Method Article

İlk 3D hücre küme denetimi içinde a Hybrid jel küp aygıt için tekrarlanabilir model oluşumları

DOI:

10.3791/59214

⸱

March 21st, 2019

 ,  , 
1NanoSquare Research Institute, Osaka Prefecture University, 2Department of Bioscience and Informatics, Osaka Prefecture University, 3Department of Biological Functions Engineering, Kyushu Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz bir tekrarlanabilir model formasyonu elde etmek için 3D bir hücre dışı matriks ilk hücre kümesi şeklinde kontrol etmek için bir yordam mevcut. İki farklı hydrogels içeren bir küp aygıtı doku Desen oluşumu için çok yönlü görüntüleme elde etmek için istihdam edilmektedir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüp Bebek 3D kültürler önemini hücre/doku kültürü içinde önemli ölçüde vurguladı. Ancak, deneysel tekrarlanabilirlik eksikliği kendi kısıtlamaları biridir. Desen oluşumu kaç tekrarlanabilir sonuçlar üreten kendi kendine organizasyon altında yatan mekanizmaları analizini bozulur. Hücre yoğunluğu ve hücre dışı Matriks (ECM), dağıtım gibi ilk kültür koşulları varyasyon azaltarak tekrarlanabilirlik 3D bir kültür geliştirmek çok önemlidir. Bu makalede, biz son derece tekrarlanabilir model oluşumları elde etmek için 3D bir hücre dışı matriks ilk hücre kümesi şeklinde denetlemek için basit ama güçlü bir yordamı göstermek. İstenen şeklinde bir micromold fotolitografi veya işleme işlemi kullanılarak imal edilmiştir ve bir melez jel küp (HGC) bulunan ECM, bir 3D cep kurulmuş. Yüksek konsantrasyonlu hücreleri böylece hücre kümesi şekil fabrikasyon kalıp şekli ile eşleşen, cebinde sonra enjekte edildi. İstihdam HGC rağmen düşük-büyütme objektif kullanılan, yüksek çözünürlüklü görüntü ve tüm doku yapısı yakalama etkin onun rotasyon tarafından tarama çok yönlü izin. Normal insan bronş epitel hücreleri metodoloji göstermek için kullanılmıştır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

2D bir kültür ondan çok daha iyi taklit eden biyolojik ortamlar, 3D bir kültür önemi oldukça hücre/doku kültürü1,2,3' te vurgulanmaktadır. Hücreleri ve hücre dışı Matriks (ECM) arasındaki etkileşimi morfogenez4,5ile ilgili önemli ipuçları sağlar. Birçok doku oluşumları katlama işlemi6,7, invagination8ve borulu oluşumu9,10gibi 3D ortamlar yalnızca altında ortaya çıkabilir. Ancak, çok sayıda zorluklar 3D deneyler için 2D deneylerden bir tabak üzerinde değişen gelen araştırmacılar önlemek. 3D deneylerde büyük zorluklar birini görüntüleme 3D örnekleri konudur. Düzlemsel deneyler ile karşılaştırıldığında, uygun 3D görüntü edinimi birçok durumda hala meydan okuyor. Örnek boyutu milimetre aralığı düşük-büyütme lensler büyük odak derinliği sayesinde ulaştığında özellikle, uygun bir 3D görüntü elde etmek zor bir iştir. Örneğin, tek hücre boyutu normalde az 10 µm ise 10 x büyütme objektif kullanıldığında odak derinliği 50'den fazla µm ulaşır. Görüntü kalitesini artırmak için yüksek teknoloji mikroskobu sistemleri geliştirilmektedir (örneğin, İki fotonlu mikroskobu11 ve ışık sayfalık mikroskobu sistem12), ama onların durumu onların pahalı fiyat nedeniyle sınırlıdır. Alternatif olarak, daha önce bir melez jel küp (HGC) aygıt13geliştirdik. Hydrogels iki tür aygıt oluşur: özel bir destek jel ve kollajen gibi bir ECM ya da Matrigel bir kültür jel olarak olarak. HGC kültür sırasında örnek toplamak ve odak derinliği sorun14adresleri çok yönlü görüntüleme elde etmek için küp döndürmek için bize izin verir.

