RNA Interactors Protein kinaz memeli hücre döngüsü sırasında RNA-harekete geçirmek, eğitim

Protein kinaz (PKR) RNA-harekete geçirmek, olarak da bilinen ökaryotik başlama faktör 2-Alfa kinaz 2 (EIF2AK2), RNA'ların tarafından sağlanan bilgi ileten bir iyi karakterize protein kinaz var. Ökaryotik çeviri başlatma 2 alt birim alfa (eIF2α) ait kinaz aile ve serin 51 yanıt olarak küresel çeviri¹bastırmak için enfeksiyon, eIF2α phosphorylates. Bu bağlamda, PKR PKR dimerization ve autophosphorylation²için bir platform sağlamak viral çift iplikçikli RNA (dsRNAs), tarafından etkinleştirilir. EIF2α ek olarak, PKR da p53, insülin reseptör substrat 1, inhibitörü κB ve c-Jun N-terminal kinaz (JNK) çok sayıda sinyal iletim yollarının^{3,4,5, etkinliği düzenleyen fazdan 6}.

PKR aslında poliovirus'dsRNAs^7,8tanıyarak poliovirus enfeksiyon sırasında eIF2α fosforile kinaz olarak tespit edilmiştir. PKR giderek bağışıklık yanıtı ötesinde çok yönlü rolleri oynamak için bulunur ve onun anormal harekete geçirmek ya da arıza çok sayıda insan hastalıklarda ima etti. Aktif/Phosphorylated PKR (pPKR) apoptosis sırasında sık sık gözlenen ve dejeneratif hastalıklar, özellikle gibi Huntington nörodejeneratif hastalıklar, Parkinson'ın ve Alzheimer hastalığı^{9 hastalarda genel özelliği olduğunu ,10,11,12,13}. Buna ek olarak, PKR metabolik stres ve ısı şok^14,15,16,17gibi çeşitli stres koşullarında etkinleştirilir. Öte yandan, PKR inhibisyonu artan hücre çoğalması ve hatta Malign transformasyon^18,19ile sonuçlanır. PKR işlevi de normal beyin işlevinde önemli ve pPKR düzeyi olarak hücre döngüsü sırasında sırasında M faz^20,21,22yükseltilmiş. Bu bağlamda pPKR küresel çeviri bastırır ve uygun hücre bölünmesi²⁰için gerekli olan anahtar Mitotik sinyal sistemleri için ipuçları sağlar. Ayrıca, uzun süreli PKR aktivasyonu hücre döngüsü tutuklama Çin hamster yumurtalık içinde²³hücreleri G2/M aşamasında sonuçlandı. Sonuç olarak, PKR fosforilasyon sırasında M/G1 geçiş²¹hızlı devre dışı bırakma sağlamak için negatif geribesleme tarafından düzenlenmiştir.

PKR geniş aralığı işlevi rağmen PKR harekete geçirmek anlayışımızı yakalamak ve PKR etkinleştirebilirsiniz dsRNAs tanımlamak için standart yüksek üretilen iş deneysel yaklaşım eksikliği nedeniyle sınırlıdır. PKR iki ters Alu yineler (IRAlus)^20,24, ama PKR hücre döngüsü sırasında veya altında etkinleştirebilirsiniz ek hücresel dsRNAs varlığı olasılığını tarafından kurulan dsRNAs ile etkileşim kurabilir önceki çalışmalar göstermiştir insan hücreleri stres koşullarında keşfedilmemiş. RNA-interactors bir RNA bağlayıcı protein (RBP) belirlenmesinde geleneksel yaklaşım UV ışık crosslink RNA-RBP kompleksleri^25,26,27için kullanılır. Yeni yapılan bir çalışmada bu UV crosslinking yaklaşım bir fare sisteminde uygulanan ve küçük genelde RNA'ların PKR etkinleştirme sırasında metabolik stres¹⁶düzenleyen teşhis