Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

RNA Interactors Protein kinaz memeli hücre döngüsü sırasında RNA-harekete geçirmek, eğitim

6.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/59215

⸱

5 Mart 2019

 ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering and KI for Health Science and Technology (KIHST), Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST)

Bu makalede

Özet

Memeli hücre HeLa hücreleri kullanarak döngüsü sırasında eğitim RNA-interactors için çift iplikçikli RNA bağlayıcı protein kinaz (PKR) RNA-harekete geçirmek ve deneysel yaklaşımlar mevcut. Formaldehit crosslink RNA-PKR kompleksleri ve immunoprecipitation PKR bağımlı RNA'ların zenginleştirmek için bu yöntemi kullanır. Bu RNA'ların daha da yüksek üretilen iş sıralama veya qRT-PCR ile çözümlenebilir.

Özet

Protein kinaz (PKR) RNA-harekete geçirmek doğuştan gelen bağışıklık yanıtı proteinler üyesidir ve viral RNA'ların çift iplikçikli ikincil yapısını tanır. Viral çift iplikçikli RNA (dsRNAs) bağlandığında, PKR dimerization ve sonraki autophosphorylation uğrar. Fosforile PKR (pPKR) aktif hale gelir ve fosforilasyon bir alfa alt birimi ökaryotik başlama Factor global çeviri bastırmak için 2 (eIF2α) neden olmaktadır. Kanıt artan PKR hücre döngüsü sırasında gibi fizyolojik koşullar altında veya enfeksiyonu olmadan çeşitli stres koşullarında etkinleştirilebilir öneriyor. Ancak, PKR RNA aktivatörler anlayışımızı yakalamak ve PKR etkileşim dsRNAs analiz için standart bir deneysel yöntem eksikliği nedeniyle sınırlıdır. Burada, bir deneysel mevcut özellikle zenginleştirmek ve PKR çözümlemek için iletişim kuralı bağlı RNA'ların HeLa hücreleri kullanarak hücre döngüsü sırasında. Biz verimli crosslinking etkinlik formaldehit PKR-RNA kompleksleri düzeltmek ve onları immunoprecipitation yolu ile izole etmek için kullanmaktadır. PKR co-immunoprecipitated RNA'ların daha da yüksek üretilen iş sıralama kitaplığı oluşturmak için işlenebilir. Bir büyük PKR etkileşim hücresel dsRNAs (mtRNAs), hangi cins dsRNAs ağır iplikçik ve ışık iplikçikli RNA'ların arasında tamamlayıcı etkileşimi aracılığıyla olarak bulunabilir mitokondrial RNA'lar sınıfıdır. Bu çift yönlü mtRNAs strandedness çalışmaya da strand özgü qRT-PCR için bir iletişim kuralı mevcut. Bizim iletişim kuralı PKR bağımlı RNA'ların analizi için optimize edilmiştir, ama hücresel dsRNAs veya RNA-interactors diğer dsRNA bağlayıcı proteinlerin eğitimi için kolayca değiştirilebilir.

Giriş

Protein kinaz (PKR) RNA-harekete geçirmek, olarak da bilinen ökaryotik başlama faktör 2-Alfa kinaz 2 (EIF2AK2), RNA'ların tarafından sağlanan bilgi ileten bir iyi karakterize protein kinaz var. Ökaryotik çeviri başlatma 2 alt birim alfa (eIF2α) ait kinaz aile ve serin 51 yanıt olarak küresel çeviri1bastırmak için enfeksiyon, eIF2α phosphorylates. Bu bağlamda, PKR PKR dimerization ve autophosphorylation2için bir platform sağlamak viral çift iplikçikli RNA (dsRNAs), tarafından etkinleştirilir. EIF2α ek olarak, PKR da p53, insülin reseptör substrat 1, inhibitörü κB ve c-Jun N-terminal kinaz (JNK) çok sayıda sinyal iletim yollarının3,4,5, etkinliği düzenleyen fazdan 6.

PKR aslında poliovirus'dsRNAs7,8tanıyarak poliovirus enfeksiyon sırasında eIF2α fosforile kinaz olarak tespit edilmiştir. PKR giderek bağışıklık yanıtı ötesinde çok yönlü rolleri oynamak için bulunur ve onun anormal harekete geçirmek ya da arıza çok sayıda insan hastalıklarda ima etti. Aktif/Phosphorylated PKR (pPKR) apoptosis sırasında sık sık gözlenen ve dejeneratif hastalıklar, özellikle gibi Huntington nörodejeneratif hastalıklar, Parkinson'ın ve Alzheimer hastalığı9 hastalarda genel özelliği olduğunu ,10,11,12,13. Buna ek olarak, PKR metabolik stres ve ısı şok14,15,16,17gibi çeşitli stres koşullarında etkinleştirilir. Öte yandan, PKR inhibisyonu artan hücre çoğalması ve hatta Malign transformasyon18,19ile sonuçlanır. PKR işlevi de normal beyin işlevinde önemli ve pPKR düzeyi olarak hücre döngüsü sırasında sırasında M faz20,21,22yükseltilmiş. Bu bağlamda pPKR küresel çeviri bastırır ve uygun hücre bölünmesi20için gerekli olan anahtar Mitotik sinyal sistemleri için ipuçları sağlar. Ayrıca, uzun süreli PKR aktivasyonu hücre döngüsü tutuklama Çin hamster yumurtalık içinde23hücreleri G2/M aşamasında sonuçlandı. Sonuç olarak, PKR fosforilasyon sırasında M/G1 geçiş21hızlı devre dışı bırakma sağlamak için negatif geribesleme tarafından düzenlenmiştir.

