Memeli hücre HeLa hücreleri kullanarak döngüsü sırasında eğitim RNA-interactors için çift iplikçikli RNA bağlayıcı protein kinaz (PKR) RNA-harekete geçirmek ve deneysel yaklaşımlar mevcut. Formaldehit crosslink RNA-PKR kompleksleri ve immunoprecipitation PKR bağımlı RNA'ların zenginleştirmek için bu yöntemi kullanır. Bu RNA'ların daha da yüksek üretilen iş sıralama veya qRT-PCR ile çözümlenebilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
RNA Interactors Protein kinaz memeli hücre döngüsü sırasında RNA-harekete geçirmek, eğitim
Bu makalede
Özet
Özet
Protein kinaz (PKR) RNA-harekete geçirmek doğuştan gelen bağışıklık yanıtı proteinler üyesidir ve viral RNA'ların çift iplikçikli ikincil yapısını tanır. Viral çift iplikçikli RNA (dsRNAs) bağlandığında, PKR dimerization ve sonraki autophosphorylation uğrar. Fosforile PKR (pPKR) aktif hale gelir ve fosforilasyon bir alfa alt birimi ökaryotik başlama Factor global çeviri bastırmak için 2 (eIF2α) neden olmaktadır. Kanıt artan PKR hücre döngüsü sırasında gibi fizyolojik koşullar altında veya enfeksiyonu olmadan çeşitli stres koşullarında etkinleştirilebilir öneriyor. Ancak, PKR RNA aktivatörler anlayışımızı yakalamak ve PKR etkileşim dsRNAs analiz için standart bir deneysel yöntem eksikliği nedeniyle sınırlıdır. Burada, bir deneysel mevcut özellikle zenginleştirmek ve PKR çözümlemek için iletişim kuralı bağlı RNA'ların HeLa hücreleri kullanarak hücre döngüsü sırasında. Biz verimli crosslinking etkinlik formaldehit PKR-RNA kompleksleri düzeltmek ve onları immunoprecipitation yolu ile izole etmek için kullanmaktadır. PKR co-immunoprecipitated RNA'ların daha da yüksek üretilen iş sıralama kitaplığı oluşturmak için işlenebilir. Bir büyük PKR etkileşim hücresel dsRNAs (mtRNAs), hangi cins dsRNAs ağır iplikçik ve ışık iplikçikli RNA'ların arasında tamamlayıcı etkileşimi aracılığıyla olarak bulunabilir mitokondrial RNA'lar sınıfıdır. Bu çift yönlü mtRNAs strandedness çalışmaya da strand özgü qRT-PCR için bir iletişim kuralı mevcut. Bizim iletişim kuralı PKR bağımlı RNA'ların analizi için optimize edilmiştir, ama hücresel dsRNAs veya RNA-interactors diğer dsRNA bağlayıcı proteinlerin eğitimi için kolayca değiştirilebilir.
Giriş
Protein kinaz (PKR) RNA-harekete geçirmek, olarak da bilinen ökaryotik başlama faktör 2-Alfa kinaz 2 (EIF2AK2), RNA'ların tarafından sağlanan bilgi ileten bir iyi karakterize protein kinaz var. Ökaryotik çeviri başlatma 2 alt birim alfa (eIF2α) ait kinaz aile ve serin 51 yanıt olarak küresel çeviri1bastırmak için enfeksiyon, eIF2α phosphorylates. Bu bağlamda, PKR PKR dimerization ve autophosphorylation2için bir platform sağlamak viral çift iplikçikli RNA (dsRNAs), tarafından etkinleştirilir. EIF2α ek olarak, PKR da p53, insülin reseptör substrat 1, inhibitörü κB ve c-Jun N-terminal kinaz (JNK) çok sayıda sinyal iletim yo....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. çözüm ve hücre hazırlık
- Çözüm hazırlık
- Hücre kültür ortamı için orta HeLa hücre kültürü için 50 mL fetal sığır serum (FBS) ekleyerek 500 mL Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) için hazır olun.
Not: Antibiyotik hücre kültür ortamına eklenebilir, ancak biz antibiyotik kullanmayın. - %0,1 paraformaldehyde için 1 %4 (w/v) paraformaldehyde erimesi x Phosphate-Buffered serum fizyolojik (%0,1 (v/v) paraformaldehyde 30 mL 1 x PBS ekleyerek yapmak için PBS) Isıtma sıcak tabakta ve seyreltik ile.
Dikkat: bir duman mahallede tüm adımlarını gerçekleştirin ve paraformaldehyde çözüm kaynatın değil dikkatli olun. % 0,1 çözüm ışıktan korumak v....
