Yöntem makalesi

Bariyer geçişleri patojenler veya ilaçlar ve onların etkileşim beyin ile çalışmak için bir insan kan-beyin arabirim modeli

DOI:

10.3791/59220

⸱

9 Nisan 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut Pasteur, CNRS UMR 3569, Unité de Neuroimmunologie Virale, 2Institut Pasteur, Unité d’Epidémiologie et de Pathophysiologie des Virus Oncogènes, Université Sorbonne Paris Cité/Paris Diderot, 3Institut Pasteur, PFIA, DTPS

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada bir içinde cellulo BBB (kan beyin bariyerini) ayarını açıklayan bir iletişim kuralı mevcut-Minibrain polyester geçirgen membran kültür taşıma biomolecules veya enfeksiyöz ajanlar arasında bir insan BBB değerlendirmek için sistem eklemek ve onların komşu beyin hücreleri üzerinde fizyolojik etkisi.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Erken üzerinde uygun bir sinir sistemi ilaçların eleme ve hala bir karşılanmamış ihtiyaç cellulo BBB modelindeki onların penetrasyon ve bariyer ve beyin parankimi ile onların etkileşim için güvenilirdir. Bu boşluğu doldurmak için biz geçirgen membran kültür Ekle insan BBB modeli ile bir Minibrain tri-etik, kültürler tarafından insan beyin hücrelerinin (nöron, astrocytes ve mikroglial hücreleri) oluşan bir polyester birleştirerek bir 2D cellulo modelinde, BBB-Minibrain, tasarlanmıştır. BBB-Minibrain nöroprotektif uyuşturucu aday (örneğin, Neurovita) taşıma test bize aracılığıyla BBB, bu molekül nöronlar için belirli hedef belirlemek ve ilaç nöroprotektif mülkiyeti sonra korundu göstermek için izin ilaç BBB geçmişti. BBB-Minibrain virüs parçacıkları geçirilmesi endotel hücreleri bariyer arasında algılamak ve Minibrain enfeksiyon neuroinvasive virüs parçacıkları tarafından izlemek için ilginç bir model teşkil de göstermiştir. BBB-Minibrain tedavi veya hakaret sonra araştırmacı hücre Kültür Teknoloji eğitim ve beyin hücreleri fenotipleri akıllı kolay güvenilir bir sistemdir. Cellulo test ilgi tür iki kat olurdu: ilaç geliştirme erken adımda bir yandan derisking ve hayvan testleri Öte yandan kullanımının azaltılması tanıtımı.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beyin beyin parankimi ve kan - beyin bariyerini (BBB) denilen kan arasında değişim kısıtlar geçirgen olmayan bir yapı sistemik dolaşım ayrılır. Çoğunlukla beyin endotel hücreleri oluşur, BBB dinamik olarak astrocytes, Perivasküler microglia ve komşu beyin parankimi nöronlar ile etkileşime girer. Oluşturma ve bakımını iyonik homeostazı besin ve toksik yaralanmaları koruma ile beyin temini veya giriş katkıda patojenler1,2, nöronal iþlevlerinin BBB üç önemli işlevleri vardır beyin homeostazı ve onun fonksiyonları3bakım. Sadece birkaç uyuşturucu BBB4,5geçebileceğinizi verimli bir engeldir. Şu anda, bir molekül BBB geçmek ve beyine diffüz tahmin etmek için kullanılabilir yöntemleri, ex vivo çalışmalar otopsi malzeme, görüntü izleme beyin MRI (manyetik rezonans görüntüleme) ya da evde beslenen hayvan (pozisyon emisyon tarafından insan gönüllü oluşur Tomografi) veya özellikler ve farmakokinetik preklinik çalışmalar hayvanlar6,7,8. Bu teknikleri ve modelleri evde beslenen hayvan sınırlı çözünürlük ve MRI6,8, molekülleri (yani, örneğin dayalı antikor moleküller) bu kötü ölçmek için zorluk düşük duyarlılık gibi bazı kısıtlamalar bulunmaktadır beyin7nüfuz ve preklinik için onların yüksek maliyet ve resort hayvan test çalışmaları.

Son nokta önemlidir çünkü 3R's kuralları, (değiştirme, azaltma ve hayvan test arıtma göre) düzenleyici idarelerin araştırmacılar acilen bilimsel olarak doğru seçimli-e doğru hayvan geliştirmek istedi, deney9,10,11,12,13,14,15.

Son on yıl içinde BBB birkaç tüp bebek modelleri16,17,18 filtresinde kalkındırırken tarafından önerilmiştir membran fare, sıçan, sığır ve domuz gibi farklı türlerden endotel hücreleri ekler. İnsan türünün ilgili olarak Primer hücre kıt ve zor durumu ölümsüzleştirdi beyin endotel hücreleri veya insan kaynaklı kök hücre19,20göre insan modellerinin geliştirilmesi için araştırmacılar istenir, 21. Onlar hızlı endotel hücre işaretleri, sıkı Kavşağı işaretleri, sızma taşıyıcılar, çözünen taşıyıcı, reseptörler, bu engelleri BBB uygun tüp bebek vekilleri ile mümkündür ve endotel uyaranlara 20' ye yanıt. Endotel hücreleri ve diğer hücre tipleri (yani, astrocytes, nöronlar veya perisitlerden22,23,24) ile kaplı filtre membran ekler kullanarak birkaç BBB modelleri denetlesinler. Astrocytes/nöronlar veya perisitlerden tarafından çözünür faktörler salgılanmasını avantajlarından yararlanarak BBB fiziksel özelliklerini artırmak için bu ortak kültürler amacı oldu.

