Yerel Ca2 + sinyalleri membran hedefli Ca2 + göstergeleri tarafından kültürlü hücrelerdeki diseksiyon

Hiroko Bannai; Matsumi Hirose; Fumihiro Niwa; Katsuhiko Mikoshiba

doi:10.3791/59246

Yöntem makalesi

Yerel Ca^{2 +} sinyalleri membran hedefli Ca^{2 +} göstergeleri tarafından kültürlü hücrelerdeki diseksiyon

9.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/59246

⸱

22 Mart 2019

Hiroko Bannai¹^,² , Matsumi Hirose² , Fumihiro Niwa²^,³ , Katsuhiko Mikoshiba²

¹Japan Science and Technology Agency, PRESTO, ²Laboratory for Developmental Neurobiology, RIKEN Center for Brain Science, ³École Normale Supèrieure, Institut de Biologie de l'ENS (IBENS), Institut national de la santè et de la recherche mèdicale (INSERM), Centre national de la recherche scientifique (CNRS), École Normale Supèrieure, PSL Research University

Bu makalede

Özet

Burada bir iletişim kuralı için Ca^{2 +} sinyaller hücre altı çözünürlükte diseksiyon sağlayan Ca^{2 +} düşsel nöronlar ve gliyal hücreler, mevcut. Bu işleme genetik olarak kodlanmış Ca^{2 +} göstergeleri ifade izin tüm hücre tipleri için geçerlidir.

Özet

Kalsiyum iyon (Ca^{2 +}) birden çok sinyal yolları, çeşitli biyolojik çıkışlar için önde gelen sürücüler bir evrensel hücre içi haberci moleküldür. İki Ca^{2 +} sinyal kaynağı koordinasyonu — "Ca^{2 +} akını" dan hücre dışında ve "Ca^{2 +} sürümü" hücre içi Ca2 + endoplazmik retikulum (ER) — farklı spatio-temporal desenleri Ca'nın altında yatan kabul edilir birden çok biyolojik fonksiyonları hücrelerde neden ^{2 +} sinyalleri. Bu iletişim kuralının amacı "Ca^{2 +} akını" ve "yayın Ca^{2 +"} çok anda izleme sağlayan yeni bir Ca^{2 +} görüntüleme yöntemi tarif etmektir. OER-GCaMP6f ER dış membran için hedef GCaMP6f oluşan bir genetik olarak kodlanmış Ca^{2 +} (GECI) göstergesidir. OER-GCaMP6f Ca^{2 +} yayın geleneksel GCaMP6f daha yüksek zamansal çözünürlükte izleyebilirsiniz. Plazma zarı hedefli Turk ile birlikte, kendisinin zamansal Ca^{2 +} sinyal örneği hücre altı çözünürlükte tanımlanabilir. Burada açıklanan hücre altı hedefli Ca^{2 +} göstergeleri prensip olarak, tüm hücre türleri için kullanılabilir bile içinde vivo için Caenorhabditis elegans nöronlar Imaging. Bu iletişim kuralı ' Ca^{2 +} görüntüleme hücrelerde hücre satırlarından, sinir hücreleri ve Disosiye birincil kültürlerde gliyal hücreler tanıtmak ve sıçan kortikal nöronların donmuş stok hazırlanması açıklayın.

Giriş

CA^{2 +} sinyalleri intrasellüler Ca^{2 +} konsantrasyonunun yükselmesi temsil eder. CA^{2 +} ökaryotik hücreler için evrensel ikinci messenger'dır. CA^{2 +}kullanarak, hücreleri farklı hücre içi sinyal yolları çalışır ve çeşitli biyolojik çıkışlarını ikna etmek. Örneğin, nöronlar, sinaptik vezikül yayın presynaptic terminalinde içinde gen ekspresyonu çekirdeği ve postsynapse, sinaptik plastisite indüksiyon düzenlenir, tam olarak uygun etkinleştiren ayrı Ca^{2 +} sinyalleri tarafından aşağı akım enzimler doğru sitelerdeki ve hassas zamanlama¹.

Ca^{2 +} sinyallerin belirli kronolojik zamanmekansal desenleri belirli aşağı akım enzimleri aktif hale getirin. CA^{2 +} sinyalleri iki farklı Ca^{2 +} kaynakları arasında koordinasyon tarafından oluşturulur: Ca^{2 +} akını ekstrasellüler boşluk ve Ca^{2 +} sürümü bir intrasellüler Ca^{2 + hizmet veren endoplazmik retikulum (ER),}saklayın. Belirli hücre işlevi ikna etmek için anlamlı kronolojik zamanmekansal Ca^{2 +} sinyal desen Ca^{2 +} kanal plazma zarı veya ER membran²çevresinde oluşturulan 10-100 µM Ca^{2 +} nanodomains tarafından da desteklenir. Önemlisi, Ca^{2 +} sinyalleri aşağı akım biyolojik çıkış belirleyen en önemli faktörlerden biri kaynağıdır. Nöronlarda, Ca^{2 +} akını ve Ca^{2 +}yayın gama - aminobütirikasit (GABA)_A reseptörleri (GABA_AR) GABAergic sinapslar, kümeleme üzerinde ters etkileri inhibisyonu için sorumlu olduğu vardır nöronal uyarılabilirlik³. Tarafından büyük nöronal uyarma eşliğinde Ca^{2 +} akını sinaptik GABA_AR kümeleri dağılım neden olmaktadır, kalıcı Ca^{2 +} yayın ise acil servis sinaptik GABA_ARs kümeleme teşvik etmektedir. Diğer gruplar da büyüme koniler ayarlama yönünü eleştirel Ca^{2 +}sinyal kaynağında bağlı olduğunu bildirdin: Ca^{2 +} akını indükler itme, Ca^{2 +} yayın cazibe nöronal büyüme yol gösterir iken koni⁴. Bu nedenle, tamamen belirli hücresel çıkışlarını temel yolları sinyal Ca^{2 +} anlamak için Ca^{2 +} sinyaller hücre altı çözünürlükte açıklayarak Ca^{2 +} sinyal kaynağını tanımlamak önemlidir.

Bu protokol için Ca^{2 +} sinyalleri Ca^{2 +}sinyal kaynakları (şekil 1) tahmini sağlar hücre altı çözünürlükte bildirmek için bir Ca^{2 +} görüntüleme yöntemi açıklanmaktadır. CA^{2 +} microdomains plazma zarı altında başarıyla plazma zarı-yerelleştirme sinyal Lck Src içinde eki ile plazma zarı hedefleyen genetik olarak kodlanmış Ca^{2 +} göstergeleri (Turk) tarafından izlenir kinaz Turk⁵N termini için. Ca^{2 +} sinyal örneği bir daha iyi kayma ve zamansal çözünürlük acil civarında algılamak için biz son zamanlarda OER-GCaMP6f, GCaMP6f hangi⁶ hedefler acil servis dış membran içinde ER transmembran protein kullanılarak geliştirilmiş. OER-GCaMP6f hassas Ca^{2 +} ve Turk Difüzyon kaçınarak Ca^{2 +} çözünürlükte daha iyi kronolojik zamanmekansal COS-7 hücreleri⁷ ve HEK293 hücreleri⁸, geleneksel nontargeted GCaMP6f ER yayınlamasını bildirebilirsiniz . Biz de spontan Ca^{2 +} yükseklik OER-GCaMP6f tarafından bildirilen kültürlü Hipokampal astrocytes farklı bir kronolojik zamanmekansal desen gösterdi doğruladı plazma zarı hedefli GCaMP6f tarafından izlenen ile karşılaştırıldığında (Lck-GCaMP6f)⁷ ^,⁹OER-GCaMP6f ile Ca^{2 +} görüntülemede Lck-GCaMP6f ile birlikte Ca^{2 +} sinyalleri kaynaklarını tanımlamak için hücre altı çözünürlükte diseksiyon katkıda gösteren,.

