Yöntem makalesi

Hipoksi/SU5416 Modeli kullanılarak Farelerde Pulmoner Hipertansiyonun İndüksiyonu ve Karakterizasyonu

DOI:

10.3791/59252

⸱

3 Haziran 2020

 ,  ,  , 
1Cardiovascular Research Center, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Phospholamban Foundation

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, hipoksiye maruz kalma ve VEGF reseptör antagonistinin enjeksiyonuna bağlı olarak farelerde pulmoner hipertansiyonun (PH) indüksiyonunu tanımlar. Hayvanlarda protokolün başlamasından 3 hafta sonra PH ve sağ ventrikül (RV) hipertrofisi gelişir. Modelin fonksiyonel ve morfometrik karakterizasyonu da sunulmuştur.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pulmoner Hipertansiyon (PH), sağ kalp kateterizasyonu ile değerlendirildiği gibi, istirahatte 25 mm Hg'yi aşan ortalama pulmoner arteriyel basınç ile tanımlanan patofizyolojik bir durumdur. Hastalıkların geniş bir yelpazede PH yol açabilir, onların etiyolojisi farklı, histopatoloji, klinik sunum, prognoz, ve tedaviye yanıt. Son yıllarda kayda değer ilerlemelere rağmen, PH bir hastalığı olmaya devam etmektedir. Altta yatan mekanizmaları anlamak yeni tedavilerin geliştirilmesinin önünü açabilir. Hayvan modelleri bu amaca ulaşmak için önemli araştırma araçlarıdır. Şu anda, PH recapitulating için çeşitli modeller vardır. Bu protokol, iki isabetli fare PH modelini açıklar. PH gelişimi için uyaranlar hipoksi ve SU5416 enjeksiyonu, bir vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) reseptör antagonist. Hipoksi/SU5416'nın başlamasından üç hafta sonra, hayvanlarda insan PH'sinde (ağırlıklı olarak Grup 1) gözlenen histopatolojik değişiklikleri taklit eden pulmoner vasküler remodeling gelişir. Pulmoner dolaşımda vasküler remodeling sağ ventrikül remodeling sonuçları (RV). RV basınçlarının ölçülmesi (açık göğüs yöntemi kullanılarak), RV'nin morfometrik analizleri (her iki kardiyak ventriküllerin kesişmesi ve tartılarak) ve remodelinghistolojik değerlendirmeleri (rv kardiyomiyosit hipertrofisi ve fibrozis ideğerlendirerek vasküler remodeling ve kardiyak değerlendirilerek hem pulmoner hem de kardiyak) ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu protokolün avantajları hem yabani tipte hem de genetiği değiştirilmiş farelerde uygulamanın imkanı, nispeten kolay ve düşük maliyetli uygulama ve ilgi hastalığının hızlı gelişimidir (3 hafta). Bu yöntemin sınırlamaları farelerde ciddi bir fenotip gelişmemesi ve NORMOKSIA'ya döndükten sonra PH'nin geri döndürülebilir olmasıdır. Önleme, hem de tedavi çalışmaları, kolayca bu modelde uygulanabilir, gelişmiş beceri gerek kalmadan (cerrahi kemirgen modelleri aksine).

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pulmoner Hipertansiyon (PH) bir patofizyolojik durumdur, ortalama pulmoner arteriyel ile tanımlanan (PA) basınç istirahatte 25 mm Hg aşan, sağ kalp kateterizasyonu ile değerlendirildiği gibi1,2. PH yol açabilir hastalıkların çeşitli vardır. PH ile ilişkili koşulları düzenlemek amacıyla çeşitli sınıflandırma sistemleri geliştirilmiştir. Mevcut klinik sınıflandırma 5 farklı grupta birden fazla PH ilişkili hastalıkları kategorize1. Çeşitli hasta gruplarının klinik bulguları, patolojisi, prognozu ve tedaviye yanıtı farklı hastalıklara sahip olması nedeniyle bu ayrım önem taşımaktadır2. Tablo 1, her hastalığın temel histopatolojik özellikleri ile tamamlanan mevcut sınıflandırmayı özetler.

figure-introduction-1
Tablo 1: PH'nin klinik sınıflandırılmasına genel bakış ve gruplar daki ana histopatolojik özellikler. PH modellemeiçin Hipoksi/SU5416 protokolünün uygunluğu. Bu tablo19'dandeğiştirildi. PH: Pulmoner Hipertansiyon, PAH: Pulmoner Arteriyel Hipertansiyon