Yine de, bu modellerin hiçbiri çalışma ve bariyer geçtikten sonra bir uyuşturucu aday kaderi tahmin beyin parankimi içerir. Bu nedenle, amacımız içinde bir cellulo yapı oldu kan/beyin arabirimi, BBB-BBB manken ve bir kültür karışık beyin hücrelerinin tek bir kiti birleştirerek Minibrain,. BBB-Minibrain multiwell hücre kültür kalıbının kuyuya eklenen gözenekli filtre oluşan bir kültür sistemi kullanır. Filtre BBB uyuşturucu BBB oluşturmak için25,26,27, testi için son derece güvenilir kanıtlanmıştır bir insan beyni endotel hücre kültürünü hCMEC/D3 hücreleri ile kaplanır. Minibrain, insan nöronların ortak farklılaşmış bir kültür olduğu ve türetilmiş NTera/Cl2.D1 hücre satırı28,29 astrocytes CHME/Cl530 oranı karşılık gelen insan mikroglial hücre satırı ile birlikte karışık microglia nöron-astrocytes oranları beyin31, vs ekili Kalenin dibinde de.

BBB ve kaderlerini parankimi içinde uyuşturucu geçiş eğitim yanı sıra, cellulo modeli kan-beyin arabiriminde beyin (neuroinvasiveness), beyin (neurotropism) içine dağılım içine patojenlerin girişi adresine güçlü bir araç olabilir ve onlar beyin parankimi hücreleri üzerinde sarfetmek toksisite (neurovirulence). Neurovirulence ve neuroinvasiveness çalışmaları etkili bir cellulo modeli geliştirilmesi yararlanın ve hayvan modelleri yerine avantajlı. BBB-Minibrain kiti32kullanarak, biz neuroinvasive fenotip hazırlamak için kullanılan Fransızca Neurotropic virüs suşu sarı humma virüsü (yani, FNV'nin-YFV33,34) içinde birikmiş nadir viral mutantların gösterdi bir iptal edilen canlı YFV aşı ve Neurovita (bundan böyle NV el yazması da adlandırılır)35denilen bir neuroregenerative ve nöroprotektif biomolecule geçirilmesi. Çünkü NV ikisi de doğal olarak hücre zarı haçlar ne de değişken bölümü (VHH) ile BBB dahil olmak üzere biyolojik membran aşar ve işlevleri molekül (BGBM)36delici bir hücre Lama bir tek zincir antikor, BBB, NV erimiş. VHH BGBM mülkiyeti isoelectric noktası ve VHH37uzunluğu bağlı gibi görünüyor.

Böyle cellulo testinde daha potansiyel olarak BBB farmakokinetik taşıyan ve özellikler analysis hayvanlarda ve ideal olarak gergin onların davranış tahmin edebilmek için aynı zamanda önce geçebileceği molekülleri sıralamak mümkün olacak parankimi. Bu sistem biyolojik olarak ilgili ve kolay kurulum ve hücre kültürü26,29,30,38içinde iyi eğitimli profesyoneller tarafından idare edilmiştir. Cellulo test ilgi tür iki kat olur: bir yandan preklinik testleri maliyetlerinin azaltılması ve diğer yandan hayvan test kullanımının azaltılması.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hücre kültür Ntera/CL2 eseri. D1 sonrası Mitotik hNeurons ve hAstrocytes (NT2-N/A) ortak bir kültür hazırlamak için

Not: Bu Minibrain (şekil 1) bileşenidir.