etti. Formaldehit verimliliğini yüksek crosslinking kullanarak, biz PKR etkileşim RNA'ların HeLa hücreleri²⁸Hücre döngüsünde sırasında tanımlamak için alternatif bir yöntem sundu. Benzer bir yaklaşım Staufen ve Drosha^29,30,31gibi diğer dsRBPs çalışma uygulandı. Bulduğumuz gibi kısa serpiştirilmiş nükleer öğesi (sinüs), uzun Nükleer öğesi (satır), endojen retrovirüsü öğesi (modül) ve hatta Alfa-uydu RNA'ların serpiştirilmiş PKR kodlamayan RNA'ların türleri ile etkileşim kurabilir. Buna ek olarak, biz PKR ağır iplikçik ve ışık arasında tamamlayıcı etkileşimi aracılığıyla hangi formu cins dsRNAs RNA'ların²⁸strand mitokondrial RNA'lar ile (mtRNAs), etkileşim içinde olduğunu gösterdi. Son yayın daha fazla desteklenen bizim veri bazı mtRNAs bir çift yönlü formunda yer alan ve dsRNA sensörleri interferonlar³²ikna etmek için Melanom farklılaşma ilişkili protein 5 gibi etkinleştirebilirsiniz. Daha da önemlisi, ifade ve mtRNAs hücre altı yerelleştirme hücre döngüsü sırasında ve tarafından çeşitli stresler, PKR harekete geçirmek²⁸düzenleyen yeteneğini önemli olabilecek modülasyonlu.

Bu makalede, biz son zamanlarda geliştirilen formaldehit crosslinking ve immunoprecipitation (fCLIP) için detaylı bir protokolü mevcut yakalamak ve RNA'ların PKR etkileşim hücre döngüsü sırasında analiz yöntemi. Hücre döngüsü tutuklama örnekleri timidin ve nocodazole kullanarak hazırlamak için yöntemi göstermektedir. Biz o zaman fCLIP işleminin PKR bağımlı RNA'ların ve bu RNA'ları tanımlamak için bir yöntem yüksek üretilen iş sıralama kitaplığı hazırlamak için izole etmek için mevcut. Ayrıca, biz PKR bağımlı RNA'ların qRT-PCR kullanarak analiz ile ilgili ayrıntılı yordamlar betimlemek. Özellikle, biz mtRNAs strandedness analiz etmek için bir iplikçik özgü ters transkripsiyon yordam mevcut. Açıklanan protokol HeLa hücreleri ve PKR için optimize edilmiştir, ancak hücre döngüsü örnek, fCLIP ve strand özgü qRT-PCR analizleri hazırlanması gibi önemli adımlar kolayca hücresel dsRNAs çalışmaya ya da diğer dsRBPs, RNA interactors belirlemek için değiştirilebilir.

1. çözüm ve hücre hazırlık

1. Çözüm hazırlık
   1. Hücre kültür ortamı için orta HeLa hücre kültürü için 50 mL fetal sığır serum (FBS) ekleyerek 500 mL Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) için hazır olun.
      Not: Antibiyotik hücre kültür ortamına eklenebilir, ancak biz antibiyotik kullanmayın.
   2. %0,1 paraformaldehyde için 1 %4 (w/v) paraformaldehyde erimesi x Phosphate-Buffered serum fizyolojik (%0,1 (v/v) paraformaldehyde 30 mL 1 x PBS ekleyerek yapmak için PBS) Isıtma sıcak tabakta ve seyreltik ile.
      Dikkat: bir duman mahallede tüm adımlarını gerçekleştirin ve paraformaldehyde çözüm kaynatın değil dikkatli olun. % 0,1 çözüm ışıktan korumak ve 4 ° C'de depolayın Bir ay içinde çözüm kullanın.
      Not: Son %0,1 (v/v) paraformaldehyde çözüm pH 7 civarında olmalıdır.