PH ile ilişkili hastalıkların tedavisinde önemli gelişmelere rağmen, PH hala bir tedavi olmadan kalır, 3 yıllık mortalite oranı arasında değişen ile 20% ve 80%3. Bu PH altta yatan mekanizmaları anlamak için zorunlu ihtiyaç gösterir ve bundan sonra, önlemek için yeni tedavilerin geliştirilmesi, ilerlemesini yavaşlatmak, ve hastalığı tedavi. Hayvan modelleri bu kapsamda hayati önem taşımaktadır. Şu anda, ph çalışmak için çeşitli modeller mevcuttur. İlgilenen okuyucu bu konuda mükemmel değerlendirmeleri sevkedilir 2,3,4. PH'ye yol açan hastalıkların çeşitliliğini göz önünde bulundurarak, insan PH'sinin çeşitli koşullarının tek bir hayvan modelinde mükemmel bir şekilde özetlenemez olduğu açıktır. Mevcut hayvan modelleri kategorize edilebilir i) tek vuruşlu, ii) iki isabet, iii) nakavt, ve iv) overexpression modelleri3. Tek vuruşlu modellerde, PH tek bir patolojik uyarıcı tarafından indüklenir, iki isabetli modeller daha şiddetli PH indükleme ve böylece daha yakından karmaşık insan hastalığı taklit amacı ile iki patolojik uyaranları birleştirmek ise. Etyolojik farklılıkların yanı sıra, çeşitli uyaranlar ph modelleme farklılıkları ile sonuçlanır ve bu da türlerine ve hayvanların genetik arka planına bağlıdır4.

En sık kullanılan klasik PH kemirgen modellerinden biri kronik hipoksi modeli2. Hipoksi insanlarda PH yanı sıra çeşitli hayvan türlerinde neden olduğu bilinmektedir. Hipoksi PH için fizyolojik bir uyarıcı olma avantajına sahiptir(Tablo 1). Ancak, kemirgenlerde PH indüklemek için kullanılan hipoksi derecesi insanlarda çok daha şiddetli iken, tek hakaret (hipoksi) vasküler remodeling sadece hafif bir formu yol açar. Bu insan hastalığının şiddetini taklit etmez. İkinci bir hit eklenmesi, PH indükleyen için ekstra bir uyarıcı, umut verici sonuçlar gösterdi: hipoksik uyarıcı ile birlikte kemirgenler için bileşik SU5416 enjeksiyonu daha şiddetli PH fenotip 2,2,5,6neden olur . SU5416 vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) reseptör-2 inhibitörüdür. VEGF reseptörlerini bloke eder ve endotel hücreli apoptosise yol açar. Hipoksik koşullar altında, bu apoptoza dirençli endotel hücrelerinin bir alt kümesinin çoğalmasını uyarır. Ayrıca, SU5416 düz kas hücresi çoğalması yol açar. Bu etkilerin kombinasyonu pulmoner dolaşımın patolojik vasküler remodeling sonuçları ve yüksek PA basınç ve sağ ventrikül remodeling yol açar2,5,7. Model ilk sıçanlarda tarif edildi6 ve daha sonra farelere uygulanan4,5,7. Fare modeli sıçanlara göre daha az şiddetli vasküler remodeling sergiler. Ayrıca, normoksia geri döndüğünde, PH sıçanlarda ilerlemeye devam ederken, farelerde kısmen geri dönüşümlüdür.

Aşağıdaki protokol, Hypoxia/SU5416 yöntemini (planlama, zaman çizelgesi, yürütme) kullanarak farelerde PH modellemesi için tüm adımları açıklar. Ayrıca, modelin karakterizasyonu bu protokolde açıklanmıştır: fonksiyonel (açık göğüs tekniği kullanılarak sağ ventrikül (RV) basıncının invaziv olarak ölçülmesi), morfometrik (sağ ve sol ventriküllerin hem diseksiyonu hem de tartılması ile), histolojik olarak (pulmoner vasküler remodeling, sağ ventrikül kardiyomiyosit hipertrofisi ve fibrozis değerlendirilerek).

Bu protokolde açıklanan tüm adımlar ve yöntemler herhangi bir deneyim düzeyinde araştırmacılar tarafından kolayca uygulanabilir. Açık göğüs tekniğini kullanarak RV fonksiyonel ölçümleri (burada açıklanan) alanında altın standart yöntem olmasa da, hızlı bir şekilde öğrenilebilir ve doğru bir daha az deneyimli deneyci tarafından çoğaltılabilir avantajı vardır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Herhangi bir hayvan deneyi öncesinde yerel kurumsal hayvan bakım komitesi izni alın. Mevcut deneyler, Sina Dağı'ndaki Icahn Tıp Fakültesi'nde Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin (IACUC) onayı alındıktan sonra yapılmıştır.