Halen, protokol Ca^{2 +} sinyal diseksiyon HeLa hücreleri ve nöron-astrocyte cam coverslips üzerinde kaplama kültürler karışık için ayrıntı. Ca^{2 +} görüntüleme tekniği ile Turk burada, Lck-GCaMP6f, plazma membran hedeflenmiş RCaMP2¹⁰ (Lck-RCaMP2), belirtilen ve bu Turk belirtilebilir tüm hücrelere OER-GCaMP6f (şekil 1) tabidir.

Protokol

Burada açıklanan tüm deneylerin eğitim, kültür, spor, bilim ve teknoloji Japonca Bakanlıkça verilen kılavuz göre RIKEN Emanet Komitesi ve hayvan deney Komitesi tarafından kabul edildi.

1. hücre hazırlanması

Poli (ethyleneimine) hazırlanması-kaplı coverslips
Not: Nöronlar ve astrocytes gelişimini engelleyen olmadan coverslips için sıkı bir şekilde takmak için izin verdiği Poly(ethyleneimine) (PEI) kaplama cam cihazları için önerilir. Ancak, diğer kaplama yöntemleri (örneğin, Poli-Ornitin, Poli L-lizin, kaplama laminin), gerekirse, cam-alt yemekleri mevcuttur.
1. Bir 18 mm çaplı cam coverslip 12-şey plaka her kuyuya yerleştirin. Steril su kullanarak %0,04 PEI solüsyonu (12,5 mL/12-iyi plaka) hazırlayın.
2. Her şey için 1 mL %0,04 PEI çözeltisi ekleyin. Coverslips altında hava kabarcığı yok olduğundan emin olun.
3. Tabaklar CO₂ kuluçka gecede 37 ° C'de kuluçkaya
4. Ertesi gün, kaplamalı coverslips 3 yıkama x 1 mL steril su ile. Bir aspiratör PEI Çözümle kaldırmak, her şey için 1 mL steril su ekleyin ve böylece PEI çözüm coverslip ve plaka arasında iyice yıkanabilir 12-şey plaka sallamak. Kalan PEI hücreler için toksik olduğu gibi son yıkama tamamen emişli sonra bu su emin olun.
5. Kuru ve coverslips ultraviyole (UV) en az 15 dakikadır ışık ile örtünün içinde sterilize. PEI kaplı yemek 4 ° C'de 2 aya kadar saklanabilir. Yemekleri UV ışık kullanmadan sadece 15 dakika ile aydınlatmak.
6. 5 mL steril distile su buharlaşma kültür ortamının önlemek için kuyu arasında boşluk ekleyin.
Kaplama hücre hatları
Not: Bu protokolü transfection HeLa hücreleri ve COS-7 hücreleri gibi memeli hücre satırlarından hücreye için sadece bir örnek sağlar. Kullanıcılar kendi deneyleri için optimize edilmiş diğer transfection iletişim kuralları uygulayabilirsiniz. Bu bölümde, biz de COS-7 hücrelere uygulanabilir HeLa hücre kültür Protokolü anlatacağız.
1. % 70-%90 izdiham elde onlar kadar transfection önce günde 10 cm kültür çanak hücrelerde kültür.
2. Kültür orta prewarm ( Tablo malzemelerigörmek) ile 37 ° c
3. Hücreler 2 yıkama x fosfat tamponlu tuz olmadan Ca^{2 +} ve Mg^{2 +} (PBS [-]) ile.
4. PBS(-) Aspire edin, 1 mL % 0.5 tripsin-ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) çözeltisi ekleyin ve 90 37 ° C'de hücreler kuluçkaya yuvarlak bir şekil elde onlar kadar s.
5. Prewarmed kültür trypsinization durdurmak için orta 9 mL ekleyin. Kültür orta 1:6 oranında hücrelerle sulandırmak.
6. Tohum PEI kaplı coverslips 12-şey tabak içinde seyreltilmiş hücrelerin 1 mL.
Hipokampal nöron-astrocyte karışık kültür fareler veya fareler hazırlanması
Not: Bölümler 1.3 ve 1.4 ilk gözden geçirilmesi gerekir ve bir hayvan Kurulusları ve kullanmak Komitesi tarafından onaylanmış ve bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı için resmen onaylanmış yordamlar izlemeniz gerekir. Nöronal kültür iletişim kuralının akış şeması Şekil 2' de gösterilmiştir.
1. Laminar akış başlık altında tüm reaktifler hazırlayın. Yer Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal orta (DMEM) içine iki 100 mm bir buz kutusunda bulunuyor yemekleri (yaklaşık 20 mL/çanak) kültür.
2. Diseksiyon orta DMEM ve 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES) oluşan 50 mL hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek) ve Orta üç 60 mm kültür yemekleri (yaklaşık 7 mL/tabak) ve sekiz 35 mm dağıtmak Kültür yemekleri (yaklaşık 2 mL/çanak). Bulaşıkları başka bir buzdolabına koyun.
3. Kuluçka salin, Hanks dengeli tuz solüsyonu ile 20 mM ( Tablo malzemelerigörmek) HEPES, takıma oluşan 50 mL hazırlamak ve 8 mL serum 15 mL konik tüp buz üzerinde yerleştirin.
4. B-27, glutamin ve penisilin-streptomisin ile (bkz. Tablo reçetesi) takıma kaplama orta minimum temel orta (MEM) ile hazırlayın. Bu orta oda sıcaklığında (20-28 ° C) korumak.
5. % 70 etanol ile cerrahi aletler sterilize.
6. Bir kağıt havlu kapaklı ve 1 mL isoflurane bir cam kavanoza yerleştirin. 1 dk. için buharlaşır isoflurane izin.
7. A gebe iri fare ya da bir fare adım 1.3.6 göre hazırlanmış kavanoz yerleştirin ve derin anestezi kadar hayvan kavanozda saklıyorum (yaklaşık 30 s 1 dk).
8. İmzalat hayvan kavanozdan almak ve dezenfekte belgili tanımlık hayvan ve diseksiyon ekipman % 70 etanol ile püskürtülerek. Ventral orta hat standart diseksiyon makası ve cımbız ile kesme ve rahim gebe iri fare veya fare ayıklamak.
9. E18-19 embriyo imzalat dişi sıçan veya fare, hassas diseksiyon makası kullanarak rahim hulâsa ve ayıklanan embriyo halka Forseps ile 10 cm tabak soğuk anestezi için buz gibi DMEM içine yer.
10. Embriyo ince diseksiyon makası ile başını kesmek ve 10 cm tabak içinde buz gibi DMEM baş yer.
11. Her embriyo 13 cm ile beyin ayıklamak Semken forseps ve forseps iyi ipuçları ile kavisli. 60 mm tabak içinde buz gibi diseksiyon orta beyni.
12. İyi ipuçları, buz gibi diseksiyon orta 35 mm yemekler ile iki forseps kullanarak hippocampi, kaldırmak ve kuluçka serum 15 mL konik tüp buz üzerinde yerleştirilen izole dokusunda korumak.
13. Hippocampi kuluçka salin ile yıkama ve kuluçkaya tripsin (1.25 mg/mL) ve Dnaz ile ben (0.25 mg/mL) olarak 37 ° C'de 5 min için kuluçka serum Kuluçka tuz, 150 µL hisse senedi tripsin x 20 ve 20 x stokunun Dnaz 150 µL 2.7 mL önerilen kuluçka birimdir ( Tablo malzemelerigörmek).
14. 3 hippocampi yıkama x buz gibi kuluçka salin ile.
15. Kuluçka salin Aspire edin ve Dnaz içeren kaplama orta 1 mL ekleyin ben (hisse senedi çözüm 10 µL; bkz: Malzemeler tablo). Doku pipetting çok 20 x tarafından askıya alma ve bir hücre sayaç ve Trypan mavi tahlil kullanarak hücrelerin, yoğunluğunu ölçmek.
16. 1.4 x 10⁵ canlı hücre/mL için rats ve 2.5 x 10⁵ canlı hücre/mL fareler için bir yoğunluk Hipokampal hücrelere sulandırmak. Seyreltilmiş hücre süspansiyonlar 12-şey kültür plakaları PEI kaplı coverslips üzerine 1 mL tohum.
17. Hücreleri bir CO2 İnkübatör yapılan 37 ° C'de 2-3 gün için korumak.
18. Kaplama orta kaldırın. Hücreleri kurumasına izin vermeyin. Yavaşça ve hızlı bir şekilde prewarmed bakım orta ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek).
Sıçan kortikal nöron-astrocyte karışık kültür ve donmuş hücreleri ve donmuş kültürler canlanma hazırlanması
Not: Bir dondurma yöntemi kortikal hücreler için açıklanan previously11 idi. Burada, hangi kortikal hücrelerinin-80 ° C'de en az 3 ay süreyle saklanabilir değiştirilmiş bir protokol sağlanır. Bu iletişim kuralının akış şeması Şekil 2' de gösterilmiştir.
1. DMEM, diseksiyon orta, kuluçka serum ve adımları 1.3.1–1.3.4 ve Malzemeler tablobelirtildiği gibi kaplama orta hazırlayın.
2. DMEM, ısı inaktive fetal sığır serum ve penisilin-streptomisin (bkz. Tablo reçetesi) oluşturdu yıkama orta hazırlamak, gerekirse.
3. E18-19 embriyo imzalat dişi sıçan veya fare, hassas diseksiyon makası, kullanılarak rahim hulâsa ve halka forseps soğuk anestezi için buz gibi DMEM içine ayıklanan her embriyo eklemenizi sağlar.
4. Beyin embriyo kaldır ve buz gibi diseksiyon ortamda saklayın. Başparmaklarınız kaldırmak ve onları kuluçka serum 15 mL konik tüp buz üzerinde yerleştirilen korumak.
5. Kuluçka salin ile başparmaklarınız yıkama ve tripsin (1.25 mg/mL) ve Dnaz başparmaklarınız kuluçkaya kuluçka salin 37 ° C'de 5 dakika içinde ben (0.25 mg/mL) Kuluçka salin, 20 hisse senedi tripsin x 300 µL ve 20 x stokunun Dnaz 300 µL 5.4 mL önerilen kuluçka birimdir 12 başparmaklarınız için ben.
6. 3 başparmaklarınız yıkama x buz gibi kuluçka salin ile.
7. Süpernatant kaldırın ve kaplama orta 2 mL takıma Dnaz 150 µL ile ben stok ekleyin. 20'den az vuruş pipetting tarafından hücreleri ayırmak ve 70 µm gözenek boyutu ile bir hücre süzgeç kullanarak hücreleri filtre.
8. Kaplama için hücre süzgeç kaplama orta 20 mL ile yıkayın. Donmuş hücre stok hazırlanması için yıkama orta 20 mL hücrelerle yıkayın ( Tablo malzemelerigörmek)
9. Bir hücre sayaç ve Trypan mavi yöntemi kullanarak hücrelerin, yoğunluğunu ölçmek.
10. 1.4 x 10⁵ canlı hücre/mL ile kaplama Orta yoğunluk kortikal hücrelere sulandırmak ve PEI kaplı coverslips 12-şey kültür tabak içinde seyreltilmiş hücre süspansiyon 1 mL ekleyin.
11. 2-3 gün için bir CO₂ kuluçka 37 ° C'de hücreleri korumak ve kültür orta bakım Orta olarak değiştirin.
12. 1.4.9 adımdan sonra 187 x g 3 dk, bir salıncak rotor kullanarak hücreleri centrifuging tarafından dondurulmuş kortikal hücre hisse senedi hazırlayın.
13. Süpernatant Aspire edin ve dondurma orta ( Tablo malzemelerigörmek) 4 ° C'de 1 x 10⁷ hücre/mL hücre yoğunluğu elde etmek için sürekli ekleyin. Kriyojenik tüpler içine hücre süspansiyon aliquot 1 mL.
14. Tüpler-80 ° C sıcaklık değerine ulaşılana kadar konteyner-1 ° C/dak, buz gibi bir fiyata sahip buz gibi bir hücreye yerleştirin ve-80 ° C dondurucu dondurucu konteyner aktarın. Hücreleri en az 3 ay-80 ° C'de depolanan
15. Donmuş hücreleri yeniden canlandırmak için bu yıkama orta (yaklaşık 13 mL her kriyojenik tüpü) ve bakım orta ( Tablo malzemelerigörmek) dondurulmuş kortikal hücreler için prewarm.
16. Donmuş hücreleri hızla 37 ° C'de bir su banyosu içinde çözülme.
17. Prewarmed yıkama orta çözdürülen hücrelerle yavaşça sulandırmak. 187 x g 3 dk, bir salıncak rotor kullanarak hücreleri santrifüj kapasitesi.
18. Pelet yıkama orta 1 mL askıya alma ve uygun hücre yoğunluğu ölçün.
19. Bakım orta 3.0 x 10⁵ canlı hücre/mL ve tohum 1 mL PEI kaplı 12-şey plakaları hücre süspansiyon hücre yoğunluğu vermeye donmuş kortikal hücreler için hücrelerle sulandırmak.