   3. FCLIP lizis arabellek hazırlamak: 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 15 mM NaCl, 10 mM EDTA, %0,5 (v/v) nonidet-p40 (NP-40), (v/v) Triton X-100, % 0,1 %0,1 (v/v) Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) ve % 0.1 (w/v) sodyum deoxycholate. Üçlü distile su (TDW) için 40 mL ekleyin. 4 ° C'de mağaza
   4. FCLIP yıkama arabellek hazırlamak: 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, %0,1 (v/v) NP-40, %0,1 (v/v) Triton X-100, (v/v) SDS % 0,1 ve %0,1 (w/v) sodyum deoxycholate. TDW 40 mL ekleyin. 4 ° C'de mağaza
   5. 4 PK arabellek x hazırlamak: 400 mM Tris-HCl (pH 7.5), 200 mM NaCl, 40 mM EDTA ve % 4 (v/v) SDS. TDW 40 mL ekleyin. Oda sıcaklığında saklayın.
   6. FCLIP elüsyon arabellek hazırlamak: 4 PK arabellek, üre 21 g ve TDW 8,5 mL x 20 mL. Taze hazırlayın.
   7. RNA elüsyon arabellek hazırlamak: 0.3 M NaOAc ve %2 (w/v) SDS. Oda sıcaklığında saklayın.
   8. 2 x RNA yükleme boya hazırlamak: % 0,025 (w/v) bromophenol mavi, (w/v) % 0,025 Ksilen cyanol, 5 mM EDTA, %0.05 (w/v) SDS ve %95 (v/v) formamide. -20 ° C'de mağaza
   9. 1 x TBE arabellek hazırlamak: 0.089 M Tris-Bor ve 0.002 M EDTA. 500 mL TBE tampon hazırlayın.
2. S veya M faz tutuklandı hücre hazırlanması
   1. HeLa hücreleri S veya M faz tutuklandı örnekleri için sırasıyla tohum ~ 750.000 veya ~ 1.000.000. 37 ° C ve % 5 CO₂ 24 h için hücrelerin büyümesine.
   2. 2 mM timidin hücrelerle tedavi etmek ve 18 h 37 ° C'de için kuluçkaya
   3. Hücreleri iki kez PBS ile yıkayın. Taze medya ekleyin ve 37 ° C'de 9 h için kuluçkaya
   4. S hücreler için faz tutuklandı, 2 mM timidin hücrelerle tedavi. M hücreler için faz tutuklandı, 100 ng/mL nocodazole hücrelerle tedavi. 15 h 37 ° C ve hasat hücreleri için kuluçkaya.
      Not: Hücre döngüsü örnekleri polimerlerin FACS kullanarak kontrol edilebilir.

2. formaldehit cross-linking ve immunoprecipitation

1. Hücre hasat
   1. Bir S faz örnek için hücreleri hücre kazıyıcı ve transfer 15 mL konik tüp içine toplamak. M faz örneği için M hücreleri faz tutuklandı ayırmak ve 15 mL konik tüp içine aktarmak için hücre kültür çanak yan dokunun.
      Not: bir hücre kazıyıcı faz tutuklandı M hücreleri polimerlerin artırmak için kullanmayın.
   2. 380 x g 3 dk. Kaldır için oda sıcaklığında, hücreleri süpernatant santrifüj kapasitesi ve 1 mL soğuk PBS ve transfer içine 1.5 mL microcentrifuge tüp ile yeniden askıya alma.
   3. 10.000 x g 4 ° c de hücreler için 30 s. Kaldır süpernatant tamamen santrifüj kapasitesi.
2. Formaldehit crosslinking
   1. % 0.1 paraformaldehyde 10 dk için 750 μL hücreleri düzeltmek için oda sıcaklığında ekleyin.
   2. 1 M glisin 250 μL ekleyin ve ek bir 10 min tepki gidermek için oda sıcaklığında kuluçkaya. 10.000 x g 4 ° c de hücreler için 30 s. Kaldır süpernatant tamamen santrifüj kapasitesi.
   3. PBS 1 mL ile yeniden askıya alma. 10.000'hücreleri santrifüj kapasitesi 30 s ve Kaldır süpernatant için 4 ° C'de g x.
   4. FCLIP lizis arabelleği %0,2 (v/v) proteaz inhibitörü ve %2 (v/v) RNase inhibitörü ile 400 μL ile yeniden askıya alma. 10 dakika buz üzerinde kuluçkaya ve bir ultrasonicator kullanarak solüsyon içeren temizleyicide.