PKR geniş aralığı işlevi rağmen PKR harekete geçirmek anlayışımızı yakalamak ve PKR etkinleştirebilirsiniz dsRNAs tanımlamak için standart yüksek üretilen iş deneysel yaklaşım eksikliği nedeniyle sınırlıdır. PKR iki ters Alu yineler (IRAlus)20,24, ama PKR hücre döngüsü sırasında veya altında etkinleştirebilirsiniz ek hücresel dsRNAs varlığı olasılığını tarafından kurulan dsRNAs ile etkileşim kurabilir önceki çalışmalar göstermiştir insan hücreleri stres koşullarında keşfedilmemiş. RNA-interactors bir RNA bağlayıcı protein (RBP) belirlenmesinde geleneksel yaklaşım UV ışık crosslink RNA-RBP kompleksleri25,26,27için kullanılır. Yeni yapılan bir çalışmada bu UV crosslinking yaklaşım bir fare sisteminde uygulanan ve küçük genelde RNA'ların PKR etkinleştirme sırasında metabolik stres16düzenleyen teşhis etti. Formaldehit verimliliğini yüksek crosslinking kullanarak, biz PKR etkileşim RNA'ların HeLa hücreleri28Hücre döngüsünde sırasında tanımlamak için alternatif bir yöntem sundu. Benzer bir yaklaşım Staufen ve Drosha29,30,31gibi diğer dsRBPs çalışma uygulandı. Bulduğumuz gibi kısa serpiştirilmiş nükleer öğesi (sinüs), uzun Nükleer öğesi (satır), endojen retrovirüsü öğesi (modül) ve hatta Alfa-uydu RNA'ların serpiştirilmiş PKR kodlamayan RNA'ların türleri ile etkileşim kurabilir. Buna ek olarak, biz PKR ağır iplikçik ve ışık arasında tamamlayıcı etkileşimi aracılığıyla hangi formu cins dsRNAs RNA'ların28strand mitokondrial RNA'lar ile (mtRNAs), etkileşim içinde olduğunu gösterdi. Son yayın daha fazla desteklenen bizim veri bazı mtRNAs bir çift yönlü formunda yer alan ve dsRNA sensörleri interferonlar32ikna etmek için Melanom farklılaşma ilişkili protein 5 gibi etkinleştirebilirsiniz. Daha da önemlisi, ifade ve mtRNAs hücre altı yerelleştirme hücre döngüsü sırasında ve tarafından çeşitli stresler, PKR harekete geçirmek28düzenleyen yeteneğini önemli olabilecek modülasyonlu.

Bu makalede, biz son zamanlarda geliştirilen formaldehit crosslinking ve immunoprecipitation (fCLIP) için detaylı bir protokolü mevcut yakalamak ve RNA'ların PKR etkileşim hücre döngüsü sırasında analiz yöntemi. Hücre döngüsü tutuklama örnekleri timidin ve nocodazole kullanarak hazırlamak için yöntemi göstermektedir. Biz o zaman fCLIP işleminin PKR bağımlı RNA'ların ve bu RNA'ları tanımlamak için bir yöntem yüksek üretilen iş sıralama kitaplığı hazırlamak için izole etmek için mevcut. Ayrıca, biz PKR bağımlı RNA'ların qRT-PCR kullanarak analiz ile ilgili ayrıntılı yordamlar betimlemek. Özellikle, biz mtRNAs strandedness analiz etmek için bir iplikçik özgü ters transkripsiyon yordam mevcut. Açıklanan protokol HeLa hücreleri ve PKR için optimize edilmiştir, ancak hücre döngüsü örnek, fCLIP ve strand özgü qRT-PCR analizleri hazırlanması gibi önemli adımlar kolayca hücresel dsRNAs çalışmaya ya da diğer dsRBPs, RNA interactors belirlemek için değiştirilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. çözüm ve hücre hazırlık

  1. Çözüm hazırlık
    1. Hücre kültür ortamı için orta HeLa hücre kültürü için 50 mL fetal sığır serum (FBS) ekleyerek 500 mL Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) için hazır olun.
      Not: Antibiyotik hücre kültür ortamına eklenebilir, ancak biz antibiyotik kullanmayın.
    2. %0,1 paraformaldehyde için 1 %4 (w/v) paraformaldehyde erimesi x Phosphate-Buffered serum fizyolojik (%0,1 (v/v) paraformaldehyde 30 mL 1 x PBS ekleyerek yapmak için PBS) Isıtma sıcak tabakta ve seyreltik ile.
      Dikkat: bir duman mahallede tüm adımlarını gerçekleştirin ve paraformaldehyde çözüm kaynatın değil dikkatli olun. % 0,1 çözüm ışıktan korumak ve 4 ° C'de depolayın Bir ay içinde çözüm kullanın.
      Not: Son %0,1 (v/v) paraformaldehyde çözüm pH 7 civarında olmalıdır.
    3. FCLIP lizis arabellek hazırlamak: 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 15 mM NaCl, 10 mM EDTA, %0,5 (v/v) nonidet-p40 (NP-40), (v/v) Triton X-100, % 0,1 %0,1 (v/v) Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) ve % 0.1 (w/v) sodyum deoxycholate. Üçlü distile su (TDW) için 40 mL ekleyin. 4 ° C'de mağaza
    4. FCLIP yıkama arabellek hazırlamak: 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, %0,1 (v/v) NP-40, %0,1 (v/v) Triton X-100, (v/v) SDS % 0,1 ve %0,1 (w/v) sodyum deoxycholate. TDW 40 mL ekleyin. 4 ° C'de mağaza
    5. 4 PK arabellek x hazırlamak: 400 mM Tris-HCl (pH 7.5), 200 mM NaCl, 40 mM EDTA ve % 4 (v/v) SDS. TDW 40 mL ekleyin. Oda sıcaklığında saklayın.
    6. FCLIP elüsyon arabellek hazırlamak: 4 PK arabellek, üre 21 g ve TDW 8,5 mL x 20 mL. Taze hazırlayın.
    7. RNA elüsyon arabellek hazırlamak: 0.3 M NaOAc ve %2 (w/v) SDS. Oda sıcaklığında saklayın.
    8. 2 x RNA yükleme boya hazırlamak: % 0,025 (w/v) bromophenol mavi, (w/v) % 0,025 Ksilen cyanol, 5 mM EDTA, %0.05 (w/v) SDS ve %95 (v/v) formamide. -20 ° C'de mağaza
    9. 1 x TBE arabellek hazırlamak: 0.089 M Tris-Bor ve 0.002 M EDTA. 500 mL TBE tampon hazırlayın.
  2. S veya M faz tutuklandı hücre hazırlanması
    1. HeLa hücreleri S veya M faz tutuklandı örnekleri için sırasıyla tohum ~ 750.000 veya ~ 1.000.000. 37 ° C ve % 5 CO2 24 h için hücrelerin büyümesine.
    2. 2 mM timidin hücrelerle tedavi etmek ve 18 h 37 ° C'de için kuluçkaya
    3. Hücreleri iki kez PBS ile yıkayın. Taze medya ekleyin ve 37 ° C'de 9 h için kuluçkaya
    4. S hücreler için faz tutuklandı, 2 mM timidin hücrelerle tedavi. M hücreler için faz tutuklandı, 100 ng/mL nocodazole hücrelerle tedavi. 15 h 37 ° C ve hasat hücreleri için kuluçkaya.
      Not: Hücre döngüsü örnekleri polimerlerin FACS kullanarak kontrol edilebilir.