2. membran hedefli Turk ifadesidir

Transfection hücre
1. 250 eklemek GECI plazmid (yani, Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 veya OER-GCaMP6f CMV organizatörü ile) ng^7,8,9 düşük serum orta 100 µL için (bkz. Tablo reçetesi) iyi başına. Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f, düşük serum orta her iyi 100 µL her plazmid kullanım 250 ng cotransfection için.
2. Transfection reaktif 0.5 µL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) serum plazmid azaltılmış orta karışımı kuyuya başına. Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f cotransfection için transfection reaktif iyi başına 0.5 µL ekleyin.
3. Karışımı 30 dk, oda sıcaklığında (20-28 ° C) için kuluçkaya.
4. 100 µL karışımı her coverslip için drop-wise bir şekilde ekleyin.
5. 48-72 h CO₂ kuluçka 37 ° C'de Turk ifade izin vermek için hücreleri kuluçkaya.
Transfection ve Hipokampal veya kortikal nöronların adeno ilişkili virüs enfeksiyonu
Not: Transfection (DIV) 3-5 gün tüp bebek için daha yüksek bir transfection oranı nöronlar için sonuçlanır. Transfection 6-8 DIV, astrocytes Turk en iyi ifade için tercih edilir. İfadesi Turk için Disosiye kültür nöronlar içinde 9 DIV sonra adeno ilişkili virüs (AAV) vektörel çizimler enfeksiyon daha iyi ifade etkinlik sağlar. AAV vektörler Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f Organizatör hazırlanan daha önce açıklandığı gibi EF1a altında bir ifade için HEK293 kullanarak hücreleri¹² ( Tablo malzemelerigörmek).
1. Transfection 3-8 gün sonra kaplama için etiket iki tüpleri, plazmid DNA diğeri transfection reaktif bir tane.
2. İndirimli serum orta 50 µL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) her tüpün kuyuya başına.
3. Plazmid DNA coverslip başına 0,5 µg ve transfection reaktifi ( Tablo malzemelerigörmek) nöronlar için eşlik ek 1 µL iyi plazmid DNA tüp için ekleyin. Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f cotransfection için her plazmid 0,5 µg ve ek 1 µL düşük serum orta iyi başına 50 µL karıştırılır.
4. Transfection reaktif 1 µL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) transfection reaktif tüp bir kuyu başına. Transfection reaktif aynı miktarda cotransfection için kullanılır.
5. Girdap her iki için 1-2 s tüpleri.
6. Transfection reaktif karışım (Adım 2.2.4) (Kimden adım 2.2.3) DNA karışıma ekleyin. Yavaşça pipetting tarafından mix ve karışımı (coverslip başına 100 µL) oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
7. Hücreleri üzerine bu karışım drop-wise bir şekilde yükleyin.
8. Hücreleri bir CO₂ kuluçka 2-3 gün için işaretleyici proteinler ifade edilir kadar kuluçkaya.
9. AAV enfeksiyon için karışık nöron-astrocyte kültür AAV 3 µL iyi başına ekleyin. Çanak rock yaparak karışımı yavaşça. Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f Çift Kişilik enfeksiyon için her AAV 3 µL iyi kullanılmaya başlandı. Turk ifade hücre sayıları yetersiz olduğu durumlarda enfeksiyon için en uygun AAV tutarı tespit edilmelidir.
10. Kültür için 1 – 2 hafta Turk ifade edilir kadar korumak.

