Embriyonik Cardiomyocytes kuş embriyo implantasyonu Vivo için Mikroenjeksiyon tabanlı sistem

Özet

Bu yöntemde, embriyonik kalp dokuları cerrahi olarak microdissected, ayrışmış, fluorescently etiketli ve ana bilgisayar embriyonik dokuların implante vardır. Bu kişi veya doku düzeyinde gelişimsel organizasyon ektopik hemodinamik koşullar ve/veya değiştirilmiş parakrin/juxtacrine ortamlar altında eğitimi için bir platform sağlar.

Özet

Hücre hücre lineage belirlenmesi üzerinde dışsal microenvironmental etkisi karşı özerk desenlendirme göreli etkisini yorumlama gelişim Biyolojisi Araştırma Genel mücadelesine temsil eder. Embriyonik kalbinde bu transkripsiyon regülatör, parakrin/juxtacrine sinyal cues, ifadesinde bölgesel farklılıklar özellikle zor olabilir ve hemodinamik kuvvet tüm bilinen cardiomyocyte olgunlaşma etkilemek için. Bir gelişmekte olan cardiomyocyte'nın moleküler ve biyomekanik microenvironment değiştirmek için basitleştirilmiş bir yöntem bu nedenle, nasıl yerel koşullar etkisi hücre kader ve işlevi incelemek için güçlü bir teknik olarak hizmet verecek. Bu sorunu çözmek için fiziksel olarak kalp veya çevreleyen embriyonik doku ektopik konumlara Juvenil cardiomyocytes nakli için bir yöntem optimize. Bu nasıl microenvironmental koşulları etkisi cardiomyocyte kader geçişler olduğu gibi embriyo içinde tek hücre çözünürlükte incelemek için bize sağlar. Burada, biz hangi embriyonik miyositler olabilir kalp alt etki alanları çeşitli izole, ayrışmış, fluorescently etiketli ve ana bilgisayar embriyo yüksek hassasiyetle içine microinjected bir protokol tanımlamak. Hücreleri sonra doğrudan yerinde çeşitli görüntüleme ve histolojik teknikler kullanarak analiz edilebilir. Bu iletişim kuralı kalp gibi hareketli bir doku aşırı derecede zor olabilir geleneksel aşılama deneyler için güçlü bir alternatiftir. Bu yöntemin genel da donör doku ve ana bilgisayar ortamları çeşitli ve onun rahatlık-in kullanma, düşük maliyetli, adapte olabilir ve hızlı gelişim çalışmaları çeşitli için potansiyel olarak yararlı bir uygulama yapmak.

Giriş

Kardiyak gelişimsel araştırma son derece birçok gen düzenleyici ağların bu deseni farklı hücre soy ve kalbinde işlevsel etki alanları belirledik germline transgenik model sistemleri gelişiyle gelen benefitted. Nasıl bu gen ağlar ile etkileşim ve microenvironmental koşullara cevap ancak, tanımlayan parakrin/juxtacrine sinyalleri ve biyofiziksel girişleri (streç, zorlanma, hemodinamik akışı) de dahil olmak üzere, zor olabilir. Bu nedenle, her zaman bir hücresel fenotip kardiyak biyomekanik veya daha yüksek sipariş doku kompozisyon^{1,2 değişiklikleri için genetik pertürbasyon doğrudan bir sonucu olarak veya bir adaptasyon ikincil bir sonucu olarak doğar olup olmadığını belirlemek kolay değil} .

Klasik adres kavramları kader belirtimi için kullanılmıştır, deneyler aşılama bağlılık, indüksiyon ve yetkinlik^3,4, bazı doğasında sorunları aşmak için ideal bir yaklaşım temsil eder hücre çevresel etkisi karşı özerk kalbinden tanımlama. Ne yazık ki, kalp kasılma standart aşılama yaklaşımlar zorlaştırabilir. Hızlı hareket doku kez kalbe bağlı kalarak aşılı hücreleri önler ve büyük doku deliyor (normalde aşılama için gerekli) sık sık kalp yetmezliği ve embriyonik ölümcül^5,6,7yol açar. Bu nedenle, biz basınç tabanlı geliştirdik, mikroenjeksiyon sistemi hassas hücresel implantasyon doku aşılama teknik engellerin engellemeyi gelişmekte olan piliç kalbine için daha önce açıklanan^8,9. Bu tekniği kullanarak, bireysel veya küçük gruplar bir donör embriyo izole kalp hücrelerinin geniş ana bilgisayar hazırlık ve kullanarak ortaya çıkan büyük doku hakaret ihtiyacını ortadan kaldırarak bir ana bilgisayar embriyonik kalp bölgelerinde çeşitli içine microinjected Standart aşılama teknikleri. Bir dış çapı bu implantasyon çalışmaları için kullanılan mikroenjeksiyon iğneler var ~ iğne doğrudan hedef dokuda yerleştirilmesi 30−40 µm (yani, embriyonik miyokard duvar nüfuz) ve hücre focally ile teslim çevreleyen doku çok az hasar. Protokol izotopik, heterotopik, isochoric ve heterochronic manipülasyonlar, doğrudan gelişmekte olan klasik deneysel Embriyoda paradigmalar incelemek için hızlı, esnek ve düşük maliyetli bir yaklaşım sağlayan çeşitli gerçekleştirmek için kullanılabilir dört odacıklı kalp.