2. formaldehit cross-linking ve immunoprecipitation

  1. Hücre hasat
    1. Bir S faz örnek için hücreleri hücre kazıyıcı ve transfer 15 mL konik tüp içine toplamak. M faz örneği için M hücreleri faz tutuklandı ayırmak ve 15 mL konik tüp içine aktarmak için hücre kültür çanak yan dokunun.
      Not: bir hücre kazıyıcı faz tutuklandı M hücreleri polimerlerin artırmak için kullanmayın.
    2. 380 x g 3 dk. Kaldır için oda sıcaklığında, hücreleri süpernatant santrifüj kapasitesi ve 1 mL soğuk PBS ve transfer içine 1.5 mL microcentrifuge tüp ile yeniden askıya alma.
    3. 10.000 x g 4 ° c de hücreler için 30 s. Kaldır süpernatant tamamen santrifüj kapasitesi.
  2. Formaldehit crosslinking
    1. % 0.1 paraformaldehyde 10 dk için 750 μL hücreleri düzeltmek için oda sıcaklığında ekleyin.
    2. 1 M glisin 250 μL ekleyin ve ek bir 10 min tepki gidermek için oda sıcaklığında kuluçkaya. 10.000 x g 4 ° c de hücreler için 30 s. Kaldır süpernatant tamamen santrifüj kapasitesi.
    3. PBS 1 mL ile yeniden askıya alma. 10.000'hücreleri santrifüj kapasitesi 30 s ve Kaldır süpernatant için 4 ° C'de g x.
    4. FCLIP lizis arabelleği %0,2 (v/v) proteaz inhibitörü ve %2 (v/v) RNase inhibitörü ile 400 μL ile yeniden askıya alma. 10 dakika buz üzerinde kuluçkaya ve bir ultrasonicator kullanarak solüsyon içeren temizleyicide.
    5. ~ 150 mm NaCl toplama ayarlamak için 5 M NaCl 11 μL ekleyin. Kısaca girdap ve 21,130 x g 4 ° c de 15 dakika süreyle santrifüj süpernatant önceden soğutulmuş 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın.
      Not: yeni bir santrifüj tüpü süpernatant ile 40 μL giriş örnek olarak korur. Mağaza giriş örneği 4 ° c '
  3. Immunoprecipitation
    1. Protein A boncuk 20 μL 1.5 mL microcentrifuge tüp içine ekleyin.
    2. Boncuk fCLIP lizis arabelleği 400 μL ile yıkayın. 1000 x g 1 dk. Kaldır 4 ° C'de, boncuk süpernatant santrifüj kapasitesi ve fCLIP lizis arabelleği 400 μL dikkatle ekleyin. Yavaşça boncuk 3 ters çevirme tarafından yeniden askıya alma ~ 4 kez.
    3. Yıkama üç kez tekrarlayın. Son yıkama sonra tamamen süpernatant kaldırın.
    4. Boncuk fCLIP lizis arabellek 300 μL içinde yeniden askıya alma. ~ 150 mm NaCl toplama ayarlamak için 5 M NaCl 8.3 μL ekleyin. PKR antikor 10 μL ekleyin ve bir rotator 4 ° C'de 3 h için kuluçkaya
    5. 1000 x g 1 dk. Kaldır 4 ° C'de, boncuk süpernatant santrifüj kapasitesi ve fCLIP yıkama arabelleği 400 μL ekleyin. Yavaşça boncuk 3 ters çevirme tarafından yeniden askıya alma ~ 4 kez.
    6. Yıkama adım iki kere tekrar edin. Son yıkama sonra tamamen süpernatant kaldırın.
      Not: Hiç bir girdap karıştırıcı kullanın. Tüp elinizle yavaşça tersine çevirin.
    7. Lysate, 300 μL ekleyin ve bir rotator üzerinde 4 ° C'de 3 h için kuluçkaya.
      Not: Artan arka plan bağlamada daha uzun kuluçka süresi neden olabilir.
    8. 1000 x g 1 dk. Kaldır 4 ° C'de, boncuk süpernatant santrifüj kapasitesi ve fCLIP yıkama arabelleği 400 μL ekleyin. Yavaşça boncuk 3 ters çevirme tarafından yeniden askıya alma ~ 4 kez.
    9. Yıkama üç kez tekrarlayın. Son yıkama sonra tamamen süpernatant kaldırın.
    10. FCLIP elüsyon arabelleği 300 μL ekleyin. Bir thermomixer 3 h PKR boncuk elute için 25 ° c için kuluçkaya.
      Not: fCLIP elüsyon arabellek taze hazırlayın.
    11. 1000 x g oda sıcaklığında, santrifüj kapasitesi ve süpernatant temiz bir siliconized tüp aktarın.
      Not: Bir microcentrifuge tüp de ok, ama silikonlu tüp de crosslinking adım (Adım 2.3.12) sırasında buharlaşma önlemek için tercih edilir.
    12. 300 μL İndinavir K, (20 mg/mL) eklemek ve bir gecede 65 ° C'de kuluçkaya
      Not: buharlaşma önlemek için ısıtmalı kapaklı bir thermomixer kullanın.
  4. RNA çıkarma
    1. Asit-fenol kloroform ve girdap 580 μL 1 h için 37 ° C'de 30 s. Incubate ekleyin.
    2. Girdap 30 s ve 10 min için 12.000 x g oda sıcaklığında, santrifüj için.
    3. Üst katmanı bir temiz 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. 3 M NaOAc, coprecipitant (örneğin, Glycoblue) 0.5 μL ve isopropanol eşit bir hacmi 1/10 hacmi ekleyin. Gecede-20 ° C'de kuluçkaya
    4. Granül 1 h için 4 ° C'de maksimum hızda centrifuging tarafından çökelti.
      Not: RNA/DNA parçaları gözlendi değil, RNA/DNA parçaları gözlenen kadar coprecipitant ve santrifüj ek 1 h devam Bu adım için bir ek 0,5 μL ekleyin.
    5. Süpernatant kaldırın ve 1 mL % 75 etil alkol ekleyin. 5 dakika süreyle santrifüj, 12.000 x g 4 ° C'de yıkama adım bir kez daha yineleyin. Süpernatant tamamen kaldırmak ve oda sıcaklığında Pelet Makinası.
    6. 1s için 37 ° C'de TDW, ben tampon Dnaz 5 μL, 1 μL RNase inhibitörü ve 2 μL Dnaz ı. kuluçkaya, 42 μL ekleyin.
    7. TDW 150 μL ve asit-fenol kloroform 200 μL ekleyin. 10 dk için 12.000 x g oda sıcaklığında, 30 s. santrifüj için girdap.
    8. Üst katmanı bir temiz 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. 3 M NaOAc, coprecipitant, 0.5 μL ve % 100 etil alkol 1 mL 20 μL ekleyin. Gecede-80 ° C'de kuluçkaya
    9. Granül çökelti ve 2.4.4-2.4.5 adımlarda açıklandığı gibi % 75 etil alkol ile yıkayın.
    10. TDW uygun miktarda yeniden askıya alma.