  1. Ntera/Cl2.D1 kültürü
    1. Donmuş hücreleri bir şişe sıvı azot haznesini çıkarın. Buz üstünde tutun.
    2. 37 ° C su banyosu hızla hücrelerde çözülme.
    3. 15 mL tüp 10 mL tam DMEM F12 orta içeren hücrelerde transfer (Dulbecco'nın modifiye kartal orta: Besin karışımı F-12 orta) % 10 fetal sığır serum (FBS), 2 mM glutamin, 100 IU penisilin ve 100 µg streptomisin (yani, tamamlamak DMEM F12 orta).
    4. 200 x g (RT) oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi. Tam DMEM F12 orta 2 ml Pelet ayırmak.
    5. Aktarım polistiren hassas yapışık hücreleri için spesifik tedavi ile bir T75 doku kültürü şişesi ' (T75Cell+) tam DMEM F12 Orta 13 mL içeren.
    6. Kültür 37 ° C, % 5 CO2 ve % 95 nem oranı % 90 izdiham kadar tutulan bir kuluçka hücrelerde (yani, yaklaşık 5 gün). Orta 2-3 günde değiştirin.
  2. Ntera/Cl2.D1 ve amplifikasyon subculturing
    1. Orta balonun kaldırın.
    2. Hücre monolayer Ca2 + ve Mg2 +ile desteklenmiş fosfat tampon salin (PBS) 10 mL ile yıkayın.
    3. 10 mL EDTA çözeltisi (RT muhafaza) ile hücre monolayer durulayın.
    4. 3 mL tripsin-EDTA çözeltisi (% 0.05 Tripsin, %0.02 EDTA) ekleyin ve 2 dk RT. az kuluçkaya
    5. Şişeye sallamak ve hücreleri plastik yüzeyden ayrılır emin olun.
    6. Tripsin devre dışı bırakabilirsiniz, 15 mL tüp ve santrifüj RT. de 200 x g , 5 min için transfer için tam DMEM F12 orta 10 mL ekleyin
    7. Pelet tam orta 10 mL ile ayırmak ve 1 mL tam DMEM F12 orta 14 mL içeren her yeni şişesi aşılamak için kullanın.
      Not: Otuz T75 hücre+ şişeler her farklılaşması için gerekli değildir.
    8. Şişeler 37 ° C, % 5 CO2 ve % 95 nem % 90 izdiham kadar kuluçkaya.
  3. NTera/Cl2.D1 farklılaşma insan nöron-astrocyte ortak kültür
    Not: Bu Minibrain ana bileşenidir.
    1. 0 gün, tripsin-EDTA 1.2 adımda anlatıldığı gibi hücrelerle ayırmak ve her şişeyi hücre Pelet tam DMEM F12 orta 2 mL ile ayırmak.
    2. 1 mL (5 x 106 hücrelere karşılık gelen) hücre süspansiyon 60 plastik Petri yemeklerinde 85 mm çapında tam DMEM F12 Orta 11 mL içeren ekleyin.
      Not: Hücreler için plastik eklemek değil ve form sözde neurospheres (bkz. şekil 1alt panelinde fotoğraf) için toplamak. 37 ° C, % 5 CO2 ve % 95 nem 60 Petri yemekler için bir gün kuluçkaya.
    3. Gün 1, all-Trans retinoik asit (ATRA) Petri kabına (son konsantrasyonu ATRA 10 µM) başına 130 µM ile takıma tam DMEM F12 orta 1 mL ekleyin ve 37 ° C, % 5 CO2 ve 24 saat için % 95 nem yemekleri dönün.
    4. Gün 2, çok dikkatli bir şekilde hücre küreler her Petri Dish 50 mL tüp ve 50 x g , 10 dk santrifüj ve dik Dissociate dikkatle 13 mL 10 µM ATRA ile desteklenmiş tam DMEM F12 orta ile gevşek Pelet içeren orta nakletmek ve th eklemek e yeni 85 mm çapında Petri kabına 13 mL.
      Not: farklı geçişler üzerinde bu küreler yoğunluğu yüksek 2 gün (yani, bir yoğunluğu % 70) elde edilen yoğunluk olarak korumak son derece önemlidir. Küre yoğunluğu düşürülmesi, bu nedenle, Petri yemekler hücre sayısına göre toplam sayısını azaltın.
    5. Yukarıdaki yordamı (Adım 1.3.4) 4, 6 ve 8 gün tekrarlayın.
    6. Gün 10, yukarıdaki yordamı yineleyin ama küreler Petri yemekler yerine T75 hücre+ şişe ekleyin. Hücreleri bir Petri kabına bir T75 hücre+ şişesi için ekleyin.
    7. Gün 11, 13, 15 ve 17, 14 mL tam DMEM 10 µM ATRA ile desteklenmiş F12 ile kullanılan orta değiştirin.
    8. Gün 19, orta 14 mL şişe başına ATRA olmadan tam DMEM F12 orta ile değiştirin.
    9. Gün 20, yavaşça tripsin/EDTA içeren hücreleri aşağıdaki gibi ayırmak.
      1. Her T75 hücre+ şişesi için PBS ile Ca2 + ve Mg2 +10 mL hücrelerle durulayın; EDTA 4 mL RT., 5 min için hücrelerle kuluçkaya
      2. EDTA dikkatli bir şekilde çıkarın ve tripsin-EDTA 2 mL ekleyin ve RT. sallamak çok yavaşça şişeye, 7 dk kuluçkaya ve tam DMEM F12 orta dikkatle 8 mL ekleyin.
      3. Santrifüj 10 dk 160 x g ve RT. az için ayırmak hücre Pelet 13 ml tam DMEM F12 orta ve T75 hücre+ şişesi aktarımda.
        Not: ATRA kurtarma güçlü plastik eşya bağlı olan özgün teratocarcinoma hücrelerden hücreleri ayrıştırılan tripsin-EDTA ile çok nazik ayrılma izin verir.
    10. Gün 21 de, orta ve ölü hücreleri kaldırın. 14 mL % 5 ile desteklenmiş tam DMEM F12 orta ekleyin FBS, 2 mM glutamin, 100 IU penisilin, 100 µg streptomisin ve araç (sitozin β-D-arabinofuranoside) 0.5 µM (%5 tamamlandı FBS DMEM F12-araç).
    11. Gün 23, 25 ve 28, yerine kullanılan orta ile 14 mL % 5'lik FBS DMEM F12-araç.
    12. 49 (her iki gün) kadar gün 29, yerine kullanılan 14 mL % 5 fetal sığır serum, 2 mM glutamin, 100 IU penisilin, 100 µg streptomisin, FudR (5-fluoro-2' deoxyuridine) 5 mikron ve 10 µM ile desteklenmiş tam DMEM F12 orta ile orta Urd (Uridine) (tam %5 FBS DMEM F12-FudR-Urd).
    13. Gün 50, takıma %5 FBS, 2 mM glutamin, 100 IU penisilin, tam DMEM F12 orta 14 mL ile kullanılan Değiştir orta 100 µg streptomisin ve 10 µM Urd (%5 tamamlandı FBS DMEM F12-Urd).
    14. 95 (haftada iki kez) kadar gün 51, yerine kullanılan orta tam %5 14 mL ile FBS DMEM F12-Urd.
      Not: Hücreler 51 günden deneyler için kullanılan ama gün 95'den değil daha sonra olabilir. Mitoz inhibitörleri ile seri tedaviler kullanımı sonrası Mitotik hNeuron ve hAstrocytes (NT2-N/A) ortak kültür saf nüfusu kurtarma sağlar.
    15. Hücreleri temel için gün 20 için açıklandığı gibi nazik trypsinization ile devam edin.

2. hücre kültürü çalışmalarının insan mikroglial CHME/Cl5 hücreleri

Not: Bu Minibrain mikroglial bileşeni olduğunu (Şekil 1).