3. Ca^{2 +} görüntüleme

Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f ifade hücre aynı anda görüntüleme
Not: İçin aynı anda kayıt Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f sinyalleri, optik görüntü-yarma gerekmektedir. Optik RCaMP2 ve GCaMP6f ayrılması ve aynı fotoğraf çerçevesi üzerine kendi projeksiyon makinesi (şekil 3A) etkinleştirin. Ayrıca aynı anda görüntüleme gerektirir aynı anda uyarma mavi (450 – 490 nm) ışık yayarlar olabilir (1) ışık kaynakları ve yeşil (500-560 nm) spectra, (2) çift bantlı filtre ve dikroik ayna setleri mikroskobu ve (3) emisyon RCaMP2 için filtreler ve GCaMP6f. Ayrıntılar için Tablo malzemeleriçin bakın.
1. Görüntüleme aygıtları ve bilgisayarları en az 30 dk önce kayıt açın. Odası 37 ° C'ye ısınma mikroskop prewarm Görüntü bölme aygıtı, filtreler ve ışık kaynağı ayarlayın. Aynı görüş alanı fotoğraf makinesi üzerinde görünecek şekilde görüntü bölme optik hizalayın. Uygun objektif lens seçin (bkz. Tablo malzeme).
2. Mount hücreleri içeren coverslip Lck-RCaMP2 ile transfected ve OER-GCaMP6f kayıt odasında uygun görüntüleme orta veya arabellek (18 mm coverslips için 400 µL) odasında ekleyin ve mikroskop sahnesinde yerini. Bir kapak orta buharlaşma önlemek için kayıt odası yerleştirin.
3. Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f tarafından floresan görüntüleme ifade hücreleri bulun. Photobleaching ve fototoksisite önlemek için uyarma ışık yoğunluğunu en aza indirmek.
4. Kapağı çıkarın ve 10 Hz değerinde hızlandırılmış bir kaydını başlat seçimini yapın. Bu kayıt sırasında Ca^{2 +} yanıt (örneğin, histamin HeLa hücreleri, COS-7 hücreler için ATP için) uyandırmak için odasına agonist ekleyin.
5. Hızlandırılmış verileri sabit disk sürücüsü (HDD) kaydedin.
6. Görüntü analiz yazılımı kullanarak veri analiz.
Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f ifade astrocytes spontan faaliyetleri kayıt
Not: Optik görüntü-yarma, Ca^{2 +} sinyalleri plazma zarı ve acil servis çevrenizdekileri aynı hücrede izlenebilir. Burada, Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f sıralı kayıt aynı astrocytes içinde açıklanmıştır. Bir petrol-daldırma hedef 1.3 büyük bir sayısal diyafram ile spontan Ca^{2 +} etkinlik için önerilir.
1. Mikroskobunun açmak, kamera, ışık kaynağı ve mikroskop Isıtma en az 30 dk önce kayıt odası.
2. Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f kayıt odasında transfected hücreleri içeren coverslip dağ ve görüntüleme orta 400 µL ekleyin. Bir kapak odası üstüne yerleştirin.
3. GCaMP6f ve ışık kaynağı için filtre seçin (mavi uyarma ışık, örneğin 470– 490 nm; bkz: Malzemeler tablo). OER-GCaMP6f ifade astrocytes bulun.
4. Bir filtre kümesi ve ışık kaynağı RCaMP2 için seçin (yeşil uyarma ışık, örneğin, 510-560 nm; Tablo reçetesibakın) ve Lck-RCaMP2 aynı astrocytes ifade olup olmadığını doğrulayın. Photobleaching önlemek için ışık kaynağı uzun maruz kaçının.
5. Lck-RCaMP2 2 Hz değerinde kayıt hızlandırılmış görüntüleri 2 dakika süreyle HDD üzerinde görüntüleme verileri kaydetmek.
6. Buna GCaMP6f için ayarla filtresini değiştirin. OER-GCaMP6f aynı görüş alanı, 2 dakika süreyle 2 Hz değerinde kayıt hızlandırılmış görüntülerini HDD üzerinde verileri kaydetmek.
7. Görüntü analiz yazılımı kullanarak veri analiz.
Nöronlarda kayıt spontan nöronal aktivite ve indüklenen Ca^{2 +} yükseklik
Not: Nöronal görüntüleme için mikroskop Kur 3.2 bölümünde açıklanan aynıdır. Burada, spontan Ca^{2 +} yükselmesi nedeniyle Lck-GCaMP6f ve mGluR etkinleştirmesi nedeniyle OER-GCaMP6f tarafından indüklenen Ca^{2 +} yükseklik görüntüleme açıklanmıştır.
1. Spontan nöronal etkinliklerini kaydetmek için Lck-GCaMP6f kayıt odasında ifade hücreleri içeren coverslip dağ ve orta görüntüleme 400 µL ekleyin. Bir kapak odası üstüne yerleştirin.
2. Filtre ve ışık kaynağı (mavi uyarma, örneğin 470-790 nm; bkz: Malzemeler tablo) o GCaMP6f için ayarlayın. LCK-GCaMP6f ifade ve spontan aktivite gösteren nöronlar bulmak.
3. Görüntüleri 2 Hz veya daha hızlı elde etmek. HDD üzerinde verileri kaydetmek.
4. Görüntü analiz yazılımı kullanarak veri analiz.
5. İndüklenen Ca^{2 +} yükseklik kaydetmek için OER-GCaMP6f 400 ile ifade hücreleri içeren coverslips monte orta Imaging µL. Bir kapak odası üstüne yerleştirin.
6. GCaMP6f için ayarla filtresini kullanarak, OER-GCaMP6f ifade nöronlar bulmak.
7. Kapağı kaldırın. 2 Hz veya daha hızlı hızlandırılmış kaydetmeye başlamak. Kayıt sırasında Gq protein birleştiğinde reseptör agonistleri ekleyin (örneğin, mGluR5 agonist [RS] - 3,5 - dihydroxyphenylglycine [DHPG]) acil servis Ca^{2 +} yayınlamasını uyandırmak için.
8. HDD üzerinde hızlandırılmış görüntüleri kaydetmek ve verileri analiz.

Sonuçlar

LCK-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f HeLa hücreleri ifade edildi ve her iki sinyali aynı anda görüntü bölme optik, transfection (şekil 3A ve Video 1) sonra 24 saat kullanılarak kaydedildi. Görüntüleri, hangi Ca^{2 +} ER yayınlamasını neden olmaktadır, kayıt sırasında eklendi 10 Hz. histamin (onun 1 µM), elde. Onun başvuru üzerine, Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f sinyal yoğunluğunu, ilk floresan yoğunluğu (şekil 3B) değişiklik gösterir ΔF/F0 yalancı görünümünü tarafından gösterildiği gibi arttı. LCK-RCaMP2 da OER-GCaMP6f tarafından bildirilen zaman derslerin Ca^{2 +} Yükseklik (ΔF/F0) faiz (ROI) (şekil 3 c) aynı bölgede karşılaştırıldı. ΔF/F0 değerleri farklı ifade düzeyleri ve dağıtımları var iki farklı Turk arasında saat ders karşılaştırma etkinleştirmek için en yüksek değerlerine normalleştirilmiş. Her iki sensörler bir salınım benzeri Ca^{2 +} ayrıcalık bildirdi. LCK-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f beş hücre tipleri arasında iki hücre aynı zamanlı Kurs Ca^{2 +} yükselme gösterdi (şekil 3 c, yatırım Getirisi 1 ve 3) inceledi. Ancak, Lck-RCaMP2 tarafından gösterilen Ca^{2 +} yükselmeler OER-GCaMP6f (şekil 3 C, 2, 4 ve 5 yatırım Getirisi) tarafından gösterilen kıyasla daha yüksek düzeyde kaldı. Daha önce onun stimülasyon tarafından indüklenen bu Ca^{2 +} sinyal kaynağı olan ER sonlandırılmadan iken Ca^{2 +} yükseklik plazma zarı çevresinde, uzun sonuçlar gösterir.