1. PH indüksiyonu

  1. Hazırlık
    1. Çalışmaya başlamadan önce, deneysel tasarımı dikkatlice planlayın. Farelerin ilk SU5416 enjeksiyonu ile aynı anda hipoksiye maruz kaldığından emin olun. Hypoxia/SU5416 yöntemikullanılarak PH'yi indükleyen deneysel tasarımın bir örneği Şekil 1A'dagösterilmiştir. Kontrol fareleri sadece araç aldı. Bu model için, SU5416 farelere haftada bir kez 3 hafta üst üste enjekte edilecektir.
    2. Bu çalışma için sekiz ila on iki haftalık C57BL/6 fare kullanın. Hayvanları 18-20 °C'de 12-h açık-koyu bir döngü içinde barındırır. Gıda ve su reklam libitumerişilebilir olduğundan emin olun.
    3. Hayvanları tart. Normoksi ve Hipoksi/SU5416: Her gruba rasgele atamak.
    4. Şekil 12B'de gösterildiği gibi hipoksik hazneyi hazırlayın. Oksijen (O2)denetleyicisini %10 O2'yeayarlayın. Sistemin sabit bir duruma ulaşmasına izin verin.
    5. SU5416'yı enjeksiyoniçin hazırlayın (20 mg/kg vücut ağırlığı kullanın). SU5416 sulu çözeltilerde çözünmez; bu nedenle, hesaplanan miktarı 100 μL DMSO8'deçözün. Örneğin, 25 g'lık bir fare için enjekte edilecek SU5416 miktarı 100 μL çözücüde (DMSO) çözünmüş 0,5 mg'dır. Bu fare için SU5416 son konsantrasyonu, bu nedenle, 5 mg / mL.
      DİkKAT: SU5416 tehlikeli bir maddedir. Ürün le birlikte Güvenlik Veri Sayfasını dikkatle okuyun ve bu maddeyi kullanırken önerilen önlemleri aldığından emin olun. Koruyucu eldiven giyin ve (herhangi bir enjeksiyon için olduğu gibi) göz koruması kullanın. SU5416'nın kimyasal yapısı Şekil 1C'de gösterilmiştir.
      NOT: Enjeksiyon sırasında kaybedilecek hacmi telafi etmek için çözeltinin uygun bir fazlalığını hesaplayın (örn. şırınga, şişe vb.) Kullanılan şırıngaya bağlı olarak ölü hacmi yaklaşık 200 μL'dir. 10 fareden oluşan bir grup için, 2 fare dozunun fazlaolduğunu hesaplayın.
    6. Şırıngaları enjeksiyoniçin hazırlayın. 25 G x 5/8" iğneli 1 mL şırınga kullanın.
  2. SU5416 deri altı enjeksiyon
    1. Hayvanı dizginle. Kısıtlamaya yardımcı olmak için fareyi kafesin kapağına yerleştirin. Deriyi tutun ve omurgaya paralel bir çadır kurun. Fare nin olası ısırık yaralanmasını önlemek için başın arkasına sıkıca tutunun.
      NOT: İki araştırmacının varlığı, diğeri enjeksiyonu gerçekleştirirken, biri hayvanı tutabildiği için prosedürü daha hızlı ve daha doğru hale getirir.
    2. İğneyi deri kıvrımına yan tarafa deri altına yerleştirin. İğneyi cilde paralel olarak taktığından emin olun. Karın duvarına girmekten kaçının.
    3. Şırınganın içeriğini enjekte edin (100 μL çözünmüş SU5416 veya araç).
      NOT: Tam doğumdan sonra sızıntıyı önlemek için şırıngayı yaklaşık 10 s tutun ve iğneyi derinin altında hafifçe döndürün.
    4. İğneyi geri çekin ve hayvanı kafesine geri getirin. SU5416 enjeksiyonundan sonra kafesleri havalandırmalı hipoksi odasına yerleştirin.
  3. Hipoksiye maruz kalma
    1. Zaman içinde havalandırmayı izleyin. Oksijen kaynağının %10'una kadar korunun. Normoksia hayvanlarını yarı kapatılabilir bir odada %21 O2'demuhafaza edin.
    2. Odaların oksijen seviyesini ölçmek için bir oksijen sensörü ile donatılmış olduğundan emin olun. Odaların kapsamlı açılmasından kaçının. Temizlik ve gıda ve su eklemek için en fazla 20 dk her 3 günde bir odaları açın.
    3. Hayvanları her gün inceleyin. Piloerection veya önemli kilo kaybı gibi stres sinyalleri düşünün.
      NOT: Hipoksi/SU5416 altındaki hayvanların5kilo vermesi beklenmektedir. Bu hastalık gelişiminin bir göstergesidir.
    4. Art arda 3 hafta boyunca haftalık SU5416 enjeksiyonu tekrarlayın (deneysel tasarımın genel görünümü için Şekil 1A'ya bakın).
      NOT: Enjeksiyon yeri değişen cilt tahrişleri azaltmaya yardımcı olabilir.