  1. İnsan mikroglial kültür CHME/Cl5 hücreleri
    1. Donmuş hücreleri bir şişe sıvı azot tankından kaldırın. Buz üstünde tutun.
    2. Hızla bir 37 ° C su banyosunda çözülme.
    3. 15 mL tüp 10 mL % 5 fetal sığır serum, 2 mM glutamin, 100 IU penisilin ve 100 µg streptomisin (yani, tam %5 FBS DMEM F12 orta) ile desteklenmiş tam DMEM F12 orta içeren hücrelerde aktarın.
    4. 200 x g dik Dissociate, 5 min için de tam %5 FBS DMEM F12 orta 2 mL ile Pelet santrifüj kapasitesi.
    5. Tam %5 FBS DMEM F12 Orta 13 mL içeren bir T75 hücre+ şişesi aktarın.
    6. Kültür hücreleri 37 ° C, % 5 CO2 ve % 95 nem % 90 izdiham kadar. Orta 2-3 günde değiştirin.
  2. İnsan mikroglial hücre CHME/Cl5 subculturing
    1. Orta balonun kaldırın.
    2. Hücre monolayer Ca2 + ve Mg2 +ile desteklenmiş PBS 10 mL ile yıkayın.
    3. 10 mL EDTA çözeltisi (RT muhafaza) ile hücre monolayer durulayın.
    4. 3 mL tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve 2 dk RT. az kuluçkaya
    5. Şişeye sallamak ve hücreleri plastik yüzeyden ayrılır emin olun.
    6. Tripsin devre dışı bırakabilirsiniz, 15 mL tüp ve santrifüj 200 g ve RT. x 5 min için transfer için tam %5 FBS DMEM F12 orta 10 mL ekleyin
    7. Pelet tam orta 10 mL ile ayırmak ve 1 mL tam %5 FBS DMEM F12 orta 14 mL içeren her yeni şişesi aşılamak için kullanın.
    8. Şişeler 37 ° C, % 5 CO2 ve % 95 nem % 90 izdiham kadar kuluçkaya.

3. Kültür iş gözenekli ekler ceket ve BBB hazırlamak için hCMEC/D3 ile

  1. İnsan endotel hücreleri hCMEC/D3 (Şekil 2) kültürü
    1. 1:30 saf steril su (hücre kültür grade) ile kollajen sıçan türü sulandırmak.
    2. 10 mL T75 hücre+ şişesi aktarmak ve 2 h 37 ° C, % 5 CO2 ve % 95 nem kuluçka kuluçkaya.
    3. Kollajen çözümü kaldırmak ve endotel hücre orta HEPES (tam endotel hücre ortamı olarak da adlandırılır) 10 mM ile takıma 15 mL ile değiştirin.
    4. Hücreleri cryo şişe sıvı azot tankından kaldırın. Buz üstünde tutun.
      Not: Hücreleri yetişkin ve tohum çok üretici tarafından açıklandığı gibi yapıldı. Hücre bir biyolojik malzeme transfer anlaşması kapsamında. Hücreler geçit numaradan 25 elde edilen ve geçiş 35 daha fazla kullanılmamalıdır.
    5. Hızla bir 37 ° C su banyosunda çözülme.
    6. T75 hücre+ şişeye hücrelerde aktarmak ve 37 ° C, % 5 CO2 ve 2-4 h için % 95 nem şişeye dönüş.
    7. Orta kaybetme veya hücreleri çıkarmadan dikkatli bir şekilde çıkarın. Bir kez tam endotel hücre orta 10 mL içeren hücreleri durulayın.
    8. Tam endotel hücre orta 15 mL ekleyin.
    9. Kültür hücreleri 37 ° C, % 5 CO2 ve % 95 nem % 100 kesiştiği yerde orta değiştirmeden (az 4 gün) kadar.
  2. HCMEC/D3 BBB ekleme hazırlamak için subculturing
    1. Yeni bir T75 hücre+ şişesi kat veya ekler türü ile ben sıçan kollajen (yukarıdaki adım 3.1) açıklandığı gibi.
    2. Orta balonun kaldırın. Hücre monolayer Ca2 + ve Mg2 +ile desteklenmiş PBS 10 mL ile yıkayın.
    3. 2 mL tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de 5 dk kuluçkaya
    4. Şişeye sallamak ve hücreleri plastik yüzeyden tamamen ayrılmış olduğundan emin olun.
    5. Tripsin devre dışı bırakabilirsiniz için tam endotel hücre orta 4 mL ekleyin.
    6. 5 mL plastik pipet ile mekanik alıyorum ve hücre süspansiyon en az 5 kere 5 mL pipet şişeye altına Bakımı yaparken kızarma tarafından hücreleri ayırmak.
    7. Hücreleri saymak ve kullanım 5 x 104 hücreleri/eklemek bir 12 de polyester membran kültür için INSERT ve bir T75 hücre+ şişesi için 2 x 106 hücre ekler. Ayrıca üç filtre hücreleri olmadan Polyester membran kültür ekler ile PELy (yani, endotel hücreleri geçirgenliği aşağıdaki paragraf 4.2 Lucifer sarı bakın) deneyler için hazır olun.
    8. Şişeler veya ekler 37 ° C, % 5 CO2 ve % 95 nem % 100 izdiham kadar kuluçkaya.
    9. T75 hücre+ şişesi için orta kadar yeni bir geçit değiştirmeyin. Aksine BBB polyester membran kültür için ekler: Orta gün 2 ve 4 değiştirmek için BBB deneyler için 6 gün kullanın.

