt kapakları içindir. Daha büyük kayar kapaklar için daha fazla montaj ortamının eklenmesi gerekecektir.
Mikroskop slaytlarıHerhangi bir
Minuten nadel pimiBioQuip1208SAMinuten nadel pimleri, pipet uçlu problar olarak şekillendirme için isteğe bağlıdır
NaClAny
NaN3Any
n-propyl-gallatSigma/Santa Cruz BiyoteknolojiP3130/sc-250794
ParafilmBemis
Pasteur pipetleriFisher Scientific13-678-20AFisherbrand Tek Kullanımlık Borosilikat cam Pasteur pipetleri 5,75 inç. Operatör pipetleri uzatmak ve daraltmak isterse bir Bunsen brülörüne de ihtiyaç duyulabilir
PCR sınıfı suHerhangi
Pipet ucuHerhangiPipet ucu, minuten nadel pimli problar olarak şekillendirmek için isteğe bağlıdır
Küçük damlalıklı ampulHerhangi birPasteur pipetine sığmalıdır
TrisAny
Tween-20Any
5x solüsyonHerhangi Bir: bir bir

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Charnov, E. L. Sex ratio in spatially structured populations. The Theory of Sex Allocation. May, R. M. , Princeton University Press. Princeton, NJ. 67-92 (1982).
  2. Godfray, H. C. J. Parasitoids: behavioral and evolutionary ecology. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1994).
  3. Bourke, A. F. G., Franks, N. R. Social Evolution in Ants. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1995).
  4. Pascal, S., Callejas, C. Intra- and interspecific competition between biotypes B and Q of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) from Spain. Bulletin of Entomological Research. 94 (4), 369-375 (2004).
  5. Liu, S. -S., et al. Asymmetric mating interactions drive widespread invasion and displacement in a whitefly. Science. 318 (5857), 1769-1772 (2007).
  6. Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Mate discrimination in invasive whitefly species. Journal of Insect Behavior. 23 (5), 364-380 (2010).
  7. Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Plasticity in mating behaviour drives asymmetric reproductive interference in whiteflies. Animal Behaviour. 79 (3), 579-587 (2010).
  8. Tsueda, H., Tsuchida, K. Reproductive differences between Q and B whiteflies, Bemisia tabaci, on three host plants and negative interactions in mixed cohorts. Entomologia Experimentalis et Applicata. 141, 197-207 (2011).
  9. Wang, P., Crowder, D. W., Liu, S. -S. Roles of mating behavioural interactions and life history traits in the competition between alien and indigenous whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 102 (4), 395-405 (2012).
  10. Sun, D. -B., Li, J., Liu, Y. -Q., Crowder, D. W., Liu, S. -S. Effects of reproductive interference on the competitive displacement between two invasive whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 104 (3), 334-346 (2014).
  11. Liu, S. -S., Colvin, J., De Barro, P. J. Species concepts as applied to the whitefly Bemisia tabaci systematics: how many species are there? Journal of Integrative Agriculture. 11 (2), 176-186 (2012).
  12. Invasive Species Specialist Group. Global Invasive Species Database. , Available from: http://iucngisd.org/gisd/100_worst.php (2018).
  13. Gilbertson, R. L., Batuman, O., Webster, C. G., Adkins, S. Role of the insect supervectors Bemisia tabaci and Frankliniella occidentalis in the emergence and global spread of plant viruses. Annual Review of Virology. 2 (1), 67-93 (2015).
  14. Giorgini, M., et al. Rickettsia symbionts cause parthenogenetic reproduction in the parasitoid wasp Pingala soemius (Hymenoptera: Eulophidae). Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2589-2599 (2010).
  15. Himler, A. G., et al. Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias. Science. 332 (6026), 254-256 (2011).
  16. Cass, B. N., et al. Dynamics of the endosymbiont Rickettsia in an insect pest. Microbial Ecology. 70 (1), 287-297 (2015).
  17. Vavre, F., de Jong, J. H., Stouthamer, R. Cytogenetic mechanism and genetic consequences of thelytoky in the wasp Trichogramma cacoeciae. Heredity. 93 (6), 592-596 (2004).
  18. Cass, B. N., et al. Conditional fitness benefits of the Rickettsia bacterial symbiont in an insect pest. Oecologia. 180 (1), 169-179 (2016).
  19. Hunter, M. S., Asiimwe, P., Himler, A. G., Kelly, S. E. Host nuclear genotype influences phenotype of a conditional mutualist symbiont. Journal of Evolutionary Biology. 30, 141-149 (2017).
  20. Gottlieb, Y., et al. Inherited intracellular ecosystem: symbiotic bacteria share bacteriocytes in whiteflies. FASEB Journal. 22 (7), 2591-2599 (2008).
  21. Luan, J., Sun, X., Fei, Z., Douglas, A. E. Maternal inheritance of a single somatic animal cell displayed by the bacteriocyte in the whitefly Bemisia tabaci. Current Biology. 28 (3), 459-465 (2018).
  22. Guo, J. -Y., Cong, L., Wan, F. -H. Multiple generation effects of high temperature on the development and fecundity of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae) biotype B. Insect Science. 20 (4), 541-549 (2013).
  23. Cui, X., Wan, F., Xie, M., Liu, T. Effects of heat shock on survival and reproduction of two whitefly species, Trialeurodes vaporariorum and Bemisia tabaci biotype B. Journal of Insect Science. 8 (24), (2008).
  24. Boykin, L. M. Bemisia tabaci nomenclature: Lessons learned. Pest Management Science. 70 (10), 1454-1459 (2014).
  25. Qin, L., Pan, L. -L., Liu, S. -S. Further insight into reproductive incompatibility between putative cryptic species of the Bemisia tabaci whitefly complex. Insect Science. 23 (2), 215-224 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Beyazsinek D llenme OranYumurta DekoryonasyonuDAPI ekirdek BoyamaFloresan MikroskopiHaplodiploid Cinsiyet OranPrimer Cinsiyet OranRickettsia EndosimbiyontYumurta Tespit Protokol

İlgili makaleler