2. İnvaziv RV basınç ölçümleri ile fonksiyonel karakterizasyon

  1. Hazırlık
    NOT: Bir anestezi rejimi seçin. Enjektabl veya solunabilir anestezikler kullanılabilir. Enjekte edilebilir anesteziklerin hafif bir aşırı doz (özellikle ketamin / ksilazin veya pentobarbital) önemli ölçüde kalp fonksiyonunu etkileyebilir beri, uçucu anesteziklerin kullanımı tavsiye edilir. Bir çalışmada tüm fareler için aynı anestezik kullanmak büyük önem taşımaktadır.
    1. Hayvan başına doğru bir anestezi dozu sağlamak için bir buharlaştırıcı kullanın. Isofluran için doz aşağıdaki gibidir: indüksiyon 3-4%, bakım 1% 100 oksijen ile karıştırılır.
      NOT: Kişisel koruyucu ekipman takın ve buharı solumaktan kaçının.
    2. Vücut ısısını korumak için ısıtma yastığı ve/veya ısıtma lambaları hazırlayın. Vücut ısısını izlemek için bir rektal sıcaklık sondası hazırlayın.
    3. Uygun havalandırmayı sağlayın. Ventilatöre önceden hazırlayın. Y-tüp konektörünü hazırlayın ve manuel modu kullanarak ventilatörün işlevini kontrol edin. Barotravmayı önlemek için inspiratuar basıncın <1 cm H2O olduğundan emin olun. Solunum hızını 110 nefes/dk olarak ayarlayın.
    4. 20 G intravasküler kateteri keserek endotrakeal tüp hazırlayın.
    5. Gerekli aletleri hazırlayın: küçük çalgılar, makas, elastik kanca retraktörleri, damar kapterizerve pamuklu bezler. Bir pamuk lu bez üzerinde sağ ventrikül küçük bir delinme yapmak için kullanılacak küçük bir 25 G x 5 /8 " iğne ayarlayın.
    6. Basınç Kateterini, Basınç Hacmi Kontrol Ünitesini hazırlayın ve veri toplama yazılımını başlatın. PV Kateterini 37 °C'de PBS ile doldurulmuş 15 mL'lik bir tüpe 15 dakika süreyle yerleştirin ve üreticinin protokolüne göre kalibre edin.
    7. Organların perfüzyonu ve fiksasyonu için PBS ve %50 PBS / %50 EKIM bir çözelti hazırlayın. 2 x 10 mL şırınga (25 G iğne ile) hazırlayın: biri kalp ve akciğeri Yerinde PBS ile perfüzyoniçin, ikincisi ise okt/ PBS (50/50) çözeltisinin incelenmesinde kullanılacak olan akciğere enjekte etmek için kullanılacaktır.
  2. Entübasyon
    1. Fareyi tartın ve anesteziden önce sağlık durumunu kaydedin.
    2. % 3-4 isofluran ile anestezi indüklemek. Ayak ucurrefleksini test ederek anestezi derinliğini kontrol edin: uzuvlardan birinin ayak ayak parmaklarını sıkıca çimdikleyin. Eğer hayvan uzvunu geri çekerse, bu yetersiz anestezinin bir işaretidir.
    3. Anestezi indüksiyonundan sonra boyun ve göğüs bölgelerini tıraş edin.
    4. Fareyi ısıtma yastığına yerleştirin. Vücut ısısını izlemek için rektal sıcaklık sondası yerleştirin.
      NOT: Vücut ısısının bakımı fonksiyonel ölçümler için önemlidir. Vücut ısısı yaklaşık 36.5-37 °C olmalıdır.
    5. Kavisli forceps kullanarak farenin üst kesici dişleri ne bir dikiş iplik eklemek, germek ve cerrahi bant ile ısıtma yastığı düzeltmek. Cerrahi bantlar kullanarak farenin uzuvlarını sabitleyin.
    6. Hayvan entübe için küçük makas kullanarak medial servikal deride yaklaşık 1 cm küçük bir kesi yapmak.
      NOT: Oral entübasyon daha fazla deneyim gerektiren alternatif bir yöntemdir.
    7. Pamuk uçlu aplikatör ile orta düzeyde parotis ve submandibular tükürük bezleri ayrı. Bu nefes borusu örten kasları ortaya çıkaracaktır.
    8. Nefes borusuna maruz kalan bu kasları dikkatlice kesin.
    9. Küçük makas ile trakeal kıkırdaklar arasında küçük bir kesi yapmak ve hazırlanan endotrakeal tüp eklemek. İntravasküler kateterin metal rehberini çıkar.