   5. ~ 150 mm NaCl toplama ayarlamak için 5 M NaCl 11 μL ekleyin. Kısaca girdap ve 21,130 x g 4 ° c de 15 dakika süreyle santrifüj süpernatant önceden soğutulmuş 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın.
      Not: yeni bir santrifüj tüpü süpernatant ile 40 μL giriş örnek olarak korur. Mağaza giriş örneği 4 ° c '
3. Immunoprecipitation
   1. Protein A boncuk 20 μL 1.5 mL microcentrifuge tüp içine ekleyin.
   2. Boncuk fCLIP lizis arabelleği 400 μL ile yıkayın. 1000 x g 1 dk. Kaldır 4 ° C'de, boncuk süpernatant santrifüj kapasitesi ve fCLIP lizis arabelleği 400 μL dikkatle ekleyin. Yavaşça boncuk 3 ters çevirme tarafından yeniden askıya alma ~ 4 kez.
   3. Yıkama üç kez tekrarlayın. Son yıkama sonra tamamen süpernatant kaldırın.
   4. Boncuk fCLIP lizis arabellek 300 μL içinde yeniden askıya alma. ~ 150 mm NaCl toplama ayarlamak için 5 M NaCl 8.3 μL ekleyin. PKR antikor 10 μL ekleyin ve bir rotator 4 ° C'de 3 h için kuluçkaya
   5. 1000 x g 1 dk. Kaldır 4 ° C'de, boncuk süpernatant santrifüj kapasitesi ve fCLIP yıkama arabelleği 400 μL ekleyin. Yavaşça boncuk 3 ters çevirme tarafından yeniden askıya alma ~ 4 kez.
   6. Yıkama adım iki kere tekrar edin. Son yıkama sonra tamamen süpernatant kaldırın.
      Not: Hiç bir girdap karıştırıcı kullanın. Tüp elinizle yavaşça tersine çevirin.
   7. Lysate, 300 μL ekleyin ve bir rotator üzerinde 4 ° C'de 3 h için kuluçkaya.
      Not: Artan arka plan bağlamada daha uzun kuluçka süresi neden olabilir.
   8. 1000 x g 1 dk. Kaldır 4 ° C'de, boncuk süpernatant santrifüj kapasitesi ve fCLIP yıkama arabelleği 400 μL ekleyin. Yavaşça boncuk 3 ters çevirme tarafından yeniden askıya alma ~ 4 kez.
   9. Yıkama üç kez tekrarlayın. Son yıkama sonra tamamen süpernatant kaldırın.
   10. FCLIP elüsyon arabelleği 300 μL ekleyin. Bir thermomixer 3 h PKR boncuk elute için 25 ° c için kuluçkaya.
       Not: fCLIP elüsyon arabellek taze hazırlayın.
   11. 1000 x g oda sıcaklığında, santrifüj kapasitesi ve süpernatant temiz bir siliconized tüp aktarın.
       Not: Bir microcentrifuge tüp de ok, ama silikonlu tüp de crosslinking adım (Adım 2.3.12) sırasında buharlaşma önlemek için tercih edilir.
   12. 300 μL İndinavir K, (20 mg/mL) eklemek ve bir gecede 65 ° C'de kuluçkaya
       Not: buharlaşma önlemek için ısıtmalı kapaklı bir thermomixer kullanın.
4. RNA çıkarma
   1. Asit-fenol kloroform ve girdap 580 μL 1 h için 37 ° C'de 30 s. Incubate ekleyin.
   2. Girdap 30 s ve 10 min için 12.000 x g oda sıcaklığında, santrifüj için.
   3. Üst katmanı bir temiz 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. 3 M NaOAc, coprecipitant (örneğin, Glycoblue) 0.5 μL ve isopropanol eşit bir hacmi 1/10 hacmi ekleyin. Gecede-20 ° C'de kuluçkaya
   4. Granül 1 h için 4 ° C'de maksimum hızda centrifuging tarafından çökelti.
      Not: RNA/DNA parçaları gözlendi değil, RNA/DNA parçaları gözlenen kadar coprecipitant ve santrifüj ek 1 h devam Bu adım için bir ek 0,5 μL ekleyin.