4. inşaat ve kalite kontrolü BBB-Minibrain (Şekil 2)

  1. BBB-Minibrain Polyester ayarlama membran kültür eklemek aygıt (şekil 2B)
    1. 12 hCMEC/D3 hücrelerin büyümesine de Polyester membran kültür endotel hücre orta onları deneme için kullanmadan önce 6 gün için filtreler ekleyin.
    2. Poli-D-lizin (1 mL/iyi, 10 µg/mL, RT 4 h) ve sonra laminin (1 mL/iyi, 1 µg/mL, RT, bir gecede) ile 12 iyi plaka kat.
    3. Laminin kaldırın ve 1 mL % 5 ile desteklenmiş endotel hücre orta ekleyin FBS (%5 endotel hücre orta).
    4. 1 h 37 ° C, % 5 CO2 ve % 95 nem için kuluçkaya.
    5. Yavaşça NT2-N/A (1.3.9 adımda anlatıldığı gibi) ve CHME/Cl5 (2.2 adımda anlatıldığı gibi) trypsinize ve hücre topakları tam endotel hücre orta ile ayırmak.
    6. Hücreleri, mix 3.6 x 105 NT2-N/A ve 0,4 x 105 CHME/Cl5 hücreler/iyi ve tohum 12 iyi plaka sayısı.
    7. T = 24 saat (24 saat sonra Ekim tarihi) itibariyle: taze tam endotel hücre orta (Minibrain hücreleri ve endotel hücreleri) ile kullanılan orta değiştirin ve hCMEC/D3 Polyester membran kültür Ekle filtre Minibrain hücreleri üzerine aktarın. BBB-Minibrain 37 ° C, % 5 CO2 ve % 95 nem kuluçkaya.
      Not: BBB-Minibrain sonra bir katman insan endotel hücreleri hCMEC/D3 luminal bölme (veya "kan" bölme) izole filtrede ve insan hücreleri hNT2-N/A ve hCHME/Cl5 (Minibrain) de belirleyici altındaki karışık bir kültürün oluşacaktır abluminal bölme (veya "beyin" bölme) (şekil 2B).
  2. BBB-Minibrain (kalite kontrol) (şekil 2C) endotel geçirgenliği doğrulama
    1. HBSS (Hanks dengeli tuz solüsyonu) arabelleği Ca2 + ve 10 mM HEPES ve 1 mM sodyum pyruvate ile desteklenmiş Mg2 + ile Aktarım arabellek (TB), hazır olun.
    2. 12 iyi tabak taşıma arabelleği iyi başına 1,5 mL ile hazırlayın.
    3. T = 0 taze olun Aktarım arabellek Lucifer sarı (LY-TB) 50 µM ile desteklenmiştir.
    4. Baş aşağı dikkatle orta endotel hücre bariyer etkilemeden kaldırmak için her filtre ters.
    5. Filtre dolu 12 iyi tabağa yerleştirin ve LY-TB 0.5 mL ekleyin.
    6. Plakayı bir kuluçka 37 ° C, % 5 CO2 ve % 95 nem kuluçkaya.
    7. T = 10 dk transfer filtrelere göre yeni TB 12 iyi plakaları dolu ve OD okumak için ilk plaka abluminal bölmesinin tutmak.
    8. T = 25 dk, 4.2.7 adımı yineleyin.
    9. T = 45 dk, aktarımı plakaları filtreleri kaldırarak durdurun. Abluminal ve OD önlemleri luminal bölmeleri tutun.
    10. Karanlık 96 aktarımda de tabaklar örnekleri: 190 µL TB örneği abluminal salonlar için 200 µL LY-TB ve luminal bölmeleri ile 10 µL.
    11. LY-TB Floresans ölçmek λ428 nm λ535 nm, farklı örnekleri mevcut (uyarma ve emisyon uzunluğu dalgalar sırasıyla).
    12. Endotel geçirgenliği (Pe) LY-TB (PeLY) Siflinger-Birnboim, A et al. (1987)39 ve Da Costa, formül kullanarak A ve ark. (2018)34 göre doğru hesaplamak:
      1/PSe (1/PSt) =-(1/PSf) ve PeLYPSe/S. =
      Not: PSf filtre hücreleri olmadan geçirgenliği, PSt hücreleri filtresiyle geçirgenliği, PSe olduğunu monolayer S yüzeyi monolayer yüzeyine endotel monolayer zaman geçirgenliği (12 iyi filtre için = 1.12 cm2 ), PeLY cm/dak ifade edilir. HCMEC/D3 PeLY 0.7 ve 1.2 x 10 arasında olmalıdır-3 cm/dak FBS esas olarak bağlı olarak deneylerinde kullanılır. Önemli: bir PeLY 1.2 BBB sıkı yeterli değildir ve bazı kaçak gözlenen anlamına gelir daha yüksek. Bu engellerin atmak.

5. kullanım örneğinde bir sarı humma virüsü aşısı, Fransız Neurotropic virüs YFV-FNV'nin 34 (Şekil 3) nöro-invaziv viral parçacıkların varlığını vurgulamak için BBB-Minibrain