    10. Kateteri ventilatöre bağlayın. Akciğerleri elle hafifçe şişirerek trakeal tüp pozisyonunu doğrulayın. Pozisyonu bantla sabitleyin.
    11. İşlem boyunca %1 isofluran anestezisi uygulayın.
    12. Ayak ucurrefleksini test ederek anestezinin derinliğini düzenli olarak izleyin. Anesteziyi buna göre ayarlayın.
      NOT: Deneyler sırasında önerilen kalp hızı, altında 1% isofluran anestezi, yaklaşık 400 atım / dk. Vücut ısısı ve anestezi bakımı kalp hızını kontrol etmek için gereklidir. Isofluran fazlakalp hızını azaltabilir. Ancak, iyileşme izofluran oranı azaltarak elde edilebilir.
  3. RV basınç ölçümleri (açık göğüs yaklaşımı)
    1. Küçük makas ile ksifoid süreci ve üst karın kısmı üzerinde yaklaşık 1 cm bir deri kesi yapmak. Üst karın kadranda göğüs ve karın duvarı kapsayan cilt ayırın: orta çizgide başlar, ksifoid distal ve dikkatle her iki tarafta yanal hareket. Kanamayı kontrol etmek için termokoter kullanın.
      NOT: Amaç karın duvarından göğüs boşluğuna erişebilmektir.
    2. Karın boşluğu açın ve dikkatle diyafram kesti, atan kalp veya akciğerlerzarar değil dikkat.
      NOT: Amaç kalbin apeks ve sağ ventrikül ortaya çıkarmaktır. İyi pozlama ve kalbin görünümü kateterin doğru yerleştirilmesi için çok önemlidir. İşlem boyunca kanamayı önlemek büyük önem taşımaktadır. İntravasal hacimdeki küçük değişiklikler bile sağ kalbin yükünü değiştirebilir ve kaydedilen parametreleri etkileyebilir.
    3. Pamuk uçlu aplikatör kullanarak perikard'ı hafifçe çıkarın.
    4. Basınç kateterini kalbe yerleştirmeden hemen önce kateteri farenin yanına getirin.
    5. İğne ile hazırlanan pamuk uçlu aplikatör kullanarak sağ ventrikül apikal distal kısmında bir bıçak yarası yapar. İğneyi dikkatlice çıkarın ve basınç kateterini bu deliğe takın.
      NOT: Bu güç uygulamadan çalışması gerekir. Bu mümkün değilse, kalbin uzun süreli yaralanmasını önlemek için ilkinin yakınında yeni bir delik yapmayı deneyin. İğne yaklaşık 3 mm'den daha derine yerleştirilmemelidir.
    6. Basınç kateterini sağ ventrikül yönüne paralel olarak yerleştirin ve ucu pulmoner artere bakacak şekilde yerleştirin.
    7. Kateterin doğru konumlandırIlmesini sağlamak için basınç dalgasının izini izleyin. Temsili izlemeler Şekil 2'degösterilmiştir.
    8. Basınç sinyalinin sabitlenmesine izin verin. Solunumu duraklatın ve en az 3 ölçüm alın. Bireysel ölçümler arasında hayvan Havalandırılabilir sağlar.
    9. Tüm ölçümler kaydedildikten sonra kateteri çıkarın ve su banyosundaki PBS dolu tüpe geri yerleştirin.
      NOT: Deney tamamlandıktan sonra kateteri üreticinin talimatlarına göre temizleyin.
  4. Ötenazi ve akciğer perfüzyonu
    1. Deney tamamlandıktan sonra exsanguination tarafından fare ötenazi.
    2. Göğsü geniş bir şekilde aç. Makas kullanarak, tüm göğüs kesme ve kalp veya akciğerlerzarar değil dikkat edin.
    3. Iris makas kullanarak kan odası terk etmek için izin vermek için sol ventrikül küçük bir kesi yapar.
    4. 10 mL PBS içeren şırınganın 25 G iğnesini sağ ventrikülün altına yerleştirin ve akciğerler kandan temizlenene kadar PBS çözeltisini enjekte edin.
    5. Bu adım tamamlandıktan sonra, hayati doku hasat (kalp ve akciğerler) tarafından ötanazi onaylamak: kava ve aort ekleri kesmek ve kalp ve akciğerler en blokkaldırmak .