- Hücre kültür ortamı için orta HeLa hücre kültürü için 50 mL fetal sığır serum (FBS) ekleyerek 500 mL Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) için hazır olun.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Hücre döngüsü S veya M aşamasında HeLa hücreleri tutuklamaya işleminin şematik Resim 1' de gösterilen. M faz tutuklandı bir örnek, açıkça (şekil 2A) mikroskop altında yuvarlak şekilli hücreler görselleştirebilirsiniz. Hücre döngüsü tutuklama verimliliğini incelemeye, nükleer hücre içeriğini FACS (şekil 2B) kullanılarak analiz edilebilir. Şekil 3 D7F7 antikor immunoprecipitate PKR üstün yeteneği gösterir nerede immunopreci.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
S veya M faz tutuklandı örnekleri hazırlamak için işlem şekil 1' de gösterilmiştir. S aşamada hücreleri tutuklamaya biz nereye biz timidin sürümüyle arasında yüksek tutuklama verimliliği (şekil 1A) sağlamak için iki kez bir 9 h hücrelerle tedavi timidin çift blok yöntemi kullanılır. M faz durması için biz timidin bir kez hücrelerle tedavi 9 h yayın tarafından takip ve nocodazole prometafaz (şekil 1B) blok hücreleri uygulanır. Hücre .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Bu eser temel bilim araştırma programı aracılığıyla Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (Kore hükümeti Bilim Bakanlığı ve ICT (NMK-2016R1C1B2009886) tarafından desteklenen NMK) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0,5 M EDTA, pH 8,0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| 1 M Tris, pH 7,0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1 M Tris, pH 8,0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1,7 mL mikrosantrifüj tüpü | Axygen | MCT-175-C | |
| %10 Nonidet-p40 (NP-40) | Biyoçözelti | BN015 | |
| 10X DNA yükleme tamponu | TaKaRa | 9157 | |
| 15 mL konik tüp | SPL | 50015 | |
| 3' adaptör | 5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3'3 | ||
| M Sodyum Asetat pH 5.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9740 | |
| 5 | 5'-GUU ÇAĞ AGU UCU ACA GÜÇ CGA CGA UCN NNN-3' | ||
| 5 M NaCl | Thermo Fisher Scientific | AM9760G | |
| 50 mL konik tüp | SPL | 50050 | |
| Asit-fenol kloroform, pH 4.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9722 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Manyetik boncuklar DNA / RNA temizleme |
| Antarktika alkalin fosfataz | New England Biolabs | M0289S | |
| Anti-DGCR8 | Evde üretilmiştir | ||
| Anti-PKR (D7F7) | Hücre sinyalizasyon teknolojisi | 12297S | |
| Anti-PKR (Milli) | Millipore EMD | 07-151 | |
| ATP (100 mM) | GE Healthcare | GE27-2056-01 | |
| Bromofenol mavi sodyum tuzu | Sigma-aldrich | B5525 | |
| Buzağı bağırsak alkalin fosfataz | TaKaRa | 2250A | |
| Hücre sıyırıcı 25 cm 2 konumlu | Sarstedt | 83.183 | |
| CMV promotör dizisi | 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'Dulbecco'nun | ||
| modifiye kartal ortamı | Welgene | LM001-05 | |
| dNTP karışımı (2,5 mM) | TaKaRa | 4030 | |
| Etanol, Mutlak, ACS Sınıfı | Alfa-Aesar | A9951 | |
| Fetal sığır serumu | Merck | M-TMS-013-BKR | |
| Formamid | Merck | 104008 | |
| Glisin | Biyo-bazik | GB0235 | |
| GlycoBlue kopreçökitan (15 mg / mL) | Thermo Fisher Scientific | AM9516 | |
| İzopropanol | Merck | 8.18766.1000 | |
| NEBNext rRNA Tükenme Kiti | New England Biolabs | E6318 | rRNA Tükenme Kiti |
| Nokodazol | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| Normal tavşan IgG | Hücre sinyal teknolojisi | 2729S | |
| Paraformaldehit | Sigma-Aldrich | 6148 | |
| PCR ileri astar (RP1) | 5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CG TCC GA-3' | ||
| PCR indeksi ters primer (RPI) | 5'-CAA, GCA, GAA, GAA, GGC, GGC, ATA CGA, GAT NNN, NNN, GTG, ACT, GGA, GTT, TGG, CAC, CCG, AGA, ATT, CCA-3' | ||
| düz kapaklı PCR tüpleri, 0.2 mL | Axygen | PCR-02-C | |
| Fosfat bufered salin (PBS) Tablet | TaKaRa | T9181 | |
| Phusion yüksek kaliteli DNA polimeraz | New England Biolabs | M0530 | Yüksek kaliteli polimeraz |
| Açılır rotorlu PlateFuge mikrosantrifüj | Benchmark | c2000 | |
| Polinükleotid kinaz (PNK) | TaKaRa | 2021A | |
| Proteinaz K, rekombinant, PCR Sınıfı | Sigma-Aldrich | 3115879001 | |