  1. BBB geçiş ve çarpma Minibrain sarı humma virüslerin
    1. Adım 4.1.7 virüs eklenmesi önce 24 saat te açıklandığı gibi hazırlanan BBB-Minibrain kullanın; % 2 FBS endotel hücre orta orta yerine.
      Not: Sadece virüs eklemeden önce Orta değiştirmekten kaçının son derece önemlidir. Orta değişen insan endotel hücreleri etkinleştirmek ve geçici hangi virüs geçişini sağlayacak bariyer açın. Burada orta deneme başlamadan önce 24 saat değiştirilir.
    2. T = 0 3500 plak oluşturan birimler (PFU) YFV-FNV'nin, %2 50 µL içinde FBS endotel hücre orta luminal bölmenin üst kısmında çok dikkatli bir şekilde seyreltilmiş ekleyin. Denetim BBB-Minibrain 50 µL % 2 FBS endotel hücre orta virüs olmadan ile aşılanmış. PELY seyahat arkadaşı belirlemek.
    3. BBB-Minibrain 37 ° C, % 5 CO2 ve % 95 nem bir kuluçka kuluçkaya.
    4. 24 saat sonra polyester membran kültür ekler filtre aygıtı kaldırmak ve PeLY, örnek abluminal yuvası üzerinden 1 mL belirlemek ve A. da Costa ve ark. (2018)34tarafından açıklandığı gibi virüs titre. Orta ile taze % 2 FBS endotel hücre orta yerine.
    5. BBB-Minibrain 37 ° C, % 5 CO2 ve % 95 nem kuluçkaya.
    6. 72 h sonra abluminal bölme ortamından örnek ve virüs titre ve/veya Minibrain hücreler A. da Costa ve ark. (2018)34tarafından açıklandığı gibi gen ifade analizi için RNA ayıklamak.
  2. Neurotropic değişik-in YFV-FNV'nin Minibrain hücrelerde seri pasajlar tarafından amplifikasyon
    1. Kullanım Minibrain hücreler 12 iyi tabak (yani, adım 4.1.6 ve 4.1.7) kaplı.
    2. Zamanında 3.500 plak oluşturan birimler, YFV-50 µL % 2 FBS endotel hücre orta çok dikkatli bir şekilde üst kısmında hücreleri (luminal bölme) içinde seyreltilmiş FNV'nin eklemek 0 h, gelin.
    3. 1 h sonra virüs inoculum ile orta kaldırın ve taze % 2 FBS endotel hücre orta ile değiştirin.
    4. 48 h sonra 500 µL kültür ortamının örnek ve taze Minibrain hücreleri enfekte
    5. 120 h sonra 500 µL kültür ortamının örnek ve taze Minibrain hücreleri enfekte.
    6. 192 h sonra kültür (zenginleştirilmiş virüs stok =) orta kaydedin ve Minibrain hücreleri A. da Costa ve ark. (2018)34tarafından açıklandığı gibi gen ifade analizi için RNA ayıklamak.

6. BBB geçiş ve beyin hücre biomolecule hedefleme çalışmaya BBB-Minibrain kullanımı

  1. Biomolecule hedefleyen bir nöron BBB arasında taşıma
    1. Açıklanan adım 4.1.7 olarak hazırlanan Minibrain-BBB kullanın.
    2. Zaman yere 0 h, biomolecule ekleyin (örnekte sonuç bölümünde 58.75 ng/BBB hücre permeant NeuroTag-NV moleküllerin eklenmiştir sağlanan BBB-Minibrain yerleştirin.
    3. BBB-Minibrain 37 ° C, % 5 CO2 ve % 95 nem kuluçkaya.
    4. Sonra 24 h, polyester membran kültür ekler filtre aygıtı kaldırmak ve PeLY, belirlemek sonra hNeurons neurofilament Nf200 Minibrain hücreleri leke ve Minibrain (içinde sonucu sağlanan örnek biomolecule var olup olmadığını belirlemek Bölüm, NeuroTag-NV Strep etiketin karşı35,40içerdiği Yönetmen: bir antikor kullanarak algılandı).
  2. Biomolecule BBB geçtikten sonra bir neuroregenerative biomolecule ve Minibrain sonraki nöroprotektif tahlil BBB arasında taşıma
    1. 4.1.7. adımda açıklandığı gibi hazırlanan Minibrain-BBB kullanın.
      Not: sadece nöronlar hedefleme moleküller için Minibrain hücreleri nöron hücreleri (NT2-N) tek38tarafından değiştirilebilir.
    2. Zaman yere 0 h, moleküllerin C. Prehaud ve ark. (2014)35tarafından açıklanan de hücre permeant NV (etkin form CPM-NeuroTag-NV, etkin olmayan formu CPM-NeuroTag-NVΔ) ng/BBB-Minibrain 58.75 ekleyin.
    3. BBB-Minibrain 37 ° C, % 5 CO2 ve % 95 nem bir kuluçka kuluçkaya.
    4. 4 saat sonra bir enjeksiyon iğne ile bireysel yara açmak (26GX1/2 ", 12-4.5, Terumo, Belçika) Minibrain hücreleri üzerinde. En az 10 çizikler de her birey üzerinde olun. PELY seyahat arkadaşı belirlemek.
    5. BBB-Minibrain 37 ° C, % 5 CO2 ve % 95 nem bir kuluçka kuluçkaya.
    6. 8 h sonra abluminal yerde orta taze tam endotel hücre orta yerine.
      Not: Minibrain hücrelerinin yaralama hücre ölümü ve sitotoksik bileşikler sürümü yol açabilir beri bu adımı orta değiştirmek önemlidir.
    7. BBB-Minibrain 37 ° C, % 5 CO2 ve % 95 nem bir kuluçka kuluçkaya.
    8. 48 saat sonra C. Prehaud ve ark. (2013)40tarafından açıklandığı gibi hNeurons akson rejenerasyon için hücreleri lekeli.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BBB-Minibrain içinde bir cellulo deneysel olduğunu kan-beyin arabirimi model.

BBB-Minibrain polyester membran kültür ekleme sistemi üzerinde üst düzeyde bir kan bölme ve bir beyin bölme (şekil 2AB) kan-beyin arabiriminin alt düzeyde taklit etmek için ayarlanır. BBB şekillendirme filtre üzerinde hCMEC/D3 endotel hücreleri ile luminal bir bölme ve Minibrain insan tri-...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede biz içinde bir cellulo inşa etmek nasıl gösterdi kan/beyin arabirimi, BBB-BBB manken ve kültürünün birleştirerek Minibrain, karışık beyin beyin hücreleri (Minibrain) tek bir kit. Bu sistem biyolojik ilgili, basit-e doğru kurmak ve iyi eğitimli hücre kültüründe Denemecileri için kolu.