3. Sıralama kitaplığı hazırlık

  1. rRNA kaldırma
    1. TDW 28 μL adımla 2.4.10 RNA çökeltilerini yeniden askıya alma.
      Not: Toplam RNA en fazla 5'ten μg olmalıdır.
    2. RRNA kaldırmak için rRNA kaldırma Kit'in başvuru kılavuzu tarafından sağlanan yordamları izleyin.
    3. Temiz rRNA kadar manyetik boncuklar 160 μL ekleyerek RNA'ların tükendi.
      1. ~ 15 kez pipetting tarafından mix ve 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
      2. Manyetik çubuk Tüp takmak ve süpernatant kaldırın.
      3. Boncuk hala manyetik çubuğunda eklenir ve 30 için kuluçkaya % 80 etil alkol 300 μL eklemek s.
      4. Etil alkol yerine koymak ile taze bir 300 μL eriyik. Hava Kuru oda sıcaklığında 12 dk için manyetik çubuğu üstündeki.
      5. Boncuk TDW ve mix 12 μL 15 kez pipetting tarafından yeniden askıya alma.
      6. Manyetik çubuğunun üstündeki eklemek ve süpernatant temiz bir PCR tüp taşımak.
    4. Parçalanmış ribozomal RNA (rRNA'lar) tükenmesi Kit rRNA tarafından sağlanan yordamı tüketmek.
    5. RNA'ların kadar manyetik boncuklar ve yinelenen adımlar 3.1.3.1 3.1.3.6 110 μL ekleyerek temiz.
  2. RNA etiketleme ve adaptör ligasyonu
    1. RRNA tükenmiş RNA'ların üzerinde 10 x CIAP arabelleğinin 2 μL, 1 μL RNase inhibitörü ve Antarktika alkalen fosfataz 2 μL ekleyin. 37 ° C için 1 h ve daha sonra 65 ° C fosfataz devre dışı bırakabilirsiniz 5 min için kuluçkaya.
    2. 10 x PNK arabelleği 3 μL, 1,5 μL RNase inhibitörü, T4 PNK enzim, r-ATP 0.8 μL ve TDW 1.7 μL 1,5 μL ekleyin. 50 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
    3. 10 mm ATP 1,5 μL ekleyin ve ek 40 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
    4. Reaksiyon 170 μL RNA elüsyon arabelleği ekleyerek durdurmak.
    5. Asit-fenol kloroform ve girdap 200 μL 12.000 x g oda sıcaklığında, 30 s. santrifüj 10 dakika için ekleyin.
    6. Üst katmanı bir temiz 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. 3 M NaOAc, coprecipitant, 0.5 μL ve % 100 etil alkol 1 mL 20 μL ekleyin. Gecede-80 ° C'de kuluçkaya
    7. RNA granül çökelti ve 2.4.4-2.4.5 adımlarda açıklandığı gibi % 75 etil alkol ile yıkayın. TDW 4,5 μL içinde yeniden askıya alma ve 2 x RNA yükleme boya 9 μL ekleyin.
    8. Örnek 5 min ve % 10 üre-sayfa jel üzerindeki yükü için 95 ° c ısı.
    9. Jel 370 V 40 min için çalıştırın.
      Not: jel 370 V 90 dk için örnek yüklemeden önce önceden çalıştırın.
    10. Jel ~ 100-500 nükleotit bölge kesmek ve jel kesin.
    11. 0.3 M NaCl 700 μL ekleyin ve bir gecede bir rotator üzerinde 4 ° C'de kuluçkaya.
    12. Çözüm bir sütun ve 5 min için oda sıcaklığında maksimum hızda santrifüj aktarın.
    13. Eluate temiz 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. 3 M NaOAc, coprecipitant, 0.5 μL ve isopropanol eşit bir hacmi 1/10 hacmi ekleyin. Gecede-20 ° C'de kuluçkaya
  3. 3' adaptör ligasyonu