Başparmaklarınız (şekil 4B) Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f (şekil 4, Video 2, Video 3 tarafından gösterildi ve spontan Ca^{2 +} astrocytes sıçan hippocampi (şekil 4A) kültüründen karışık nöron astrocyte gelen sinyalleri , Video 4ve Video 5). Kortikal kültürler bu protokol için açıklandığı gibi hazırlanan donmuş stoktan canlandırdı. LCK-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f sinyalleri sırayla aynı hücrelerden 2 Hz'de kaydedildi. Üç ROIs Ca^{2 +} yükselme gösterdi bölgede her GECI tarafından seçildi ve zaman ΔF/F_temel (yani, floresan yoğunluğu) ortalama Floresans yoğunluğu tüm kayıt döneminde (F_{temel değiştirdi}). Temel Floresans kararlı ve Ca^{2 +} yükselmeler daha seyrek, F_temel Ca^{2 +} yükseklik olayları algılamak için bir yararlı temel olur. Spontan Ca^{2 +} çizimleri astrositik açışında, hücre gövdesi de değil görünür. Bu sonuç astrositik spontan Ca^{2 +} sinyalleri diğer Turk görüntülenmeyecektir tüp bebek¹³ ve içinde vivo¹⁴tarafından önceki raporlarda ile tutarlıdır. Hipokampal ve kortikal astrocytes içinde Lck-RCaMP2 (üst) tarafından gösterilen Ca^{2 +} yükselmeler daha sık sık--dan o OER-GCaMP6f tarafından gösterilen. Bu sonuç Ca^{2 +} yükselmeler nedeniyle Lck-GCaMP6f astrocytes, daha sık bu OER-GCaMP6f⁷ nedeniyle daha tespit edildi bizim önceki gösteri ile tutarlı olacak ve bu kavramı da tarihinde geçerli olduğunu göstermektedir tek hücre düzeyi.

Spontan Ca^{2 +} yükselmeler Lck-GCaMP6f tarafından olgunlaşmamış sıçan Hipokampal nöronlar (10 DIV) içinde 2 Hz (şekil 5A ve Video 6)'de görüldü. ΔF/F0 beş farklı ROIs içinde zaman içerisinde bu Ca^{2 +} yükselmeler yerel olarak hücre altı etki alanlarıyla sınırlı öneririz. Şekil 5B (Video 7) OER-GCaMP6f-ifade AAV vektörleri ile enfekte Ca^{2 +} yanıtları olgun fare Hipokampal nöronlar (30 DIV) gösterir. Nöronlar 100 µM Ca^{2 +} yayın inducing agonist metabotropic Glutamat reseptörlerinin için olan DHPG ile teşvik. DHPG kaynaklı Ca^{2 +} yayın OER-GCaMP6f nedeniyle tespit edildi.

figure-results-1
Şekil 1: membran hedefli Turk gösteren diyagram. Plazma zarı hedefli Turk (Lck-GCaMP6f ve Lck-RCaMP2) ve dış ER şematik diyagramı membran hedefli GCaMP6f (OER-GCaMP6f).

figure-results-2
Şekil 2: akış Hipokampal ve kortikal hücre hazırlık, plazmid transfection ve AAV enfeksiyon için. Mikroskobik görüntü temsilcisi, taze kaplama DIV-6 kortikal hücreleri (solda) ve dondurulmuş stok (sağda) hücrelerden canlandırdı. Ölçek çubuğu 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 3: eşzamanlı görüntüleme Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f HeLa hücreleri içinde örneği. (A)optik görüntü bölme ile sinyal ayrılık şematik gösterimi. Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f aynı görüş alanı aynı anda kamerayı öngörülmektedir. 10 Hz de CMOS kamera tarafından alınan bir temsilcisi kayıt Video 1' de sağlanan ve bir çerçeve bu kayıt Masası'nda A (doğru) gösterilir. (B) ΔF/F0 Lck-GCaMP2 (üst) ve OER-GCaMP6f (alt) için sözde renk görüntüler. Histamin (onun 1 µM) 0 s. (C) temsilcisi Lck-GCaMP2 (macenta) ve OER-GCaMP6f (yeşil) normalleştirilmiş ΔF/F0 saat ders eklendi. Veri her arsa için en yüksek ΔF/F0 değerine normalleştirilmiş. Gri çubuklar başvurusunu zamanlamasını gösterir. Veri bir ısmarlama yazılım TI tezgah¹⁵ile analiz edildi. Ölçek çubuğu 50 µm (mikroskobik görüntü) =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-4
Şekil 4: Spontan Ca^{2 +} yükseklik Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f ifade için izlenen astrocytes. Hipokampal temsilcisi(a)ve (B) kortikal astrocytes Lck-RCaMP2 (üst) ve OER-GCaMP6f (alt) ile transfected. Kortikal hücreleri donmuş hisse senedi kültürler canlandırdı. LCK-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f görüntüleri sırayla aynı hücrede, 2 Hz değerinde, bir EM-CCD kamera ile elde. ΔF/Fbase zaman içerisinde ROIs içinde ölçülen sol gösteri araziler mikroskobik görüntü belirtti. Veri TI tezgah ile analiz edildi. Gerçek filmler Video 2, Video 3, Video 4ve Video 5temin edilmektedir. Ölçek çubuğu 20 µm (mikroskobik görüntü) =. Satır taban çizgisi kayması genel Ca^{2 +} düzeyde hücre değişiklikleri öneriyor. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-5
Şekil 5: Ca^{2 +} nöronlar Lck-GCaMP6f ve OER-GCaMP6f ile görüntülemede örnekleri. (A)temsilcisi sıçan Hipokampal nöronlar LCK-GCaMP6f DIV 10 (solda) ve ΔF/F0 ROIs (sarı daireler) ölçülen derslerin belirtilmiş saatte resimde (sağda) gösterilen araziler ifade. Zaman ders sayıları görüntü ROI Sayılarda karşılık gelir. Ca^{2 +} yükseklik zamansal desen ilgi çeşitli bölgeler arasında farklı olduğuna dikkat edin. Satır taban çizgisi kayması bu nöron küresel Ca^{2 +} düzeyinde artış göstermektedir. (B) bir örnek (solda) OER-GCaMP6f ifade AAV vektörleri ile enfekte olgun fare Hipokampal nöronların (DIV 30). ΔF/F0 ölçülen sahası arsa Ca^{2 +} yanıt-e doğru 100 µM gösterir zaman gri çubuğu tarafından gösterilen zamanlama, (RS) - 3,5 - dihydroxyphenylglycine (DHPG) uygulanır. Sarı Daire nerede zaman ders alındı ROIs konumunu göster. Görüntüleri 2 Hz de soğutmalı-CCD kamera (Masası'nda)veya bir EM-CCD kamera (Masası B) ile satın aldı ve TI tezgah ile analiz. Ölçek çubuğu 20 µm (mikroskobik görüntü) =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-6
Video 1: örnek Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f HeLa hücreleri içinde aynı anda görüntüleme. Temsilci kayıt 10 Hz'de satın almış ve şekil 3' te sundu. Ölçek çubuğu 50 µm =. Bu videoyu indirmek için buraya tıklayınız.

figure-results-7
Video 2: Spontan Ca^{2 +} geçici Lck-RCaMP2 içinde gözlenen Hipokampal astrocyte. 2 Hz (şekil 4A), alınan temsilcisi kayıt kaydedilen Video 3olarak görüş aynı alan içinde. Ölçek çubuğu 20 µm. = Bu videoyu indirmek için buraya tıklayınız.