   5. Süpernatant kaldırın ve 1 mL % 75 etil alkol ekleyin. 5 dakika süreyle santrifüj, 12.000 x g 4 ° C'de yıkama adım bir kez daha yineleyin. Süpernatant tamamen kaldırmak ve oda sıcaklığında Pelet Makinası.
   6. 1s için 37 ° C'de TDW, ben tampon Dnaz 5 μL, 1 μL RNase inhibitörü ve 2 μL Dnaz ı. kuluçkaya, 42 μL ekleyin.
   7. TDW 150 μL ve asit-fenol kloroform 200 μL ekleyin. 10 dk için 12.000 x g oda sıcaklığında, 30 s. santrifüj için girdap.
   8. Üst katmanı bir temiz 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. 3 M NaOAc, coprecipitant, 0.5 μL ve % 100 etil alkol 1 mL 20 μL ekleyin. Gecede-80 ° C'de kuluçkaya
   9. Granül çökelti ve 2.4.4-2.4.5 adımlarda açıklandığı gibi % 75 etil alkol ile yıkayın.
   10. TDW uygun miktarda yeniden askıya alma.

3. Sıralama kitaplığı hazırlık

1. rRNA kaldırma
   1. TDW 28 μL adımla 2.4.10 RNA çökeltilerini yeniden askıya alma.
      Not: Toplam RNA en fazla 5'ten μg olmalıdır.
   2. RRNA kaldırmak için rRNA kaldırma Kit'in başvuru kılavuzu tarafından sağlanan yordamları izleyin.
   3. Temiz rRNA kadar manyetik boncuklar 160 μL ekleyerek RNA'ların tükendi.
      1. ~ 15 kez pipetting tarafından mix ve 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
      2. Manyetik çubuk Tüp takmak ve süpernatant kaldırın.
      3. Boncuk hala manyetik çubuğunda eklenir ve 30 için kuluçkaya % 80 etil alkol 300 μL eklemek s.
      4. Etil alkol yerine koymak ile taze bir 300 μL eriyik. Hava Kuru oda sıcaklığında 12 dk için manyetik çubuğu üstündeki.
      5. Boncuk TDW ve mix 12 μL 15 kez pipetting tarafından yeniden askıya alma.
      6. Manyetik çubuğunun üstündeki eklemek ve süpernatant temiz bir PCR tüp taşımak.
   4. Parçalanmış ribozomal RNA (rRNA'lar) tükenmesi Kit rRNA tarafından sağlanan yordamı tüketmek.
   5. RNA'ların kadar manyetik boncuklar ve yinelenen adımlar 3.1.3.1 3.1.3.6 110 μL ekleyerek temiz.
2. RNA etiketleme ve adaptör ligasyonu
   1. RRNA tükenmiş RNA'ların üzerinde 10 x CIAP arabelleğinin 2 μL, 1 μL RNase inhibitörü ve Antarktika alkalen fosfataz 2 μL ekleyin. 37 ° C için 1 h ve daha sonra 65 ° C fosfataz devre dışı bırakabilirsiniz 5 min için kuluçkaya.
   2. 10 x PNK arabelleği 3 μL, 1,5 μL RNase inhibitörü, T4 PNK enzim, r-ATP 0.8 μL ve TDW 1.7 μL 1,5 μL ekleyin. 50 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
   3. 10 mm ATP 1,5 μL ekleyin ve ek 40 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
   4. Reaksiyon 170 μL RNA elüsyon arabelleği ekleyerek durdurmak.
   5. Asit-fenol kloroform ve girdap 200 μL 12.000 x g oda sıcaklığında, 30 s. santrifüj 10 dakika için ekleyin.
   6. Üst katmanı bir temiz 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. 3 M NaOAc, coprecipitant, 0.5 μL ve % 100 etil alkol 1 mL 20 μL ekleyin. Gecede-80 ° C'de kuluçkaya
   7. RNA granül çökelti ve 2.4.4-2.4.5 adımlarda açıklandığı gibi % 75 etil alkol ile yıkayın. TDW 4,5 μL içinde yeniden askıya alma ve 2 x RNA yükleme boya 9 μL ekleyin.