Şiddetli gerginlik bariyer kontrolünü uygulanırsa herhangi bir diğer tüp bebek model BBB gelince, güvenilir sonuçlar elde. Geçirgenliği ve herhangi bir INSERT yetersiz geçirgenlik değerleri (yani, bir ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fikri mülkiyet sisteminin 32, 35 ve 38başvuruda bulunulan patent yapıldı.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada Institut Pasteur bir Incitative Ödülü (PTR 435) dahil olmak üzere gelen iç hibe ve "Kervansaray'a de Soutien à la Recherche" sağlanan bir hibe tarafından Sanofi Pasteur Institut Pasteur için desteklenen bir durumdu. A. da Costa Sanofi Pasteur grant ve Florian Bakoa tarafından desteklenen olduğunu ANRT tarafından sağlanan bir doktora hibe alıcı (Derneği Nationale de la Recherche et de la Technologie). Biz yararlı tartışmalar için Pr Pierre-Olivier Couraud ve Dr Floransa Miller için borçlu bulunmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
12 kuyulu plakalarCorning3336
5-floro-2' deoksiüridinMerck-Sigma AldrichF0503
85mm Petri KabıSarstedt83-3902-500
Anti-Nf200Merck-Sigma AldrichN4142
ve beta; -merkapto-etanolMerck-Sigma AldrichM3148
CHME / Cl5Ünitesi ve eacute; de Neuroimmunologie ViraleDr Lafon
Calbiochem217274
Sitozin ve beta;-D-arabinofuranosidMerck-Sigma AldrichC1768
Dark 96 kuyulu plakalarCorning3915
DMEM F12Thermofisher Scientific31330-038
DMSOMerck-Sigma AldrichD2650
Endogro IVMilliporeSCME004endotel hücre ortamı
EtanolCarlo Erba529121
FBSHycloneSV30015-04
FormaldehitMerck-Sigma Aldrich252549
GIEMSARAL Teşhis320310
Keçi-Anti FareJackson İmmüno Araştırma115-545-003
Keçi-Anti TavşanThermofisher R37117
HBSSBilimsel14025-100
hCMEC / D3SedirCLU512
Hepes 1MThermofisher Bilimsel15630-070
Hoescht 33342Merck-Sigma Aldrich33263
LamininMerck-Sigma AldrichL6274
L-glutaminThermofisher Scientific25030-024
Lucifer SarıMerck-Sigma AldrichL0259
MEM 10XThermofisher Scientific21430
MEM 1XThermofisher Scientific42360
Ntera/Cl2D.1ATCCCRL-1973
ParaformaldehitElektron Mikroskobu Bilimleri15714
Ca2+-Mg2+Thermofisher Scientific14190
PBS-Ca2+-Mg2+Thermofisher Scientific14040-091
Kalem/StrepEurobioCXXPES00-07
Poli-D-LizinMerck-Sigma AldrichP1149
Uzatma AltınThermofisher ScientificP36930
QiashredderQIAGEN79656
Sıçan Kollajen ICultrex3443-100-01
Retinoik Asit All-TransMerck-Sigma AldrichR2625
RNA saflaştırma kitiQIAGEN74104
SDSMerck-Sigma AldrichL4509
Sodyum bikarbonat %5.6EurobioCXXBIC00-07
Sodyum PiruvatThermofisher Scientific11360
T75 Hücre + ŞişeSarstedt83-1813-302Hassas yapışkan hücreler için özel yüzey işlemeli (Hücre +) doku kültürü polistiren şişesi
TranswellCorning3460polyester gözenekli membran kültürü ekleri
Tripsin-EDTAMerck-Sigma AldrichT3924
Ultra Saf SuThermofisher Scientific10977-035
UridineMerck-Sigma AldrichU3750
VerseneThermofisher Scientific15040-033EDTA
YFV-FNVIP DakarAşı şişesi
CMC'ye istek üzerine Ca2 + -Mg2 + Thermofisher ile Bilimsel olmadan PBS