figure-results-8
Video 3: Spontan Ca^{2 +} geçici OER-GCaMP6f içinde gözlenen bir Hipokampal astrocyte. 2 Hz (şekil 4A), Video 2olarak görüş aynı alanı elde temsilcisi kayıt. Ölçek çubuğu 20 µm. = Bu videoyu indirmek için buraya tıklayınız.

figure-results-9
Video 4: Spontan Ca^{2 +} geçici Lck-RCaMP2 içinde bir kortikal astrocyte gözlenen temsilcisi kayıt 2 Hz (şekil 4B), alınan kaydedilen Video 5olarak görüş aynı alan içinde. Ölçek çubuğu 20 µm. = Bu videoyu indirmek için buraya tıklayınız.

figure-results-10
Video 5: Spontan Ca^{2 +} geçici OER-GCaMP6f içinde gözlenen bir kortikal astrocyte. 2 Hz (şekil 4B), Video 4olarak görüş aynı alanı elde temsilcisi kayıt. Ölçek çubuğu 20 µm. = Bu videoyu indirmek için buraya tıklayınız.

figure-results-11
Video 6: Ca^{2 +} Lck-GCaMP6f tarafından bir sıçan Hipokampal nöron (sayı 10) görüntülemede örneği. Nöronal Ca^{2 +} örnek sinyalleri kaydedilen 2 Hz (şekil 5A). Ölçek çubuğu 20 µm. = Bu videoyu indirmek için buraya tıklayınız.

figure-results-12
Video 7: Ca^{2 +} sürümde OER-GCaMP6f ifade bir fare Hipokampal nöron (DIV 30). Nöronal Ca^{2 +} sinyalleri örneği OER-GCaMP6f ifade AAV vektörler (şekil 5B) ile enfekte bir fare Hipokampal nöron kaydedildi. Nöron 30'uygulanan 100 µM dihydroxyphenylglycine (DHPG) ile uyarılmış Ca^{2 +} ER yayınlamasını uyandırmak için s. Ölçek çubuğu 20 µm. = Bu videoyu indirmek için buraya tıklayınız.

Tartışma

Farklı biyolojik çıkışlarını Ca^{2 +} sinyalleri tarafından başlatılır. CA^{2 +} çok yönlü bir hücre içi sinyal messenger'dır. Belirli çıkışlarını uyandırmak için Ca^{2 +} sinyalleri şifresini çözmek bir temel biyolojik soru olmuştur ve Ca^{2 +} sinyalleri çeşitliliği açıklamak için Ca^{2 +} görüntüleme teknikleri gereklidir. Şu anda detaylı Protokolü ayrı Ca^{2 +}sinyalleri plazma zarı ve ER (şekil 3 ve şekil 4) ve yerel Ca^{2 +} microdomains (şekil 4 ve şekil 5) hücre içinde algılanmasını sağlar. Bu hücre içi Ca^{2 +} sinyalleri çeşitliliği açıklayan için katkıda bulunur. Ca^{2 +} zamansal çözünürlük sinyallerini ayrıca geliştirilmiş Turk plazma zarı ve ER Ca^{2 +} ve Turk kendilerini üç boyutlu bir Difüzyon etkisini önleyebilirsiniz ve tespit potansiyeline sahiptir çünkü hedefleyerek Ca^{2 +} akını veya membran üzerinde oluşan Ca^{2 +} açıklaması, çok anda.

Protokol bazı sınırlamalar vardır. Kullanıcılar algılanan sinyalleri "Ca^{2 +} akın ya da serbest bırakmak an" toplamı olduğunu göz önünde tutmalı ve "Ca^{2 +} dışarı orijinal Ca^{2 +} kaynaktan, büyük Ca^{2 +} sinyalleri için özellikle yayılmış". Örneğin, her ne kadar onun stimülasyon HeLa hücrelerin çağrıştıran Ca^{2 +} serbest üzerinden ER, onun sonuç Ca^{2 +} sinyalleri sadece ER hedefli OER-GCaMP6f tarafından aynı zamanda plazma membran hedeflenmiş Lck-RCaMP2 (şekil 3) tarafından algılanır. Ca^{2 +} sinyalleri kronolojik zamanmekansal desen Ca^{2 +} sinyal çıktısını tek belirleyici olabilir başka bir kısıtlamadır. Aşağı akım efektör proteinler dağılımı (gibi Ca^{2 +}-bağımlı kinaz ve fosfatazlar) bir belirleyici faktör²de kullanabilirsiniz. Tamamen intrasellüler Ca^{2 +} sinyalleri şifresini çözmek için bu protokol için kapsamına girmeyen, akış aşağı enzim davranış analizi kesinlikle gereklidir.

Başarılı Ca^{2 +} görüntüleme için en önemli unsurlarından biri görüntüleme ayarı ve görüntü edinme koşulları, de diğer canlı görüntüleme çalışmaları gelince. Biz daha önce Ca^{2 +} hücre yanıtlarında süresi ve yoğunluğu uyarma ve görüntü edinme koşulları, pozlama süresi ve satın alma sıklığı¹⁶dahil olmak üzere son derece bağımlı olduğunu gösterdi. Uyarma aydınlatma güç en kritik faktör olduğu hafif toksisite ve Turk photobleaching neden olabilir. Pozlama süresi, sıklığı, uyarma ışık şiddeti ve süresi kayıt, kayıt kayıt şartları deneme amaçlı göre optimize edilmelidir. Çekim hızı ve uyarma ışık şiddeti photobleaching ve hücreye fototoksisite önlemek mümkün olduğunca azaltılması tavsiye ediyoruz. Kayıt sıklığı ve süresi, kayıt Ca^{2 +} yükseklik ilgi etkinlikleri karşılamak için yeterli olmalı ama aynı zamanda photobleaching ve fototoksisite önlemek mümkün olduğunca düşük tutulmalıdır. Biz kayıt sıklığı ve süresi önce belirleyerek ve Turk photobleaching simge durumuna küçültülmüş ışık yoğunluğunu ve çekim hızı optimize öneririz. Bir başka önemli faktör Turk ifade düzeyidir. Turk var bir Ca^{2 +}-Ca^{2 +}olduğu gibi etkisi arabelleğe alma-proteinler bağlama. Bu nedenle, Turk overexpression Ca^{2 +}, fizyolojik hücreler için gerekli olan tampon içinde sonuçlanır. GECI ifade miktarını görüntüleme hücreleri Turk yüksek miktarda ifade önlemek için indirilmelidir.