3. Morfometrik karakterizasyon

  1. Kalp ve akciğerleri çıkardıktan hemen sonra (Adım 2.4.5), kalbi izole edin ve her iki atria çıkarın. Kavisli tenotomi makasile sağ ventrikül (RV) sol ventrikülden (RV) dikkatlice inceleyerek septum (S) sol ventrikülile birlikte bırakılır. RV ve LV+S'yi tartın ve Fulton indeksini= RV/LV+ S(Şekil 3)5,9'uhesaplayın.
  2. Sağ ventrikül bir parçası alın ve bir OCT önceden doldurulmuş katıştırma kalıp yerleştirin. RNA ve/veya protein analizi için sağ ventrikülün diğer kısmını kullanın. Kuru buzda kırışve -80 °C'de saklayın.
  3. Kalp ve diğer kalan doku akciğerleri izole etmek için iris makas kullanın.
    NOT: Akciğerlerin hazırlanmasında yukarıda açıklandığı gibi perfüzyon (Adımlar 2.4.3-2.4.5) büyük önem taşımaktadır.
  4. Snap akciğerlerin bir kısmını dondurun ve RNA, protein çıkarma veya diğer tahliller için saklayın.
  5. Histolojik analiz için akciğerlerin diğer kısmını kullanın. Bu amaçla, kullanılan lob 10 bir bronş% 50 PBS ve% 50 OCT içeren şırınga takın10,11. Deneyci şırınganın içeriği dokuya nüfuz edildiğinde akciğerin şişkin olduğunu kolayca görebilir.
  6. Bu akciğer parçalarını OCT ile önceden doldurulmuş kalıplara yerleştirin ve kuru buzda çabuk dondurun. Numuneleri dondurulduktan sonra -80 °C'de saklayın.
  7. Bir kriyostat makinesi kullanarak 8 μm rv ve akciğer bölümleri hazırlayın. Hava 30 dakika oda sıcaklığında bölümleri kurutun.
  8. Slaytları oda sıcaklığında 10 dakika boyunca %10 paraformaldehit (PFA) kullanarak düzeltin.
    NOT: PFA bilinen bir insan karsinojendir. Kimyasal bir duman başlığı, uygun prosedürler ve kişisel koruyucu ekipman lar kullanarak maruz kalma riskini azaltın. Daha fazla bilgi için Malzeme Güvenliği Veri Formu'na (MSDS) bakın.
  9. Hematoksilin/Eozin boyama ile vasküler remodeling değerlendirmesi
    Not: Akciğerde kalp ve vasküler remodeling yapısal değişiklikleri değerlendirmek için Hematoksilin / Eosin boyama gerçekleştirin (Şekil 3).
    1. 8 dakika hematoksilin çözeltisi ile leke.
    2. 5 dakika boyunca akan musluk suyu ile durulayın ve ardından distile suda hızlı bir durulama.
    3. 1 dk için %95 EtOH'u durulayın ve 1 dk boyunca Eosin çözeltisinde karşı lekesi layın.
    4. Dehidrat (%80 Etanol 10-30 s, 1 dk için 100 Etanol ve 3 dk için % 100 Toluol).
    5. Monte edin ve bir kapak ile kaplayın. Slaytları oda sıcaklığında bir gecede kurulayın.
      NOT: Boyama için kullanılan çözeltiler tehlikeli olabilir. Kimyasal bir duman başlığı, uygun prosedürler ve kişisel koruyucu ekipman lar kullanarak maruz kalma riskini azaltın. Daha fazla bilgi için MSDS'ye başvurun.
  10. Picrosirius Kırmızı Boyama ile sağ ventrikül fibrozis değerlendirmesi
    NOT: Picrosirius Kırmızı Boyama, Picrosirius Kırmızı, asit, kollajenbağlanır 12. Bu nedenle, bu boyama kollajen içeriğinin histolojik incelemesi için kullanılabilir.
    1. Slaytları önceden ısıtılmış bir Bouin's Solution'da 58 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
    2. 10-15 dakika boyunca bölümlerden sarı renk kaldırmak için akan musluk suyunda slaytlar yıkayın.
    3. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca % 0.1 Hızlı Yeşil leke.
    4. 1 dakika boyunca % 1 Asetik Asit durular.
    5. 5 dakika musluk suyunda durulayın.
    6. Oda sıcaklığında 30 dakika sirius kırmızı% 0.1 leke Toluol dehidratasyon izledi.
      DİkKAT: Boyama için kullanılan çözeltiler tehlikeli olabilir. Kimyasal bir duman başlığı, uygun prosedürler ve kişisel koruyucu ekipman lar kullanarak maruz kalma riskini azaltın. Daha fazla bilgi için MSDS'ye başvurun.
  11. WGA Boyama ile RV kardiyomiyosit hipertrofisi değerlendirmesi
    NOT: Sağ ventrikülhipertrofisi (RV) hücresel düzeyde buğday germ agglutinin (WGA) boyama gerçekleştirerek değerlendirilebilir(Şekil 4).
    1. 15 dakika soğuk Aseton çözeltisi slaytlar ve PBS (5 dakika her) yıkama 3 adım takip slaytlar düzeltin.
    2. Oda sıcaklığında 30 dakika dada çözeltisinde %10 keçi serumu ile blok.
    3. WGA ile slaytları kuluçkaya yatırın: WGA 1:200 ekleyin ve karanlıkta 37 °C'de 1 1/2 saat kuluçkaya yatırın.
    4. Slaytları PBS ile üç kez yıkayın.
    5. Bir nükleik asit boya ile slaytlar kuluçka.
    6. Slaytları PBS ile üç kez yıkayın.
    7. Montaj için, sıvı fazlalığını çıkarın ve montaj ortamı ve bir coverslip uygulayın. Karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat boyunca slaytları kurutun ve 4 °C'de saklayın.
      NOT: Boyama için kullanılan çözeltiler tehlikeli olabilir. Kimyasal bir duman başlığı, uygun prosedürler ve kişisel koruyucu ekipman lar kullanarak maruz kalma riskini azaltın. Daha fazla bilgi için MSDS'ye başvurun.
  12. Daha fazla ve özellikle vasküler remodeling değerlendirmek için akciğer immünokimya gerçekleştirin. Örneğin, düz kas hücre boyama damarların kasizasyonunu değerlendirmek için kullanılabilirken, von Willebrand Factor boyama endotel değişiklikleri görselleştirmek için kullanılabilir. Bu yöntemlerbaşkabir yerde 5 açıklanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde, farelerde PH'yi indükleyen Hypoxia/SU5416 modelinin oluşturulmasını ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Ayrıca, gözlem süresi nin sonunda pulmoner vasküler ve kardiyak değerlendirme nin yapılması için gerekli tüm adımları ayrıntılı olarak belirtmektedir.