Başka bir zorluk 3D deneylerde onların düşük tekrarlanabilirlik zavallı kontrol edilebilirlik 3D ortamlar sayesinde olduğunu. Bir plastik tabak bir düzlemsel kültür farklı olarak ilk kültür koşullarında varyasyonları kolayca yumuşak bir malzeme tarafından çevrili 3 boyutlu uzayda meydana gelir. Deneysel sonuçlar önemli bir varyasyon aşağıdaki analizi bozulur ve temel mekanizmaları maskeler. Pek çok mühendislik teknoloji tek hücreleri, bioprinting15,16,17ve İskele18, dokuma fiber gibi dağınık şekilde hizalamak için geliştirilmiştir ancak karmaşık ön işleme gerektirir veya özel olarak tasarlanmış ekipman. Buna ek olarak, 3D hücre hizalama HGC19ulaşmak için bir yöntem geliştirdik.

Bu protokol için bir HGC 3D ilk hücre kümesi şeklinde denetlemek için yaygın olarak kullanılan ekipman ile basit bir yordam gösterilmektedir. İlk olarak, HGC imalat sürecinin gösterilmiştir. Sonra micromolds fotolitografi veya işleme işlemi tarafından fabrikasyon bir cep bir ECM rasgele bir şekli ile üretmeye HGC yerleştirildi. Daha sonra son derece yoğun hücreler Santrifüjü sonra HGC ilk hücre kümesi şeklinde denetlemek için cep içine enjekte edildi. Tam kontrollü hücre kümesi birçok yönden nedeniyle HGC görüntüsü. Normal insan bronş epitel (NHBE) hücreleri görüntü kalitesini arttırmak için birden çok yönden gelen ilk hücre kümesi şekil kontrolünü ve görüntüleme şube göstermek için kullanılmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. melez jel küp cihaz imalatı

  1. Polikarbonat (PC) küp çerçeve işleme işlemi veya bir 3D printerlere harcama maddeler kullanarak hazırlayın. PC çerçevesinin boyutunu örnek boyutuna bağlıdır. Dalları kültür sırasında uzatmak için yeterli alanı vardı ki bu çalışmada, biz her iki tarafta bir çerçeve 5 mm kullanılır.
  2. Önceden soğutulmuş cam slayt veya bir buz kutusuna başka bir pürüzsüz yüzey PC çerçevesini yerleştirin (< 0 ° C) (şekil 1A).
  3. Önceden ısıtılmış % 1.5 özel (w/v) 12 µL küp çerçeve üst yüzünden bir pipet ile alt yüzey ekleyin. Böylece düz bir yüzey (şekil 1B) oluşturmak için özel yayılır pipet inme.
  4. Birkaç dakika içinde özel tedavi edilecektir. PC çerçeve cımbız kullanarak cam slayt kenarına doğru kaydırarak seç. Dikey Çerçeve CAM slayttan tespit küp çerçeve cam slayt (şekil 1 c) arasındaki özel yapıştırıcı kuvvet sayesinde özel bir ayırma neden unutmayın.
  5. Açık yüz aşağı yapmak ve sonra cam slayt üzerinde tekrar (şekil 1 d) yer kübik kareyi döndür.
  6. Üç yüzeyleri özel (şekil 1E) ile doldurulur 1.3-1.5 tamamlayana dek.
  7. Dördüncü ve beşinci yüzlerine bir özel duvar oluşturmak için özel açık bir yüz (şekil 1F) damla. Bir kez bir özel duvar beşinci yüzünde oluşan, HGC hazırlanması tamamlandı.