   8. Örnek 5 min ve % 10 üre-sayfa jel üzerindeki yükü için 95 ° c ısı.
   9. Jel 370 V 40 min için çalıştırın.
      Not: jel 370 V 90 dk için örnek yüklemeden önce önceden çalıştırın.
   10. Jel ~ 100-500 nükleotit bölge kesmek ve jel kesin.
   11. 0.3 M NaCl 700 μL ekleyin ve bir gecede bir rotator üzerinde 4 ° C'de kuluçkaya.
   12. Çözüm bir sütun ve 5 min için oda sıcaklığında maksimum hızda santrifüj aktarın.
   13. Eluate temiz 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. 3 M NaOAc, coprecipitant, 0.5 μL ve isopropanol eşit bir hacmi 1/10 hacmi ekleyin. Gecede-20 ° C'de kuluçkaya
3. 3' adaptör ligasyonu
   1. RNA granül çökelti ve 2.4.4-2.4.5 adımlarda açıklandığı gibi % 75 etil alkol ile yıkayın.
   2. RNA granül TDW 6.5 μL içinde yeniden askıya alma ve 10 mikron 3' adaptör 1 μL ekleyin.
   3. Çözüm bir PCR tüp aktarmak ve 70 ° c 2 min için kuluçkaya.
   4. 10 x ligasyonu arabelleği 1 μL, 0.5 μL RNase inhibitörü ve T4 RNA ligaz 2 in 1 μL ekleyin. 28 ° c için 1 h, 25 ° C 6 h ve 22 ° C 6 h için kuluçkaya.
   5. 2 x RNA yükleme boya ve ısı 12 μL 95 ° c 5 min için ekleyin.
   6. Jel arındırmak 3' adaptör bakmaksızın RNA'ların 3.2.9-3.2.13 içinde açıklandığı gibi.
4. 5' adaptör ligasyonu
   1. RNA granül çökelti ve 2.4.4-2.4.5 adımlarda açıklandığı gibi % 75 etil alkol ile yıkayın.
   2. RNA granül TDW 4.2 μL içinde yeniden askıya alma ve 5 mikron 5' adaptör 1 μL ekleyin.
   3. Çözüm bir PCR tüp aktarmak ve 70 ° c 2 min için kuluçkaya.
   4. 10 x ligaz arabelleği, RNase inhibitörü, 10 mm ATP, T4 RNA ligaz 1 0,8 μL 0.8 μL 0.4 μL 0.8 μL ekleyin. 28 ° c için 1 h, 25 ° C 6 h ve 22 ° C 6 h için kuluçkaya.
5. Ters transkripsiyon ve PCR güçlendirme
   1. 5' bağdaştırıcısında ve birleştirilmiş RNA'ların, 4 mikron ters transkripsiyon astar 1 μL ekleyin. 70 ° c 2 min için kuluçkaya ve hemen 4 ° C'ye serin
   2. 5 x FS arabelleği 4 μL, 2.5 mM dNTP 4 μL, 0.1 M DTT, 1 μL RNase inhibitörü ve transkriptaz 1 μL 1 μL ekleyin. 50 ° c için 1 h ve 70 ° C 15dk için kuluçkaya.
   3. PCR güçlendirme hazırlamak
      1. Mix 1 μL RT ürün, 1 μL 25 mikron RPI astar, 1 μL 25 mikron RP1 astar, 5 x HF arabellek, 2.5 mM dNTP 4 μL, TDW 32,5 μL 10 μL ve yüksek sadakat polimeraz 0.5 μL.
      2. PCR programı 11 ~ 13 döngüleri.
         Not: PCR programdır: 30 98 ° C s, 98 ° C 10 için sıcak bir başlangıç için s, 60 ° C 30 45 72 ° C ve s s amplifikasyon ve 5 min için 72 ° C için. Amplifikasyon adım 11-13 döngüleri için yinelenir.
   4. Manyetik boncuklar ve aşağıdaki adımları 3.1.3.1 3.1.3.6 40 μL kullanarak ama TDW 10 μL DNA elute kullanarak PCR ürünleri kadar temiz.