Bu model için deneysel tasarıma genel bir bakış Şekil 1A13,14'tegösterilmiştir. Fareler normobarik hipoksiye maruz kalınır (10% ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, farelerde PH modelinin iki patolojik uyaranla nasıl modellendirilebildiğini açıklar: kronik hipoksi ve SU5416 enjeksiyonu (Hypoxia/SU5416)18. Bu fare modelini insan PH durumuyla ilişkilendirmek amacıyla, kaçınılmaz olarak Tablo 1'degösterilen mevcut PH sınıflandırmasına bakmak gerekir. Ph hemen hemen tüm formlarda pulmoner vazokonstriksiyon ve endotel ve düz kas hücrelerinin anormal proliferasyonu ile karakterizedir. Bu pulmoner arterlerde yüksek basınç ve sonuç olara...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan etmek için hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Amerikan Kalp Derneği (AHA- 17SDG33370112 ve 18IPA34170258) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri NIH K01 HL135474 Y.S. O.B'nin hibeleri ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Asetik asit buzulRoth3738.1
Aseton, Histoloji Sınıfı LaboratuvarDeposuVT110D
ADVantaj Basınç-Hacim SistemiTransonikADV500
Bouin çözeltisiSigmaHt10132
Koter SistemiGüzel Bilim Araçları18000-00
Bağlantı borusu ve Valfler
Pamuk Uçlu AplikatörlerCovidien8884541300
Lamelleri, 24 x50 mmRoth1871
Veri Toplama ve AnaliziEmkaiox2
Direct Red 80Sigma365548-5G
DMSO (Dimetil Sülfoksit)Sigma Aldrich276855
Kuru buz
Dumont # 5 forsepsGüzel Bilim Araçları11251-10
Dumont # 7 İnce ForsepsGüzel Bilim Araçları11274-20
Gömme kalıplarıSigma AldrichE-6032
Eosin ÇözeltisiSulu SigmaHT110216
Etanol, laboratuvar SınıfıCarolina Biyolojik Tedarik Şirketi861285
Hızlı Yeşil FCFSigmaF7252-5G
İnce makasGüzel Bilim Araçları14090-09
Keçi Serumuinvitrojen16210-064
Isıtma yastığı Gaymar T / Pompa
Hematoksilen 2Thermo Scientific7231
Hipoksik odaBiospherixA30274P
İndüksiyon odasıDRE Veteriner12570
Entübasyon kateteri (i.v. kateter SurFlash (20 G x 1") )Terumo SR * FF2025
İris makasıGüzel Bilim Araçları14084-08
İzofluranBaxterNDC-10019-360-40
İzofluran buharlaştırıcıDRE Veteriner12432
Fareler (C57BL / 6)Charles River
İğneleri 25 G x 5/8 "BD305122
OCTDoku Tek4583
PBS (Fosfat Tamponlu Salin)Corning21-031-CV
Pirik Asit-Doymuş Çözelti 1.3%SigmaP6744-1GA
Basınç hacimli kateterTransonikFTH-1212B-4018
EkartörKent ScientificSURGI-5001
Statik oksijen Kontrol Cihazı ProOx 360BiospherixP360
SU 5416Sigma AldrichS8442
Cerrahi Sütür, siyah örgülü ipek, 5.0Cerrahi Uzmanlık A.Ş.SP116
Cerrahi bant3M1527-1
Şırınga 10 mlBD303134
İğneli Şırıngalar 1 mlBD309626
Sytox Green Nuclein Asit LekesiThermo ScientificS7020
Tenotomi makasıPricon60-521
ToluolRoth9558.3
Vantilatör CWESAR-830/P
WGA Alexa Flor Termo BilimselW11261
KsilenRoth