    1. RNA granül çökelti ve 2.4.4-2.4.5 adımlarda açıklandığı gibi % 75 etil alkol ile yıkayın.
    2. RNA granül TDW 6.5 μL içinde yeniden askıya alma ve 10 mikron 3' adaptör 1 μL ekleyin.
    3. Çözüm bir PCR tüp aktarmak ve 70 ° c 2 min için kuluçkaya.
    4. 10 x ligasyonu arabelleği 1 μL, 0.5 μL RNase inhibitörü ve T4 RNA ligaz 2 in 1 μL ekleyin. 28 ° c için 1 h, 25 ° C 6 h ve 22 ° C 6 h için kuluçkaya.
    5. 2 x RNA yükleme boya ve ısı 12 μL 95 ° c 5 min için ekleyin.
    6. Jel arındırmak 3' adaptör bakmaksızın RNA'ların 3.2.9-3.2.13 içinde açıklandığı gibi.
  4. 5' adaptör ligasyonu
    1. RNA granül çökelti ve 2.4.4-2.4.5 adımlarda açıklandığı gibi % 75 etil alkol ile yıkayın.
    2. RNA granül TDW 4.2 μL içinde yeniden askıya alma ve 5 mikron 5' adaptör 1 μL ekleyin.
    3. Çözüm bir PCR tüp aktarmak ve 70 ° c 2 min için kuluçkaya.
    4. 10 x ligaz arabelleği, RNase inhibitörü, 10 mm ATP, T4 RNA ligaz 1 0,8 μL 0.8 μL 0.4 μL 0.8 μL ekleyin. 28 ° c için 1 h, 25 ° C 6 h ve 22 ° C 6 h için kuluçkaya.
  5. Ters transkripsiyon ve PCR güçlendirme
    1. 5' bağdaştırıcısında ve birleştirilmiş RNA'ların, 4 mikron ters transkripsiyon astar 1 μL ekleyin. 70 ° c 2 min için kuluçkaya ve hemen 4 ° C'ye serin
    2. 5 x FS arabelleği 4 μL, 2.5 mM dNTP 4 μL, 0.1 M DTT, 1 μL RNase inhibitörü ve transkriptaz 1 μL 1 μL ekleyin. 50 ° c için 1 h ve 70 ° C 15dk için kuluçkaya.
    3. PCR güçlendirme hazırlamak
      1. Mix 1 μL RT ürün, 1 μL 25 mikron RPI astar, 1 μL 25 mikron RP1 astar, 5 x HF arabellek, 2.5 mM dNTP 4 μL, TDW 32,5 μL 10 μL ve yüksek sadakat polimeraz 0.5 μL.
      2. PCR programı 11 ~ 13 döngüleri.
        Not: PCR programdır: 30 98 ° C s, 98 ° C 10 için sıcak bir başlangıç için s, 60 ° C 30 45 72 ° C ve s s amplifikasyon ve 5 min için 72 ° C için. Amplifikasyon adım 11-13 döngüleri için yinelenir.
    4. Manyetik boncuklar ve aşağıdaki adımları 3.1.3.1 3.1.3.6 40 μL kullanarak ama TDW 10 μL DNA elute kullanarak PCR ürünleri kadar temiz.
    5. 10 x DNA yükleme boya 2 μL ekleyin. Örnek % 6 Akrilamid jel üzerinde yük ve 200 V 30 dk için çalıştırın.
    6. Sybr altın (%0.01 (v/v) 1 x TBE arabelleği) oda sıcaklığında 5 min için leke.
    7. 1 x TBE tampon oda sıcaklığında 5 min için de-leke.
    8. Jel ~ 200-700 nükleotit bölge kesmek ve jel kesin.
    9. 0.3 M NaCl 700 μL ekleyin ve gecede DNA elute için oda sıcaklığında kuluçkaya.
    10. Her şey bir sütun ve 5 min için oda sıcaklığında maksimum hızda santrifüj üzerine yükleyin.
    11. Eluate temiz 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. 3 M NaOAc, coprecipitant, 0.5 μL ve isopropanol eşit bir hacmi 1/10 hacmi ekleyin. Gecede-20 ° C'de kuluçkaya
    12. DNA granül çökelti ve 2.4.4-2.4.5 adımlarda açıklandığı gibi % 75 etil alkol ile yıkayın. TDW 20 μL içinde yeniden askıya alma.
    13. Bir sequencer kullanarak örneğini analiz.