   5. 10 x DNA yükleme boya 2 μL ekleyin. Örnek % 6 Akrilamid jel üzerinde yük ve 200 V 30 dk için çalıştırın.
   6. Sybr altın (%0.01 (v/v) 1 x TBE arabelleği) oda sıcaklığında 5 min için leke.
   7. 1 x TBE tampon oda sıcaklığında 5 min için de-leke.
   8. Jel ~ 200-700 nükleotit bölge kesmek ve jel kesin.
   9. 0.3 M NaCl 700 μL ekleyin ve gecede DNA elute için oda sıcaklığında kuluçkaya.
   10. Her şey bir sütun ve 5 min için oda sıcaklığında maksimum hızda santrifüj üzerine yükleyin.
   11. Eluate temiz 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. 3 M NaOAc, coprecipitant, 0.5 μL ve isopropanol eşit bir hacmi 1/10 hacmi ekleyin. Gecede-20 ° C'de kuluçkaya
   12. DNA granül çökelti ve 2.4.4-2.4.5 adımlarda açıklandığı gibi % 75 etil alkol ile yıkayın. TDW 20 μL içinde yeniden askıya alma.
   13. Bir sequencer kullanarak örneğini analiz.

4. analiz RNA'ların PKR etkileşim qRT-PCR kullanarak

1. Yöntem 1: Rasgele hexamer ters transkripsiyon
   1. TDW 8,5 μL adımla 2.4.10 RNA çökeltilerini yeniden askıya alma ve çözüm için PCR tüp aktarın.
   2. 100 μm kalınlığında rasgele hexamers 0.5 μL ve 4 μL 2.5 mM dNTP karışımı ekleyin.
   3. Isı 65 ° c 5 min için ve hemen çözüm kuluçkaya en az 1 dakika buzda.
   4. Mix tepki olun: 5 x SSIV arabellek 4 μL, 100 mm DTT, 1 μL RNase inhibitörü ve ters transkriptaz (200 U/μL) 1 μL 1 μL. RNA tepki karışımı ekleyin.
   5. Karışımı 10 dakika, 10 min 50 ° C 23 ° C'de kuluçkaya ve 10 dk 80 ° C.
   6. Bir gerçek zamanlı PCR sistemi kullanarak cDNA analiz.
      Not: Gerçek zamanlı PCR programdır: 95 ° C sıcak başlangıç, 95 ° C 5 için 3 min için s ve 60 ° C 10 s amplifikasyon ve 95 ° C 30 s, 65 ° C 30 s ve 95 ° C 30 s eritmek için. Amplifikasyon adım 40 döngüleri için yinelenir.
2. Yöntem 2: Strand özgü ters transkripsiyon
   1. Ters astar ana karışımı hazırlar: CMV organizatörü sıra içeren gen belirli ters transkripsiyon astar eşit miktarda gen belirli dizileri ~ 20 nükleotit tarafından takip Mix.
      Not: Kombine tüm gen belirli RT astar 4 mikron bölgedir.
   2. TDW 8,5 μL adımla 2.4.10 RNA çökeltilerini yeniden askıya alma ve çözüm için PCR tüp aktarın.
   3. 4 mikron ana karışımı ters transkripsiyon astar ve 2.5 mM dNTP Mix 4 μL 0.5 μL ekleyin.
   4. Isı 65 ° c 5 min için ve hemen çözüm kuluçkaya en az 1 dakika buzda.
   5. Reaksiyon çözüm 4 μL 5 x SSIV arabelleği, 100 mm DTT, 1 μL RNase inhibitörü ve ters transkriptaz (200 U/μL) 1 μL 1 μL karıştırarak hazırlayın. Reaksiyon çözüm RNA-astar karışıma ekleyin.
   6. Çözüm 50 ° C'de 10 dakika ve 10 dk 80 ° C kuluçkaya.
   7. Gerçek zamanlı PCR sistemi kullanılarak cDNA analiz.
      Not: Program gerçek zamanlı PCR için yöntem 1'da açıklanan gibi.