| qPCR primer dizisi: CO1 Ağır | İleri/Geri: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sırası: CO1 Işığı | İleri/Geri: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR astar sırası: CO2 Ağır | İleri/Geri: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer dizisi: CO2 Işığı | İleri/Geri: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer dizisi: CO3 Ağır | İleri/Geri: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer dizisi: CO3 Işığı | İleri/Geri: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer dizisi: CYTB Ağır | İleri/Geri: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer dizisi: CYTB Işık | İleri/Geri: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer dizisi: GAPDH | İleri/Geri: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer dizisi: ND1 Ağır | İleri/Geri: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer dizisi: ND1 Işık | İleri/Geri: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer dizisi: ND4 Ağır | İleri/Geri: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR astar dizisi: ND4 Işık | İleri/Geri: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer dizisi: ND5 Ağır | İleri/Geri: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer dizisi: ND5 Işık | İleri/Geri: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer dizisi: ND6 Ağır | İleri/Geri: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer dizisi: ND6 Işık | İleri/Geri: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Rastgele heksamer | Thermo Fisher Scientific | SO142 | |
| Rekombinant Dnase I (Rnaz içermez) (5 U/μ L) | TaKaRa | 2270A | |
| Rekombinant Rnaz inhibitörü (40 U/μ L) | TaKaRa | 2313A | |
| Ribo-Zero rRNA Çıkarma Kiti | Illumina | MRZH116 | rRNA Çıkarma Kiti |
| Rotator | FINEPCR, ROTATOR AG | D1.5-32 | |
| RT primer dizisi: CO1 Ağır | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′ | ||
| RT astar dizisi: CO1 Işık | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′ | ||
| RT astar sırası: CO2 Ağır | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′ | ||
| RT astar dizisi: CO2 Işık | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′ | ||
| RT astar sırası: CO3 Ağır | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′ | ||
| RT astar dizisi: CO3 Işık | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′ | ||
| RT astar dizisi: CYTB Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′ | ||
| RT astar dizisi: CYTB Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′ | ||
| RT primer dizisi: GAPDH | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′ | ||
| RT astar sırası: ND1 Ağır | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′ | ||
| RT astar dizisi: ND1 Işık | 5 & prime; -CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3 & prime; | ||
| RT astar dizisi: ND4 Ağır | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′ | ||
| RT astar dizisi: ND4 Işık | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACCATTCTCAACCC-3′ | ||
| RT astar sırası: ND5 Ağır | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTTTGTTGAGGTGATG-3′ | ||
| RT astar dizisi: ND5 Işık | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′ | ||
| RT astar dizisi: ND6 Ağır | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′ | ||
| RT astar dizisi: ND6 Işık | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′ | ||
| Silikonize polipropilen 1.5 mL G-tüp | Bio Plas | 4167SLS50 | |
| Sodyum dedesil sülfat | Biosesang | S1010 | |
| Sodyum deoksikolat | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SUPERase In Rnaze inhibitörü | Thermo Fisher Scientific | AM2694 | |
| SuperScript III ters transkriptaz | Thermo Fisher Scientific | 18080093 | Kütüphane hazırlığı için ters transkriptaz |
| SuperScript IV ters transkriptaz | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | qRT-PCR |
| SYBR altın nükleik asit gl boyası | Thermo Fisher Scientific | S11494 | |
| T4 polinükleotid kinaz | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 RNA ligaz 1 (ssRNA Ligaz) | New England Biolabs | M0204 | |
| T4 RNA ligaz 2, kesilmiş KQ | New England Biolabs | M0373 | |
| Thermomixer | Eppendorf ThermoMixer C, ThermoTop | ||
| Timidin | Sigma-Aldrich | T9250 | |
| Tris-borat-EDTA tamponu (TBE) | TaKara | T9122 | |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | |
| Ultralink Protein A sefaroz boncuk | Thermo Fisher Scientific | 22810 | Protein A boncuk |
| Ultrasonicator | Bioruptor | ||
| Üre | Biyo-bazik | UB0148 | |
| Vorteks karıştırıcı | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Ksilen siyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| &gama;-32P-ATP (10 μ Ci/μ L, 3.3 & mu; M) | PerkinElmer | BLU502A100UC |
Kaynaklar
- Meurs, E. F., et al. Constitutive expression of human double-stranded RNA-activated p68 kinase in murine cells mediates phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 and partial resistance to encephalomyocarditis virus growth. Journal of Virology. 66 (10), 5805-5814 (1992).
- Patel, R. C., Stanton, P., McMil....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