4. analiz RNA'ların PKR etkileşim qRT-PCR kullanarak

  1. Yöntem 1: Rasgele hexamer ters transkripsiyon
    1. TDW 8,5 μL adımla 2.4.10 RNA çökeltilerini yeniden askıya alma ve çözüm için PCR tüp aktarın.
    2. 100 μm kalınlığında rasgele hexamers 0.5 μL ve 4 μL 2.5 mM dNTP karışımı ekleyin.
    3. Isı 65 ° c 5 min için ve hemen çözüm kuluçkaya en az 1 dakika buzda.
    4. Mix tepki olun: 5 x SSIV arabellek 4 μL, 100 mm DTT, 1 μL RNase inhibitörü ve ters transkriptaz (200 U/μL) 1 μL 1 μL. RNA tepki karışımı ekleyin.
    5. Karışımı 10 dakika, 10 min 50 ° C 23 ° C'de kuluçkaya ve 10 dk 80 ° C.
    6. Bir gerçek zamanlı PCR sistemi kullanarak cDNA analiz.
      Not: Gerçek zamanlı PCR programdır: 95 ° C sıcak başlangıç, 95 ° C 5 için 3 min için s ve 60 ° C 10 s amplifikasyon ve 95 ° C 30 s, 65 ° C 30 s ve 95 ° C 30 s eritmek için. Amplifikasyon adım 40 döngüleri için yinelenir.
  2. Yöntem 2: Strand özgü ters transkripsiyon
    1. Ters astar ana karışımı hazırlar: CMV organizatörü sıra içeren gen belirli ters transkripsiyon astar eşit miktarda gen belirli dizileri ~ 20 nükleotit tarafından takip Mix.
      Not: Kombine tüm gen belirli RT astar 4 mikron bölgedir.
    2. TDW 8,5 μL adımla 2.4.10 RNA çökeltilerini yeniden askıya alma ve çözüm için PCR tüp aktarın.
    3. 4 mikron ana karışımı ters transkripsiyon astar ve 2.5 mM dNTP Mix 4 μL 0.5 μL ekleyin.
    4. Isı 65 ° c 5 min için ve hemen çözüm kuluçkaya en az 1 dakika buzda.
    5. Reaksiyon çözüm 4 μL 5 x SSIV arabelleği, 100 mm DTT, 1 μL RNase inhibitörü ve ters transkriptaz (200 U/μL) 1 μL 1 μL karıştırarak hazırlayın. Reaksiyon çözüm RNA-astar karışıma ekleyin.
    6. Çözüm 50 ° C'de 10 dakika ve 10 dk 80 ° C kuluçkaya.
    7. Gerçek zamanlı PCR sistemi kullanılarak cDNA analiz.
      Not: Program gerçek zamanlı PCR için yöntem 1'da açıklanan gibi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Hücre döngüsü S veya M aşamasında HeLa hücreleri tutuklamaya işleminin şematik Resim 1' de gösterilen. M faz tutuklandı bir örnek, açıkça (şekil 2A) mikroskop altında yuvarlak şekilli hücreler görselleştirebilirsiniz. Hücre döngüsü tutuklama verimliliğini incelemeye, nükleer hücre içeriğini FACS (şekil 2B) kullanılarak analiz edilebilir. Şekil 3 D7F7 antikor immunoprecipitate PKR üstün yeteneği gösterir nerede immunopreci...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