2. fotolitografi veya işleme bir işlem tarafından micromolds imalatı

  1. İmalat fotolitografi tarafından
    1. Temiz ultrasonik temizlik aseton ile izopropil alkol (IPA), üzerinden bir Silisyum (Si) gofret sonra distile (DI) su 5 min için. Si gofret azot ile üfleme azot sonra 20 dk (şekil 2A(i)) için 140 ° c fırında kurutmak.
    2. Spin-ceket LOR ve Az gibi kurban bir katman direnir Si gofret (2000 rpm, 30 s) spin coater sarı ışık altında kullanarak. Hemen spin-kaplama sonra gofret 3 dk (şekil 2A(II)) için 90 ° c sıcak tabakta ısı. Kurban katman istenen kalınlığı daha--dan 1 µm işlem kapalı Asansör kolayca yapılabilir, ama doğru bir kalınlık gerekli değildir ki.
    3. Gofret 70 ° c sıcak bir tabak yerleştirin ve sonra istediğiniz kalınlıkta bir el rulo (şekil 2A(III)) kullanarak kurban katmandaki ile kalın negatif fotorezist sabıkası laminat
    4. Beş dakika sonra laminasyon, gofret için UV Işınlarına maruz kalma bir maske aligner yerleştirin. Bir photomask gerekli kalıbı ile levha resist ayarla ve UV ışığı ile uygun bir süre için maruz. Pozlama süresi fotorezist kalınlığı ve UV ışığın şiddetini tarafından belirlenir. Daha sonra gofret sonrası pozlama fırında 5 min 90 ° c 10 dk. (şekil 2A(IV)) için pişirme tarafından takip için 60 ° C'de için sıcak bir tabak yerleştirin
    5. Yıkamaya alanı (yaklaşık 20 dk) tamamen eriyene kadar propilen glikol monomethyl eter asetat (PGMEA) gofret çeker bir negatif fotorezist geliştirmek (şekil 2A(v)).
    6. Kurban katman IPA ultrasonik temizlik için Mikroyapı kaldırmaya kullanarak geçiyoruz. Mikro gofret soyulmuş sonra ultrasonik 10 dakikadır (şekil 2A(VI)) temizleyerek DI su ile durulayın.
    7. Kalıp içinde oda sıcaklığında tamamen kurumaya (yaklaşık 20 ° C) 30 dk için MPC Polimer 30 µL bırakın. Şekil 2B fabrikasyon prizma kalıp gösterir.
  2. Bir silindir kalıp imalatı
    1. İstediğiniz boyutta bir çelik silindir kalıp işleme işlemi tarafından imal. Alternatif olarak, piyasada bulunan paslanmaz çelik kullanın. (Bu çalışmada, φ 600 µm silindir kullanılır.)
    2. Silindir çelik 30 µL MPC polimer için oda sıcaklığında tamamen kurumaya (yaklaşık 20 ° C) 30 dk içinde bırakın.
    3. Temel reçine ve onun katalizör karıştırarak sıvı polydimethylsiloxane (PDMS) hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek) 10:1 oranında bir vakum sistemi 20 dk için gaz giderme ile gaz giderme tarafından takip. Sonra PDMS 12 iyi tabak içinde dökün.
    4. Bir 12-iyi-plaka z-sahne hareket ettirerek aynı datum yüzeyine yerleştirilen iyileşmemiş PDMS yüzeyde dik eklenebilir çelik silindir datum yüzeye dik ve sabit bir doğrusal z-Sahne Alanı'na ayarlayın. Silindir çelik bir fırında 20 dk 90 ° C'de kür için PDMS kuluçkaya. PDMS damlalıklı aşağıdaki işlemde (şekil 2C) eklenebilir böylece bir kanat yüzey oluşturmak için kesti.