Sonuç olarak, Ca^{2 +} sinyaller hücre altı çözünürlükte diseksiyon çıkış biyolojik fenomen belirleyen intrasellüler Ca^{2 +} sinyalleri şifresini çözmek için en önemli adımlardan biridir. Bu iletişim kuralı bu sinyalleri arasında çeşitlilik açıklamak için Ca^{2 +} sinyalleri diseksiyon için yeni bir yöntem sağlar. Şu anda, bu teknik içinde vitro deneyler için sınırlıdır. Ancak, Lck-GCaMP6f içinde vivo Ca^{2 +} görüntülemede fareler¹⁷için kullanılmakta olan ve OER-GCaMP6f Ca^{2 +} izlemek için C. elegans7 VD motor nöronlarda ın vivo sinyalleri onaylandı. Bu nedenle, Turk hücre altı yerde hedefleme içinde vivo gelecekte, böylece etkinleştirme Ca^{2 +} diseksiyon içinde vivo Imaging'e genişletilecek potansiyeline sahiptir.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser aşağıdaki hibe tarafından desteklenir: Japonya bilim ve teknoloji Ajansı (JST) / Precursory araştırma embriyonik bilim ve Teknoloji (saygınlık) (JPMJPR15F8, Japonya); Japonya toplum bilim (JSP'ler) tanıtımı için / Takeda Vakfı bilimsel araştırma (KAKENHI) (JP18H05414, JP17H05710, JP16K07316), yardım verir. Yazarlar Haruhiko Bito (Tokyo Üniversitesi) RCaMP2 ve Arthur J.Y. Huang verdiğiniz için teşekkür ederiz ve Thomas McHugh (RIKEN CBS) AAV vektörel çizimler sağlamak için ve talimatlar için AAV hazırlık ile ilgili. Yazarlar ayrıca editörler günlük, görselleştirildiği deneyler için video filme ve düzenleme ile onların yardım etmek, teşekkür etmek istiyorum.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
(RS)-3,5-Dihidroksifenilglisin (DHPG)	Tocris	# 0342
%0,5 DNaz I stok çözeltisi	Sigma-Aldrich	#11284932001	Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisinde %0,5 DNaz I (a/h) hazırlayın 120 mM MgSO₄ ile desteklenmiştir. 160 & hazırlayın; L alikotlar ve -30 ° C'de saklayın.
% 0.5 Tripsin-EDTA çözeltisi	Thermo Fisher Scientific	# 25300054
100 mM L-glutamin (&kez; 100 stok)	Thermo Fisher Scientific	#25030081	250-750 & mikro'luk küçük alikotların hazırlanması; L ve -30 ° C'de saklayın.
100 mM Sodyum piruvat (× 100 stok)	Thermo Fisher Scientific	# 11360070	Alikotlar (10 mL) -20 ° C'de saklanabilir. Çözüldükten sonra, çözelti 4 ° C'de tutulabilir; 2 ay boyunca C.
Düşük buharlaşma kapaklı 12 kuyulu çok kuyulu kültür plakaları	Falcon	#353043	Düşük buharlaşma kapağı, nöron-glia karışık kültürünün kültürlenmesi için kritik öneme sahiptir. Hücre hattı hücreleri için alternatif kültür kapları kullanılabilir.
18 mm çapında dairesel lameller	Karl Hecht "Assistent"	#41001118	Kalınlık 1, 18 mm çapında dairesel lameller; alternatif lameller kullanılabilir.
1 M HEPES	Thermo Fisher Scientific	# 15630080	pH 7.2-7.6
%2.5 Tripsin stok çözeltisi (× 20 stok)	Sigma-Aldrich	#T4674	150 ve mikro hazırlayın; L alikot ve -30 ° C'de saklayın.
% 50 Poli (etilenim) (PEI) çözeltisi	Sigma-Aldrich	#P3143	%2 (V/V) PEI stok çözeltisi hazırlayın (&kez; 50) filtrasyon ile sterilize edilmiş damıtılmış su ile. Stok çözümünü -30 ° C'de saklayın; C, 250-750 &; L'lik küçük alikotlar hazırladıktan sonra, lamel kaplama gününde damıtılmış su ile% 0.04 PEI çözeltisi hazırlayın.
%70 Etanol			Yüzey dezenfeksiyonu için kullanılmak üzere sprey şişesinde saklanır.
EF1a promotörü AAV'nin yönlendirmesi altında Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 ve OER-RCaMP2 ekspresyonu için adeno-ilişkili virüs (AAV),	AAV Helper Free System (Agilent Technologies) ve HEK293 hücreleri veya alternatif yöntemler kullanılarak hazırlanabilir. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2 ve pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f istek üzerine temin edilebilir.
B-27 eki (× 50 stok)	Thermo Fisher Scientific	#17504044	Bu, B-27 plus takviyesi (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) veya MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Almanya; #130-093-566) ile değiştirilebilir.
B57BL/6	Japonya SLC, Inc.
Mikroskobik görüntü kaydı			Aşağıdaki kameralar kullanıma hazırdı: soğutmalı CCD kamera (örneğin, Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD kamera (örn. Hamamatsu Photonics, vb; ImagEM; Andor, iXon) veya CMOS kamera (örneğin, Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)
Hücre dondurma kabı	Sarstedt K.K.	#95.64.253	Alternatif hücre dondurma kabı kullanılabilir.
Hücre süzgeci	Falcon	#352350
CO₂ inkübatör			37 ° C'de koruyun; C, %5 CO2.
Kriyojenik tüp	Corning	# 430661	Alternatif kriyojenik tüpler kullanılabilir.
Kriyoprezervasyon ortamı	Zenoaq		"CELLBANKER1"
Kültür ortamı (HeLa hücreleri için)			Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı (DMEM)% 10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu ve penisilin-streptomisin çözeltisi (nihai konsantrasyon: Penisilin 100 U / mL ve Streptomisin 100 & mikro; g/mL)
Diseksiyon ortamı			Bir mililitre 1 M HEPES (son konsantrasyon 20 mM) ila 49 mL DMEM
DMEM	Nacalai	# 08456-65	Alternatif DMEM kullanılabilir.
DMEM	Nacalai	# 08456-65	Düşük glikozlu
DNA transfeksiyon reaktifi	Sigma-Aldrich	#	6366244001 "X-tremegene HP DNA transfeksiyon reaktifi" Alternatif transfeksiyon reaktifleri kullanılabilir.
Kapaklı			Hayvanı uyuşturmak için 500 mL kavanoz (fare için) veya 1.500 mL kavanoz (sıçan için);
HBSS	Thermo Fisher Scientific	# 14170161	Kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS
Isı ile etkisiz hale getirilmiş sığır serumu	Thermo Fisher Scientific	#10100147
HeLa hücreleri	RIKEN BioResource Center	#RCB0007
Histamin	Sigma-Aldrich	#H7125
Görüntü analiz yazılımı			Metamorph (Moleküler Cihazlar), ImageJ (NIH) ve TI Workbench14 (ısmarlama) gibi
Görüntü bölme optiği	Hamamatsu Photonics	#A12801-01	W-view GEMINI
Görüntü bölme optiği dikroik ayna	Semrock	#FF560-FDi01-25× 36	Yeşil floresan proteini / kırmızı floresan proteininin ayrılması için; (GFP/RFP) sinyali
Görüntü bölme optiği emisyon filtreleri	Semrock	#FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25	GFP/RFP sinyalinin emisyonu için sırasıyla
Görüntüleme ortamı ve tampon			Deney için en uygun ortamı veya tamponu kullanın. Ortam kullanıldığında, arka plan floresansını azaltmak için fenol kırmızısı içermeyen ortam arzu edilir. CO₂ inkübatörünün dışında pH'ı korumak için 20 mM HEPES ekleyin.
Kuluçka salin			IX73 (Olympus) gibi 49 mL HBSS Ters floresan mikroskobuna 1 mL 1 M HEPES (20 mM) ekleyin
			Eclipse TI (Nikon Instech)
için kullanılan	Isofluran	Pfizer
Bakım ortamı (4 ve kez; 12 kuyulu yemek için)			1 mL B-27, 500 ve mikro ile desteklenmiş 48,5 mL Nörobazal-A ortamı; L L-glutamin stoğu ve 25 & mikro; L Penisilin-Streptomisin çözeltisi.
Donmuş kortikal hücreler için bakım ortamı (1 ve kez; 12 kuyulu tabak için)			12.2 mL Nörobazal artı 250 & mikro ile desteklenmiş ortam; L B-27, 125 ve mikro; L L-glutamin stoğu ve 6.2 & mikro; L Penisilin-Streptomisin çözeltisi.
MEM (Minimum Esansiyel Ortam)	Thermo Fisher Scientific	#11090-081
GCaMP6f görüntüleme			için mikroskop filtre seti GFP için uygun filtre (uyarma, 480 ± 10 nm; emisyon, 530 ± 20 nm)
RCaMP2 görüntüleme			RFP için uygun filtre (uyarma, 535 ± 50 nm; emisyon, 590 nm uzun geçiş)
RCaMP2 ve GCaMP6f Semrock'un çift görüntülenmesi için mikroskop filtre setleri		#FF01-468 / 553-25, #FF493 / 574-FDi01-25 ve kez; 36, #FF01-512 / 630-25	Çift uyarma filtresi, Çift dikroik ayna ve GFP / RFP görüntüleme için emisyon filtresi.
Mikroskop ısıtma sistemi			Hücreleri 37 ° C'de tutmak için bir ısıtma sistemi; Görüntüleme sırasında C. Termal genleşmenin neden olduğu kaymayı önlemek için, tüm mikroskobun kendisini kaplayan ısıtma sistemleri (örneğin, Tokai Hit, Thermobox) önerilir.
		için mikroskop ışık kaynağı	Cıva lambası (100 W), ksenon lamba (75 W), Işık yayan diyot (LED) aydınlatma sistemi (ör. CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4 dalga boylu LED kaynağı; Lümen, SPECTRA X hafif motor). Cıva topakı ve ksenon lamba durumunda, uyarma yoğunluğunu azaltmak için ND filtresi kullanın.
Nöronlarda	ve astrositlerde spontan Ca²⁺ aktivitesinin kaydedilmesi için 1.3'ten daha yüksek sayısal açıklığa sahip mikroskop
Neurobazal plus medium	Thermo Fisher Scientific	#A3582901
Neurobazal-A Medium	Thermo Fisher Scientific	#10888022	Neurobazal-A ortamı yerine nörobazal artı ortam (Thermo Fisher, A3582901) kullanılabilir.
PBS(-): Ca²⁺ ve Mg²⁺ içermeyen fosfat tamponlu salin;	Fujifilm Wako Saf Kimyasal İşbirliği	# 164-23551	Ca < sup> + < / sup> ve Mg < sup> 2 + < / sup> yokluğu, tripsin aktivitesini inhibe etmemek için kritik öneme sahiptir. PBS(-)'ye bir alternatif kullanılabilir.
PC ve görüntü elde etme yazılımı			; Mikro yönetici; TI Çalışma Tezgahı¹⁴.
Penisilin-Streptomisin çözeltisi	Thermo Fisher Scientific	#15140122	Penisilin 10.000 U / mL ve Streptomisin 10.000 &mikro; g/mL
Sitomegalovirüs promotörü altında Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 ve OER-RCaMP2 ekspresyonu için plazmid ^7-9			İstek üzerine temin edilebilir
Kaplama ortamı (4 ve 12 kuyulu yemekler için)			1 mL B-27 takviyesi ile desteklenmiş 48 mL MEM, 500 & mikro; L L-glutamin stoğu (nihai konsantrasyon: 2 mM), 500 & mikro; L sodyum piruvat stoğu (1 mM) ve 25 & mikro; L Penisilin-Streptomisin çözeltisi (penisilin 5 U/mL, streptomisin 5 ve mikro; g/mL). Bu Penisilin-Streptomisin konsantrasyonu, 1/20 < Üretici tarafından önerilen konsantrasyon, nöronal sağkalım için kritik öneme sahiptir.
Kayıt odası	Elveflow	Ludin Odası	Bu kayıt odası 18 mm çapında yuvarlak lameller içindir.
Azaltılmış serum ortamı	Thermo Fisher	#11058021	Opti-MEM
Stereomikroskop			Hipokampusları incelemek için kullanılır. Olympus SZ60 veya eşdeğeri stereomikroskoplar mevcuttur.
Cerrahi aletler			Bir farenin veya sıçanın karnını kesmek için standart diseksiyon makası, uterusu sıkıştırmak için cımbız, uterusu ve embriyonun başını kesmek için hassas diseksiyon makası, embriyoları sıkıştırmak için halka forseps, beyinleri çıkarmak için 13 cm kavisli Semken forseps (Güzel Bilim Araçları #11009-13), ince uçlu 3 forseps (Dumont İnoks #5)
Nöron için transfeksiyon reaktifi	Thermo Fisher Scientific	#L3000008	"Lipofectamine 3000" reaktifi. Adım 2.2.3'te plazmit DNA ile karıştırılması gereken "takviye (P3000)" ve adım 2.2.4'te kullanılan "transfeksiyon reaktifi (lipofektamin 3000)" den oluşur.
Tripan mavisi (% 0.4)	Thermo Fisher Scientific	# 15250061
Donmuş kortikal hücreler için yıkama ortamı			250 & ile desteklenmiş 25 mL DMEM; L ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu + 12.5 & mikro; L Penisilin Streptomisin.
Wistar sıçanları	Japonya SLC, Inc		Gebe sıçanlar (E18)