S veya M faz tutuklandı örnekleri hazırlamak için işlem şekil 1' de gösterilmiştir. S aşamada hücreleri tutuklamaya biz nereye biz timidin sürümüyle arasında yüksek tutuklama verimliliği (şekil 1A) sağlamak için iki kez bir 9 h hücrelerle tedavi timidin çift blok yöntemi kullanılır. M faz durması için biz timidin bir kez hücrelerle tedavi 9 h yayın tarafından takip ve nocodazole prometafaz (şekil 1B) blok hücreleri uygulanır. Hücre ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser temel bilim araştırma programı aracılığıyla Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (Kore hükümeti Bilim Bakanlığı ve ICT (NMK-2016R1C1B2009886) tarafından desteklenen NMK) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0,5 M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher ScientificAM9260G
1 M Tris, pH 7,0Thermo Fisher ScientificAM9855G
1 M Tris, pH 8,0Thermo Fisher ScientificAM9855G
1,7 mL mikrosantrifüj tüpüAxygenMCT-175-C
%10 Nonidet-p40 (NP-40)BiyoçözeltiBN015
10X DNA yükleme tamponuTaKaRa9157
15 mL konik tüpSPL50015
3' adaptör5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3'3
M Sodyum Asetat pH 5.5Thermo Fisher ScientificAM9740
55'-GUU ÇAĞ AGU UCU ACA GÜÇ CGA CGA UCN NNN-3'
5 M NaClThermo Fisher ScientificAM9760G
50 mL konik tüpSPL50050
Asit-fenol kloroform, pH 4.5Thermo Fisher ScientificAM9722
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881Manyetik boncuklar DNA / RNA temizleme
Antarktika alkalin fosfatazNew England BiolabsM0289S
Anti-DGCR8Evde üretilmiştir
Anti-PKR (D7F7)Hücre sinyalizasyon teknolojisi12297S
Anti-PKR (Milli)Millipore EMD07-151
ATP (100 mM)GE HealthcareGE27-2056-01
Bromofenol mavi sodyum tuzuSigma-aldrichB5525
Buzağı bağırsak alkalin fosfatazTaKaRa2250A
Hücre sıyırıcı 25 cm 2 konumluSarstedt83.183
CMV promotör dizisi5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'Dulbecco'nun
modifiye kartal ortamıWelgeneLM001-05
dNTP karışımı (2,5 mM)TaKaRa4030
Etanol, Mutlak, ACS SınıfıAlfa-AesarA9951
Fetal sığır serumuMerckM-TMS-013-BKR
FormamidMerck104008
GlisinBiyo-bazikGB0235
GlycoBlue kopreçökitan (15 mg / mL)Thermo Fisher ScientificAM9516
İzopropanolMerck8.18766.1000
NEBNext rRNA Tükenme KitiNew England BiolabsE6318rRNA Tükenme Kiti
NokodazolSigma-AldrichM1404
Normal tavşan IgGHücre sinyal teknolojisi2729S
ParaformaldehitSigma-Aldrich6148
PCR ileri astar (RP1)5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CG TCC GA-3'
PCR indeksi ters primer (RPI)5'-CAA, GCA, GAA, GAA, GGC, GGC, ATA CGA, GAT NNN, NNN, GTG, ACT, GGA, GTT, TGG, CAC, CCG, AGA, ATT, CCA-3'
düz kapaklı PCR tüpleri, 0.2 mLAxygenPCR-02-C
Fosfat bufered salin (PBS) TabletTaKaRaT9181
Phusion yüksek kaliteli DNA polimerazNew England BiolabsM0530Yüksek kaliteli polimeraz
Açılır rotorlu PlateFuge mikrosantrifüjBenchmarkc2000
Polinükleotid kinaz (PNK)TaKaRa2021A
Proteinaz K, rekombinant, PCR SınıfıSigma-Aldrich3115879001
qPCR primer dizisi: CO1 Ağırİleri/Geri: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sırası: CO1 Işığıİleri/Geri: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR astar sırası: CO2 Ağırİleri/Geri: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer dizisi: CO2 Işığıİleri/Geri: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer dizisi: CO3 Ağırİleri/Geri: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer dizisi: CO3 Işığıİleri/Geri: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer dizisi: CYTB Ağırİleri/Geri: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer dizisi: CYTB Işıkİleri/Geri: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer dizisi: GAPDHİleri/Geri: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer dizisi: ND1 Ağırİleri/Geri: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer dizisi: ND1 Işıkİleri/Geri: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer dizisi: ND4 Ağırİleri/Geri: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR astar dizisi: ND4 Işıkİleri/Geri: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer dizisi: ND5 Ağırİleri/Geri: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer dizisi: ND5 Işıkİleri/Geri: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer dizisi: ND6 Ağırİleri/Geri: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer dizisi: ND6 Işıkİleri/Geri: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
Rastgele heksamerThermo Fisher ScientificSO142
Rekombinant Dnase I (Rnaz içermez) (5 U/μ L)TaKaRa2270A
Rekombinant Rnaz inhibitörü (40 U/μ L)TaKaRa2313A
Ribo-Zero rRNA Çıkarma KitiIlluminaMRZH116rRNA Çıkarma Kiti
RotatorFINEPCR, ROTATOR AGD1.5-32
RT primer dizisi: CO1 Ağır5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′
RT astar dizisi: CO1 Işık5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′
RT astar sırası: CO2 Ağır5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′
RT astar dizisi: CO2 Işık5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′
RT astar sırası: CO3 Ağır5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′
RT astar dizisi: CO3 Işık5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′
RT astar dizisi: CYTB Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′
RT astar dizisi: CYTB Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′
RT primer dizisi: GAPDH5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′
RT astar sırası: ND1 Ağır5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′
RT astar dizisi: ND1 Işık5 & prime; -CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3 & prime;
RT astar dizisi: ND4 Ağır5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′
RT astar dizisi: ND4 Işık5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACCATTCTCAACCC-3′
RT astar sırası: ND5 Ağır5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTTTGTTGAGGTGATG-3′
RT astar dizisi: ND5 Işık5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′
RT astar dizisi: ND6 Ağır5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′
RT astar dizisi: ND6 Işık5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′
Silikonize polipropilen 1.5 mL G-tüpBio Plas4167SLS50
Sodyum dedesil sülfatBiosesangS1010
Sodyum deoksikolatSigma-AldrichD6750
SUPERase In Rnaze inhibitörüThermo Fisher ScientificAM2694
SuperScript III ters transkriptazThermo Fisher Scientific18080093Kütüphane hazırlığı için ters transkriptaz
SuperScript IV ters transkriptazThermo Fisher Scientific18090010qRT-PCR
SYBR altın nükleik asit gl boyasıThermo Fisher ScientificS11494
T4 polinükleotid kinazNew England BiolabsM0201S
T4 RNA ligaz 1 (ssRNA Ligaz)New England BiolabsM0204
T4 RNA ligaz 2, kesilmiş KQNew England BiolabsM0373
ThermomixerEppendorf ThermoMixer C, ThermoTop
TimidinSigma-AldrichT9250
Tris-borat-EDTA tamponu (TBE)TaKaraT9122
Triton X-100PromegaH5142
Ultralink Protein A sefaroz boncukThermo Fisher Scientific22810Protein A boncuk
UltrasonicatorBioruptor
ÜreBiyo-bazikUB0148
Vorteks karıştırıcıDAIHAN ScientificVM-10
Ksilen siyanolSigma-AldrichX4126
&gama;-32P-ATP (10 μ Ci/μ L, 3.3 & mu; M)PerkinElmerBLU502A100UC
' adaptör , için ters transkriptaz