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  2. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  3. Iadecola, C. The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
  4. Bicker, J., Alves, G., Fortuna, A., Falcao, A. Blood-brain barrier models and their relevance for a successful development of CNS drug delivery systems: a review. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87 (3), 409-432 (2014).
  5. Banks, W. A. From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (4), 275-292 (2016).
  6. Montagne, A., et al. Brain imaging of neurovascular dysfunction in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 131 (5), 687-707 (2016).
  7. Stanimirovic, D., Kemmerich, K., Haqqani, A. S., Farrington, G. K. Engineering and pharmacology of blood-brain barrier-permeable bispecific antibodies. Advances in Pharmacology. 71, 301-335 (2014).
  8. Albrecht, D. S., Granziera, C., Hooker, J. M., Loggia, M. L. In Vivo Imaging of Human Neuroinflammation. ACS Chemical Neuroscience. 7 (4), 470-483 (2016).
  9. Caloni, F., et al. Alternative methods: 3Rs, research and regulatory aspects. ALTEX. 30 (3), 378-380 (2013).
  10. Whittall, H. Information on the 3Rs in animal research publications is crucial. The American Journal of Bioethics. 9 (12), 60-61 (2009).
  11. Sneddon, L. U. Pain in laboratory animals: A possible confounding factor. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (3), 161-164 (2017).
  12. Sneddon, L. U., Halsey, L. G., Bury, N. R. Considering aspects of the 3Rs principles within experimental animal biology. The Journal of Experimental Biology. 220, 3007-3016 (2017).
  13. Wells, D. J. Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research. Annals of the New York Academy of Sciences. 1245, 14-16 (2011).
  14. Daneshian, M., et al. A framework program for the teaching of alternative methods (replacement, reduction, refinement) to animal experimentation. ALTEX. 28 (4), 341-352 (2011).
  15. Niemi, S. M., Davies, G. F. Animal Research, the 3Rs, and the "Internet of Things": Opportunities and Oversight in International Pharmaceutical Development. ILAR Journal. 57 (2), 246-253 (2016).
  16. Modarres, H. P., et al. In vitro models and systems for evaluating the dynamics of drug delivery to the healthy and diseased brain. Journal of Controlled Release. 273, 108-130 (2018).
  17. Jamieson, J. J., Searson, P. C., Gerecht, S. Engineering the human blood-brain barrier in vitro. Journal of Biological Engineering. 11, 37(2017).
  18. Kaisar, M. A., et al. New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).
  19. Aday, S., Cecchelli, R., Hallier-Vanuxeem, D., Dehouck, M. P., Ferreira, L. Stem Cell-Based Human Blood-Brain Barrier Models for Drug Discovery and Delivery. Trends in Biotechnology. 34 (5), 382-393 (2016).
  20. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  21. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
  22. Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochemistry International. 54 (3-4), 253-263 (2009).
  23. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. Journal of Neuroscience Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
  24. Nakagawa, S., et al. Pericytes from brain microvessels strengthen the barrier integrity in primary cultures of rat brain endothelial cells. Cellular and Molecular Neurobiology. 27 (6), 687-694 (2007).
  25. Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).
  26. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16(2013).
  27. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  28. Andrews, P. W. Retinoic acid induces neuronal differentiation of a cloned human embryonal carcinoma cell line in vitro. Developmental Biology. 103 (2), 285-293 (1984).
  29. Lafon, M., et al. Modulation of HLA-G expression in human neural cells after neurotropic viral infections. Journal of Virology. 79 (24), 15226-15237 (2005).
  30. Janabi, N., Peudenier, S., Heron, B., Ng, K. H., Tardieu, M. Establishment of human microglial cell lines after transfection of primary cultures of embryonic microglial cells with the SV40 large T antigen. Neuroscience Letters. 195 (2), 105-108 (1995).
  31. von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
  32. Prehaud, C., Lafon, M., Ceccaldi, P. E., Afonso, P., Lafaye, P. New in vitro Blood-Brain Barrier model. PCT. EP2015, 0706671(2014).
  33. Holbrook, M. R., Li, L., Suderman, M. T., Wang, H., Barrett, A. D. The French neurotropic vaccine strain of yellow fever virus accumulates mutations slowly during passage in cell culture. Virus Research. 69 (1), 31-39 (2000).
  34. da Costa, A., et al. Innovative in cellulo method as an alternative to in vivo neurovirulence test for the characterization and quality control of human live Yellow Fever virus vaccines: A pilot study. Biologicals. 53, 19-29 (2018).
  35. Nanobodies suitable for neuron regeneration therapy. Patent. , EP3191510A1 (2014).
  36. Li, T., et al. Selection of similar single domain antibodies from two immune VHH libraries obtained from two alpacas by using different selection methods. Immunology Letters. 188, 89-95 (2017).
  37. Schumacher, D., Helma, J., Schneider, A. F. L., Leonhardt, H., Hackenberger, C. P. R. Nanobodies: Chemical Functionalization Strategies and Intracellular Applications. Angewandte Chemie International Edition. 57 (9), 2314-2333 (2018).
  38. Prehaud, C., Megret, F., Lafage, M., Lafon, M. Virus infection switches TLR-3-positive human neurons to become strong producers of beta interferon. J Journal of Virology. 79 (20), 12893-12904 (2005).
  39. Siflinger-Birnboim, A., et al. Molecular sieving characteristics of the cultured endothelial monolayer. Journal of Cellular Physiology. 132 (1), 111-117 (1987).
  40. High Mast2-affinity polypeptides and uses thereof. Patent. , EP20110306454 (2011).
  41. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).
  42. Beck, A. S., Wood, T. G., Widen, S. G., Thompson, J. K., Barrett, A. D. T. Analysis By Deep Sequencing of Discontinued Neurotropic Yellow Fever Vaccine Strains. Scientific Reports. 8 (1), 13408(2018).
  43. Staples, J. E., Monath, T. P. Yellow fever: 100 years of discovery. The Journal of the American Medical Association. 300 (8), 960-962 (2008).
  44. Wang, E., et al. Comparison of the genomes of the wild-type French viscerotropic strain of yellow fever virus with its vaccine derivative French neurotropic vaccine. Journal of General Virology. 76 (Pt 11), 2749-2755 (1995).
  45. Li, T., et al. Cell-penetrating anti-GFAP VHH and corresponding fluorescent fusion protein VHH-GFP spontaneously cross the blood-brain barrier and specifically recognize astrocytes: application to brain imaging. FASEB J. 26 (10), 3969-3979 (2012).
  46. Garcia-Mesa, Y., et al. Immortalization of primary microglia: a new platform to study HIV regulation in the central nervous system. Journal of NeuroVirology. 23 (1), 47-66 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kan Beyin Bariyeri Modelinsan KBB ModeliMini Beyin K lt rEndotelyal H cre Ge irgenli iLucifer Yellow Ta n mVir s Ge i TespitiNeurovita la Ta n mN ron Hedefli Biyomolek lSerebral Mikrovask ler Endotelyal H crelerPolyester Membran K lt r nserti

İlgili makaleler