3. ilk hücre kümesi şeklinde bir hidrojel kontrol etme

  1. İstenen hücre kültürü, kollajen ve yapay membran, gibi uygun bir ECM (şekil 3A) kültür alanı dolduracak şekilde HGC enjekte.
  2. Fabrikasyon micromold HGC üzerinde doğrudan veya dolaylı olarak uygun bir sahibi ile şekil 3B' gösterildiği gibi ayarlayın. Daha sonra HGC CO2 kuluçka 37 ° C'de bu kür için 25 dakika yerleştirin.
  3. Böylece ECM (şekil 3 c) bozulmaya değil micromold çýkýntýdan. Cep, istenen kalıp şekli olarak ECM sahte olduğu.
  4. Kültürlü çanak hücrelerden tripsin-EDTA veya muadili türüne bağlı olarak hücre hasat. Daha sonra yüksek konsantrasyonlu hücreleri elde etmek için hücreleri santrifüj kapasitesi (NHBE kültürü, % 0.25 tripsin-EDTA uygulamak ve hücreleri 3 min için kuluçkaya sonra FBS içeren orta ve 300 x g 4 dk için de centrifuging ile nötralize).
  5. Centrifuging sonra hücreleri yoğunlaşmaya süpernatant orta kaldırmak ve yüksek konsantrasyonlu hücreleri (3.0 × 104 hücre/µL NHBE hücreler için) (şekil 3D) ECM cebinde içine enjekte.
  6. Böylece hücreleri micromolds tarafından oluşturulan boşluğu doldurmak üzere ECM cep içine bir CO2 kuluçka 37 ° C'de 20 dk için hücrelerle HGC kuluçkaya. Aşırı orta veya hücrelerin üst yüzeyinde mevcut, dikkatlice bir pipet kullanarak kaldırın.
  7. HGC 24-iyi-tabağa yerleştirin ve uygun orta (şekil 3E) 100 µL ekleyin. NHBE hücreler için NHBE ve endotel hücreleri ( Tablo malzemelerigörmek) için piyasada bulunan özel orta 1:1 karışımı kullanın.
  8. ECM cebinde kapatın ve sonra 25 min için 37 ° C'de kuluçkaya için ek ECM enjekte.
  9. Önceden ısıtılmış % 1.5 özel oda sıcaklığında (yaklaşık 20 ° C) için sakin. Özel yüzey kapatmak ve ECM kültür ve (şekil 3F) görüntüleme sırasında HGC dışarı düşmesini önlemek için HGC üst yüzeyinin yaklaşık 10 µL bırak. O zaman, özel tedavi için başka bir 20 dakika 37 ° C'de HGC kuluçkaya.
  10. Böylece ozmotik basınç beslenme HGC içindeki hücrelere sağlanmasında yardımcı olabilir tüm HGC kapsayacak orta ekleyin.

4. çok yönlü görüntüleme

  1. Non-invaziv 3D şekil tanıma çok yönlü gözlem tarafından
    1. Kültür çanak veya iyi plaka HGC mikroskop tarih içeren yerleştirin ve kamera çerçeve için HGC yönlendirmek. Sonra bir örnek görüntü tarafından parlak alan veya faz kontrast elde edilir.
    2. Pick up ve farklı bir yüzeye yerleştirin HGC döndürün.
    3. Her altı taraftan görüntüleri elde edilen 4.1.1 ve 4.1.2 tamamlayana dek.
  2. Çok yönlü gözlem tarafından IMMUNO florasan görüntüleme
    1. Fiksasyon için %4 paraformaldehyde için örnek HGC, oda sıcaklığında (yaklaşık 20 ° C) üzerinden 20 dk, PBS iki durular 10 dk ardından uygulamak için.
    2. HGC PBS ile permeabilize %0,5 içeren Triton X-100 4 ° C'de 10 dakika sonra PBS ile 10 dakika için 3 x yıkayın.
    3. HGC % 10 keçi serum IF arabellekte ile kuluçkaya (%0.2 Triton X-100, % 0,1 sığır serum albümin ve % 0.05 ara-20 PBS) birincil engelleme adım için oda sıcaklığında 60 dk için.
    4. Belirli bir molekül boyama için uygun antikor kullanın. Toplu hücre geometri gözlemlemek için Alexa Fluor 488 Phalloidin aktin leke için kullanılabilir.
    5. HGC bir lazer veya floresan mikroskop altında bir cam alt çanak yerleştirin ve tüm örnek görüntü elde etmek için altı yönden tarama gerçekleştirin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Normal insan bronş epitel (NHBE) hücreleri resimli metodoloji göstermek ve bir silindir şekli ve sırasıyla ECM ortamında bir prizma şekil elde etmek için ilk toplu hücre geometri denetlemek için kullanılmıştır. Faz kontrast yanı sıra tarafından bir silindir şekli (şekil 4AB) ve (şekil 4 cD) prizma şekli phalloidin boyama elde edilen çok yönlü görüntüleme sonuçları sunulmuştur. Hücreleri ECM ortam...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu raporda sunulan yöntem basit ve yüksek teknoloji ekipman yapılabilir. Aynı anda, kesin hücre küme şekil denetimi sonucunda hidrojel 3B alanda elde edilebilir. İlk kontrol sonra bir tabak üzerinde kültürlü oldukları gibi hücreleri HGC içinde büyüyebilir. Çok yönlü görüntüleme herhangi bir mikroskobu sistemi kullanılarak HGC ile örnek döndürerek gerçekleştirilir ve görüntüleme kalitesi önemli ölçüde artırır. Biyouyumlu oldukları gibi HGC çerçeve ve micromold için malzeme seçimi esnektir. Bir 3D printerlere harcama madde...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ve Osaka ili üniversite ve Kyushu Teknik Üniversitesi bir melez jel küp aygıt ve Nippon tıbbi ve kimyasal aletler Co Ltd için bir patent başvurusu bulundular, Japonya son zamanlarda küp ticari. Şirket herhangi bir tasarım, süreç ve yöntemleri açıklanan etkilemedi.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser mali JSP'ler KAKENHI (18 H 04765) ve görev süresi parça sistemi yaymak, MEXT, Japonya için Program tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12 kuyuluplaka Corning  Inc.3513
2-Metoksi-1-metiletil AsetatFUJIFILM Wako Saf Kimya A.Ş.130-10505PGMEA, CAS: 108-65-6 
% 4 paraformaldehitFUJIFILM Wako Saf Kimya A.Ş.161-20141CAS: 30525-89-4
Agaroz, düşük jelleşme sıcaklığı  BioReagentSigma-AldrichA9414
Alexa fluor 488 phalloidinThermo Fisher ScientificA12379
AZ1512Merck
BEGM mermi kitiLonzaCC-3170NHBE hücreleri için özel ortam
Sığır Serumu Albümin çözeltisi (%10)Sigma-AldrichA1595
EGM-2 mermi kitiLonzaCC-3162Endotel hücreleri için özel ortam
Lipidure,NOF co.MPC polimer
Matrigel büyüme faktörü azaltılmış bazal membran matrisiCorning  Inc.354230
Normal Keçi Serumu (%10)Thermo Fisher Scientific50197Z
Normal insan bronşiyal epitel hücreleriLonzaCC-2541
SILPOT 184 W/CDow Corning Co.3255981
DJ MicroLaminates, IncKalın negatif fotorezist (kalınlık: 300 mm)
Triton X-100 (%1)Thermo Fisher ScientificHFH10
Tripsin-EDTA (%0,25)Thermo Fisher Scientific25200056
TWEEN 20Sigma-AldrichP9416
, PDMS SUEX D300 için baz reçine ve katalizör