için kamera cam kavanoz: veya Anestezi için mikroskop filtre seti Uyarma objektif objektifi Plan-Apochromat yağa daldırma objektifi şiddetle tavsiye edilir.Metamorph (Moleküler Cihazlar) gibi

Kaynaklar

Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
Bagur, R., Hajnoczky, G. Intracellular Ca(2+) Sensing: Its Role in Calcium Homeostasis and Signaling. Molecular Cell. 66 (6), 780-788 (2017).
Bannai, H., et al. Bidirectional Control of Synaptic GABAAR Clustering by Glutamate and Calcium. Cell Reports. 13 (12), 2768-2780 (2015).
Tojima, T., Hines, J. H., Henley, J. R., Kamiguchi, H. Second messengers and membrane trafficking direct and organize growth cone steering. Nature Reviews Neuroscience. 12 (4), 191-203 (2011).
Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nature Neuroscience. 13 (6), 759-766 (2010).
Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
Niwa, F., et al. Dissection of local Ca(2+) signals inside cytosol by ER-targeted Ca(2+) indicator. Biochemical and Biophysical Research Communications. 479 (1), 67-73 (2016).
Vervliet, T., et al. Basal ryanodine receptor activity suppresses autophagic flux. Biochemical Pharmacology. 132, 133-142 (2017).
Sakuragi, S., Niwa, F., Oda, Y., Mikoshiba, K., Bannai, H. Astroglial Ca2+ signaling is generated by the coordination of IP3R and store-operated Ca2+ channels. Biochemical and Biophysical Research Communications. 486 (4), 879-885 (2017).
Inoue, M., et al. Rational design of a high-affinity, fast, red calcium indicator R-CaMP2. Nature Methods. 12 (1), 64-70 (2015).
Quasthoff, K., et al. Freshly frozen E18 rat cortical cells can generate functional neural networks after standard cryopreservation and thawing procedures. Cytotechnology. 67 (3), 419-426 (2015).
Boehringer, R., et al. Chronic Loss of CA2 Transmission Leads to Hippocampal Hyperexcitability. Neuron. 94 (3), 642-655 (2017).
Arizono, M., et al. Receptor-selective diffusion barrier enhances sensitivity of astrocytic processes to metabotropic glutamate receptor stimulation. Science Signaling. 5 (218), ra27(2012).
Kanemaru, K., et al. In vivo visualization of subtle, transient, and local activity of astrocytes using an ultrasensitive Ca(2+) indicator. Cell Reports. 8 (1), 311-318 (2014).
Inoue, T. TI Workbench, an integrated software package for electrophysiology and imaging. Microscopy (Oxford, UK). 67 (3), 129-143 (2018).
Miyamoto, A., Bannai, H., Michikawa, T., Mikoshiba, K. Optimal microscopic systems for long-term imaging of intracellular calcium using a ratiometric genetically-encoded calcium indicator. Biochemical and Biophysical Research Communications. 434 (2), 252-257 (2013).
Srinivasan, R., et al. New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kalsiyum G r nt leme Genetik Olarak Kodlanm G stergeler OER GCaMP6f Lck RCaMP2 Kalsiyum Giri i zleme Kalsiyum Sal n m Tespiti H cre Alt z n rl kl G r nt leme H cre K lt r Transfeksiyonu Time lapse Mikroskopi

Yerel Ca2 + sinyalleri membran hedefli Ca2 + göstergeleri tarafından kültürlü hücrelerdeki diseksiyon

Bu makalede

Özet

Özet

Giriş

Protokol

Sonuçlar

Tartışma

Açıklamalar

Teşekkürler

Malzemeler

Kaynaklar

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İlgili makaleler

Yerel Ca^{2 +} sinyalleri membran hedefli Ca^{2 +} göstergeleri tarafından kültürlü hücrelerdeki diseksiyon