Hücre döngüsü S veya M aşamasında HeLa hücreleri tutuklamaya işleminin şematik Resim 1' de gösterilen. M faz tutuklandı bir örnek, açıkça (şekil 2A) mikroskop altında yuvarlak şekilli hücreler görselleştirebilirsiniz. Hücre döngüsü tutuklama verimliliğini incelemeye, nükleer hücre içeriğini FACS (şekil 2B) kullanılarak analiz edilebilir. Şekil 3 D7F7 antikor immunoprecipitate PKR üstün yeteneği gösterir nerede immunoprecipitation verimlilik testi için temsilcisi verileri gösterir. Bu farklılığı immunoprecipitation verimliliği sınıfı dağıtım iki farklı PKR antikorlar (şekil 4) kullanılarak hazırlanan yüksek üretilen iş sıralama kütüphanelerin tutarsızlık olarak yansıyan. D7F7 antikor özgüllüğü daha fazla PKR immunoprecipitate (şekil 5A) ve toplam hücresini lysate (şekil 5B) tüm leke Batı analizi kullanılarak doğrulanır. Şekil 6 önce ve yüksek işlem hacmi sıralama kitaplığı hazırlık sırasında rRNA'lar çıkarıldıktan sonra Radyoizotop sinyal gösterir. Şekil 7 mtRNAs zenginleştirme RNA'ların co-immunoprecipitated PKR ile ama RNA'ların co-immunoprecipitated tavşan IgG veya DiGeorge sendromu kromozom bölgesinde 8 (DGCR8) ile gösterir. Şekil 8 gösterir temsilcisi strand belirli PKR bağlı mtRNAs S veya M-faz qRT-PCR analizi örnekleri tutuklandı.

Şekil 1: hazırlık hücre döngüsü tutuklama örnekleri için şematik. (A, B) S(a)veya M (B) faz tutuklandı HeLa hücreleri hazırlanması şemaları. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: Hücre döngüsü analizi örnekleri tutuklandı. (A)faz kontrast görüntüler S veya M faz tutuklandı örnekleri. Çubuklar 250 Mikron gösterir. (B) FACS analizi örnekleri nükleer içeriğini gösteren. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: Immunoprecipitation verimlilik testi PKR karşı antikorlar. PKR bağımlı RNA'ların başarılı zenginleştirme için bir antikor D7F7 antikor gibi kesin immunoprecipitation verimlilik ile kullanılmalıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: RNA sınıf dağıtım farklı PKR antikorları kullanılarak hazırlanan sıralama kütüphanelerin. FCLIP için farklı PKR antikorları kullanarak eşlenen sıralama okuma farklı sınıf dağılımı içinde sonuçlandı. Uyuşmazlık immunoprecipitation verimliliği farklılıkları nedeniyle muhtemeldir. Bu rakam Kim vd.28değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5: D7F7 PKR antikor özgüllüğü. (A, B) PKR immunoprecipitated(a)veya toplam HeLa lysate (B) tüm leke Batı analizi PKR, boyutuna karşılık gelen tek bir güçlü grup D7F7 antikor PKR tanıma konusunda çok özel olduğunu belirten gösterdi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 6: Radyoizotop sinyal PKR co-immunoprecipitated RNA'ların için. (A)PKR co-immunoprecipitated RNA'ların kendi amaçları 5' r-ATP ile etiketleme tarafından tespit. (B) azalma radioistope sinyal içinde başarılı rRNA kaldırma üzerine gözlendi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 7: doğrulama PKR mtRNA etkileşimlerin. MtRNAs2 kat zenginleştirme RNA'ların co-immunoprecipitated belirtilen antikorlar ile giriş. Sadece PKR co-immunoprecipitated RNA örnek mtRNAs güçlü zenginleştirme gösterdi. Tavşan IgG ve DGCR8 antikor negatif denetimler olarak kullanılmıştır. Bu rakam Kim vd.28değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 8: Strand özgü qRT-PCR analizi PKR bağlı mtRNAs. (A, B) Strand özgü ters transkripsiyon co-immunoprecipitated S(a)veya (B) M hücreleri faz tutuklandı için PKR ile vardı mtRNAs strandedness analiz etmek için kullanıldı. Bu rakam Kim vd.28değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Yazarlar ifşa gerek yok.