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  2. Sasai, Y. Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture. Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).
  3. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  4. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  5. Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin- cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
  6. Hannezo, E., Prost, J., Joanny, J. -F. Theory of epithelial sheet morphology in three dimensions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 27-32 (2014).
  7. Tawk, M., et al. A mirror-symmetric cell division that orchestrates neuroepithelial morphogenesis. Nature. 446 (7137), 797-800 (2007).
  8. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-58 (2011).
  9. Zegers, M. M. P., O’Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro. Trends in Cell Biology. 13 (4), 169-176 (2003).
  10. Affolter, M., Bellusci, S., Itoh, N., Shilo, B., Thiery, J. P., Werb, Z. Tube or not tube: Remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis. Developmental Cell. 4 (1), 11-18 (2003).
  11. Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  12. Huisken, J., et al. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. , 1007-1009 (2004).
  13. Hagiwara, M., Kawahara, T., Nobata, R. Tissue in Cube: In Vitro 3D Culturing Platform with Hybrid Gel Cubes for Multidirectional Observations. Advanced Healthcare Materials. 5 (13), 1566-1571 (2016).
  14. Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. Large Scale Imaging by Fine Spatial Alignment of Multi-Scanning Data with Gel Cube Device. Applied Sciences. 8 (235), (2018).
  15. Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3179-3184 (2016).
  16. Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J., Markwald, R. R. Organ printing: Tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
  17. Onoe, H., et al. Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions. Nature Materials. 12 (6), 584-590 (2013).
  18. Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).
  19. Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. High repeatability from 3D experimental platform for quantitative analysis of cellular branch pattern formations. Integrative Biology. 10, 306-312 (2018).
  20. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
  21. Murray, E., et al. Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hybrid Gel Cube3D Cell CultureInitial Cell ClusterExtracellular MatrixMicromold FabricationMultidirectional ImagingPhase Contrast MicroscopyImmunofluorescent ImagingNormal Human Bronchial Epithelial CellsRepeatable Pattern Formation

Related Articles