Kaynaklar

  1. Meurs, E. F., et al. Constitutive expression of human double-stranded RNA-activated p68 kinase in murine cells mediates phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 and partial resistance to encephalomyocarditis virus growth. Journal of Virology. 66 (10), 5805-5814 (1992).
  2. Patel, R. C., Stanton, P., McMillan, N. M., Williams, B. R., Sen, G. C. The interferon-inducible double-stranded RNA-activated protein kinase self-associates in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (18), 8283-8287 (1995).
  3. Bennett, R. L., Pan, Y., Christian, J., Hui, T., May, W. S. The RAX/PACT-PKR stress response pathway promotes p53 sumoylation and activation, leading to G(1) arrest. Cell Cycle. 11 (1), 407-417 (2012).
  4. Yang, X., Nath, A., Opperman, M. J., Chan, C. The double-stranded RNA-dependent protein kinase differentially regulates insulin receptor substrates 1 and 2 in HepG2 cells. Molecular and Cellular Biology. 21 (19), 3449-3458 (2010).
  5. Zamanian-Daryoush, M., Mogensen, T. H., DiDonato, J. A., Williams, B. R. G. NF-kappa B Activation by Double-Stranded-RNA-Activated Protein Kinase (PKR) Is Mediated through NF-kappa B-Inducing Kinase and Ikappa B Kinase. Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1278-1290 (2000).
  6. Takada, Y., Ichikawa, H., Pataer, A., Swisher, S., Aggarwal, B. B. Genetic deletion of PKR abrogates TNF-induced activation of IkappaBalpha kinase. JNK, Akt and cell proliferation but potentiates p44/p42 MAPK and p38 MAPK activation. Oncogene. 26 (8), 1201-1212 (2007).
  7. Dabo, S., Meurs, E. F. dsRNA-dependent protein kinase PKR and its role in stress, signaling and HCV infection. Viruses. 4 (11), 2598-2635 (2012).
  8. Black, T. L., Safer, B., Hovanessian, A., Katze, M. G. The Cellular 68,000-Mr Protein-Kinase Is Highly Autophosphorylated and Activated yet Significantly Degraded during Poliovirus Infection - Implications for Translational Regulation. Journal of Virology. 63 (5), 2244-2251 (1989).
  9. Bando, Y., et al. Double-strand RNA dependent protein kinase (PKR) is involved in the extrastriatal degeneration in Parkinson's disease and Huntington's disease. Neurochemistry International. 46 (1), 11-18 (2005).
  10. Onuki, R., et al. An RNA-dependent protein kinase is involved in tunicamycin-induced apoptosis and Alzheimer's disease. The EMBO Journal. 23 (4), 959-968 (2004).
  11. Peel, A. Activation of the cell stress kinase PKR in Alzheimer's disease and human amyloid precursor protein transgenic mice. Neurobiology of Disease. 14 (1), 52-62 (2003).
  12. Peel, A. L. Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, binds preferentially to Huntington's disease (HD) transcripts and is activated in HD tissue. Human Molecular Genetics. 10 (15), 1531-1538 (2001).
  13. Suen, K. C., Yu, M. S., So, K. F., Chang, R. C., Hugon, J. Upstream signaling pathways leading to the activation of double-stranded RNA-dependent serine/threonine protein kinase in beta-amyloid peptide neurotoxicity. Journal of biological chemistry. 278 (50), 49819-49827 (2003).
  14. Nakamura, T., et al. A critical role for PKR complexes with TRBP in Immunometabolic regulation and eIF2alpha phosphorylation in obesity. Cell Reports. 11 (2), 295-307 (2015).
  15. Saito, S. Enhancement of the interferon-induced double-stranded RNA-dependent protein kinase activity by Sindbis virus infection and heat-shock stress. Microbiology and Immunology. 34 (10), 859-870 (1990).
  16. Youssef, O. A., et al. Potential role for snoRNAs in PKR activation during metabolic stress. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (16), 5023-5028 (2015).
  17. Murtha-Riel, P., Davies, M. V., Choi, S. Y., Hershey, J. W., Kaufman, R. J. Expression of a Phosphorylation-resistant Eukaryotic Initiation Factor 2 a-Subunit Mitigates Heat Shock Inhibition of Protein Synthesis. The Journal of Biological Chemistry. 268, 12946-12951 (1993).
  18. Benkirane, M., et al. Oncogenic potential of TAR RNA binding protein TRBP and its regulatory interaction with RNA-dependent protein kinase PKR. The EMBO Journal. 16 (3), 611-624 (1997).
  19. Koromilas, A., Roy, S., Barber, G., Katze, M., Sonenberg, N. Malignant transformation by a mutant of the IFN-inducible dsRNA-dependent protein kinase. Science. 257 (5077), 1685-1689 (1992).
  20. Kim, Y., et al. PKR is activated by cellular dsRNAs during mitosis and acts as a mitotic regulator. Genes & Development. 28 (12), 1310-1322 (2014).
  21. Kim, Y., et al. Deletion of human tarbp2 reveals cellular microRNA targets and cell-cycle function of TRBP. Cell Reports. 9 (3), 1061-1074 (2014).
  22. Zhu, P. J., et al. Suppression of PKR promotes network excitability and enhanced cognition by interferon-gamma-mediated disinhibition. Cell. 147 (6), 1384-1396 (2011).
  23. Dagon, Y., et al. Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, down-regulates CDC2/cyclin B1 and induces apoptosis in non-transformed but not in v-mos transformed cells. Oncogene. 20 (56), 8045-8056 (2001).
  24. Elbarbary, R. A., Li, W., Tian, B., Maquat, L. E. STAU1 binding 3' UTR IRAlus complements nuclear retention to protect cells from PKR-mediated translational shutdown. Genes & Development. 27 (13), 1495-1510 (2013).
  25. Cho, J., et al. LIN28A is a suppressor of ER-associated translation in embryonic stem cells. Cell. 151 (4), 765-777 (2012).
  26. Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
  27. Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
  28. Kim, Y., et al. PKR Senses Nuclear and Mitochondrial Signals by Interacting with Endogenous Double-Stranded RNAs. Molecular Cell. 71 (6), 1051-1063 (2018).
  29. Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
  30. Ricci, E. P., et al. Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).
  31. Kim, B., Kim, V. N. fCLIP-seq for transcriptomic footprinting of dsRNA-binding proteins: Lessons from DROSHA. Methods. , (2018).
  32. Dhir, A., et al. Mitochondrial double-stranded RNA triggers antiviral signalling in humans. Nature. 560 (7717), 238-242 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Formaldehit apraz Ba lamamm nopresipitasyonHeLa H creleriH cre D ng s DurmasMitokondriyal RNA larZincire zg qRT PCRY ksek Verimli SekanslamaRNA Ba layan Proteinler
RNA Interactors Protein kinaz memeli hücre döngüsü sırasında RNA-harekete geçirmek, eğitim
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.