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Galie, N., et al. 2015 ESC/ERS Guidelines for the diagnosis and treatment of pulmonary hypertension: The Joint Task Force for the Diagnosis and Treatment of Pulmonary Hypertension of the European Society of Cardiology (ESC) and the European Respiratory Society (ERS): Endorsed by: Association for European Paediatric and Congenital Cardiology (AEPC), International Society for Heart and Lung Transplantation (ISHLT). European Heart Journal. 37 (1), 67-119 (2016).
  2. Stenmark, K. R., Meyrick, B., Galie, N., Mooi, W. J., McMurtry, I. F. Animal models of pulmonary arterial hypertension: the hope for etiological discovery and pharmacological cure. American Journal of Physiology-Lung Cell Molecular Physiology. 297 (6), 1013-1032 (2009).
  3. Maarman, G., Lecour, S., Butrous, G., Thienemann, F., Sliwa, K. A comprehensive review: the evolution of animal models in pulmonary hypertension research; are we there yet. Pulmonary Circulation. 3 (4), 739-756 (2013).
  4. Gomez-Arroyo, J., et al. A brief overview of mouse models of pulmonary arterial hypertension: problems and prospects. American Journal of Physiology-Lung Cell Molecular Physiology. 302 (10), 977-991 (2012).
  5. Ciuclan, L., et al. A novel murine model of severe pulmonary arterial hypertension. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 184 (10), 1171-1182 (2011).
  6. Taraseviciene-Stewart, L., et al. Inhibition of the VEGF receptor 2 combined with chronic hypoxia causes cell death-dependent pulmonary endothelial cell proliferation and severe pulmonary hypertension. FASEB Journal. 15 (2), 427-438 (2001).
  7. Vitali, S. H., et al. The Sugen 5416/hypoxia mouse model of pulmonary hypertension revisited: long-term follow-up. Pulmonary Circulation. 4 (4), 619-629 (2014).
  8. Breen, E. C., Scadeng, M., Lai, N. C., Murray, F., Bigby, T. D. Functional magnetic resonance imaging for in vivo quantification of pulmonary hypertension in the Sugen 5416/hypoxia mouse. Experimental Physiology. 102 (3), 347-353 (2017).
  9. Wang, Z., Schreier, D. A., Hacker, T. A., Chesler, N. C. Progressive right ventricular functional and structural changes in a mouse model of pulmonary arterial hypertension. Physiological Reports. 1 (7), 00184(2013).
  10. Momcilovic, M., et al. Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer. Journal of Visualized Experiment. (137), 57167(2018).
  11. Guma, S. R., et al. Natural killer cell therapy and aerosol interleukin-2 for the treatment of osteosarcoma lung metastasis. Pediatric Blood Cancer. 61 (4), 618-626 (2014).
  12. Lattouf, R., et al. Picrosirius red staining: a useful tool to appraise collagen networks in normal and pathological tissues. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 751-758 (2014).
  13. Penumatsa, K. C., et al. Transglutaminase 2 in pulmonary and cardiac tissue remodeling in experimental pulmonary hypertension. American Journal of Physiology-Lung Cell Molecular Physiology. 313 (5), 752-762 (2017).
  14. Wang, Z., et al. Organ-level right ventricular dysfunction with preserved Frank-Starling mechanism in a mouse model of pulmonary arterial hypertension. Journal of Applied Physiology. 124 (5), 1244-1253 (2018).
  15. van de Veerdonk, M. C., Bogaard, H. J., Voelkel, N. F. The right ventricle and pulmonary hypertension. Heart Failure Reviews. 21 (3), 259-271 (2016).
  16. Emde, B., Heinen, A., Godecke, A., Bottermann, K. Wheat germ agglutinin staining as a suitable method for detection and quantification of fibrosis in cardiac tissue after myocardial infarction. European Journal of Histochemistry. 58 (4), 2448(2014).
  17. Pena, S. D., Gordon, B. B., Karpati, G., Carpenter, S. Lectin histochemistry of human skeletal muscle. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 542-546 (1981).
  18. Bueno-Beti, C., Hadri, L., Hajjar, R. J., Sassi, Y. The Sugen 5416/Hypoxia Mouse Model of Pulmonary Arterial Hypertension. Methods in Molecular Biology. 1816, 243-252 (2018).
  19. Colvin, K. L., Yeager, M. E. Animal Models of Pulmonary Hypertension: Matching Disease Mechanisms to Etiology of the Human Disease. Journal of Pulmonary and Respiratory Medicine. 4 (4), (2014).
  20. Benza, R. L., et al. Predicting survival in pulmonary arterial hypertension: insights from the Registry to Evaluate Early and Long-Term Pulmonary Arterial Hypertension Disease Management (REVEAL). Circulation. 122 (2), 164-172 (2010).
  21. Jacob, S. W., Rosenbaum, E. E. The toxicology of dimethyl sulfoxide (DMSO). Headache. 6 (3), 127-136 (1966).
  22. Jacob, S. W., Wood, D. C. Dimethyl sulfoxide (DMSO). Toxicology, pharmacology, and clinical experience. American Journal of Surgery. 114 (3), 414-426 (1967).
  23. Abraham, D., Mao, L. Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice. Journal of Visualized Experiment. (103), 52942(2015).
  24. Ma, Z., Mao, L., Rajagopal, S. Hemodynamic Characterization of Rodent Models of Pulmonary Arterial Hypertension. Journal of Visualized Experiment. (110), 53335(2016).
  25. Townsend, D. Measuring Pressure Volume Loops in the Mouse. Journal of Visualized Experiment. (111), 53810(2016).
  26. Penumatsa, K. C., Warburton, R. R., Hill, N. S., Fanburg, B. L. CrossTalk proposal: The mouse SuHx model is a good model of pulmonary arterial hypertension. Journal of Physiology. 597 (4), 975-977 (2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Pulmonary HypertensionHypoxia SU5416 ModelRight Ventricle PressureVascular RemodelingCardiomyocyte HypertrophyFulton IndexWheat Germ AgglutininOpen Chest MethodHypoxic ChamberSU5416 Injection

İlgili makaleler