Aşağıda özetlenen iletişim kuralında, biz gerçek zamanlı olarak izlenecek mikroenjeksiyon deney başarısı için sağlayan bir hücre permeant floresan boya, hücrelerle donör etiket ve herhangi için gerek kalmadan belgelenmeliydi engrafted hücrelerin konumunu ek boyama. Ancak, bu yaklaşım floresan boya hücre bölünmesi kaybolabilir kısa süreli deneyler (yaklaşık 48 saat) için en uygun olduğunu belirtmek gerekir. Alternatif yaklaşımlar daha uzun süreli deneyler için kullanılabilir.

Kalp geliştirme bağlamında bu teknik bulunuyorlar iken, biz bu büyük etkisi hücre implantasyonu deneyler için mesoderm, baş, bacaklarda ve somites kullandık. Bu nedenle aşağıda açıklanan temel yaklaşım son derece uysal ve çeşitli organ sistemleri kullanılabilir.

Protokol

Tüm yöntem tanımlamak hayvan bakımı yönergeleri, University of North Carolina Chapel Hill uygun.

1. mikro-enjeksiyon pipetler hazırlanması

1. Cam kılcal bir micropipette çektirmenin kullanarak çekin. Yapısal kirleri yoksun son derece keskin bir yüzey sağlar gibi bazı enjeksiyonlar için iğne eğim önerilir. Bunu yapmak için 15−20 min için 45 ° açılı beveling direksiyona iğne çekti sonuna Lehçe.
   Not: çekmek için tam ayarları kullanılan çektirme göre değişir. Eğimin son iç çapını 20−40 µm arasında olmalıdır.
2. Silikon ile kılcal cam iç ve dış yüzeylerin kat. İlk siliconizing Agent'taki iğne ve sonra backload siliconizing Ajan çözüm iç yüzeyi kat için her micropipette içine dış yüzeyinin kat için iğne batır.
   Not: Kaplama cam kapiller 24 h implantasyon deneme önce yapılmalıdır. Cam kılcal silikon ile kaplama cama kimyasal olarak inert bir yüzey sağlar. Kılcal bırakılırsa tedavi edilmezse, sonraki adımda oluşturulan hücre süspansiyon uygun cam ve iğne takın. Bu nedenle, kaplama gerekli ve yöntemin başarısı için çok önemli.
   Dikkat: Siliconizing aracı hazır piyasada bulunan heptane ve 1,7-dichloro-1,1,3,3,5,5,7,7-octamethyltetrasiloxane (Malzeme tablo) karışımıdır. Bu son derece yanıcı ve akut toksik olduğunu. Her zaman bir duman başlık içinde uygun KKE ele.
   1. Backload iğne için yük ~ 5−10 µL bir mikro-enjeksiyon pipet ucu (Tablo reçetesi) içine siliconizing Aracısı. Mikro-enjeksiyon ipucu çekti cam geniş sonuna kapiller yerleştirmek ve ucu kadar aşağı (yakın cam iğne ucu) mümkün olduğunca konumlandırın. Siliconizing aracı iğne hava kabarcıkları en aza indirmek için yavaş yavaş yükleme pipet kaldırılırken çıkarma.
   2. Cam iğne 10 dakika içinde siliconizing Ajan bırakın, yeni bir yükleme pipet ile alıyorum tarafından kaldırmak ve iğneler gecede bir duman mahallede kuru izin.
3. Deneme, sabah cam kılcal aşağıdaki yordamı adım 1.2 deiyonize suyla durulayın ve 3−4 h için kurumasını sağlar.

2. çözümler hazırlanması

1. 5 mL 4,2 mL Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal orta ve Ham'ın besin karışımı F12 (DMEM/F12) 750 µL, Fetal sığır Serum (FBS) ve penisilin/streptomisin 50 µL ilave tarafından çözüm nötralize tripsin de hazırlayın. 37 ° C'de kullanmak kadar saklamak.
2. 5 hazırlamak Hank'in 995 µL boya (içinde dimetil sülfoksit [DMSO], Malzemeler tablo) etiketleme 1 mM stokunun pipetting 5 µL tarafından boya çözüm etiketleme µM dengeli tuz solüsyonu (HBSS). 1 dk ve mağaza kullanımı kadar 37 ° C'de için girdap.
3. Taze paraformaldehyde (PFA) 10 mL % 32 İngiltere'de yılın stok çözeltisi 62 mL moleküler biyoloji sınıf su ve Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz çözeltisi (DPBS) x 10 8 mL ile birleştirerek hazırlayın. Son konsantrasyonu % 4 olduğunu İngiltere'de yılın 1 x DPBS içinde.

3. ana bilgisayar embriyo hazırlanması

1. 38 ° C kadar Hamburger ve Hamilton (HH) sahne 19¹⁰oksijen bir kuluçka yatay yönde verimli tavuk yumurtası kuluçkaya.
   Not: manipülasyon için seçilen sahne esnek ve her bireysel deney amacı tamamen bağımlı değil.
2. Küçük bir delik yapmak için açılı forseps kullanarak yumurta Ekvatordaki yumurta kabuğu "düz" sonu puan edinildi > 1 mm çapında. Bir 18 G iğne ponksiyon yoluyla ekli 10 mL şırınga ekleyebilir veya albümin ~ 5 mL kaldırabilir.
   Not: Bu anatomik konum "hava hücre" yumurta içinde dışında ve albümin ponksiyon yapıldıktan sonra sızıntı tutar. "Embriyo yumurta kabuğu, sonraki adımda potansiyel hasar önleme uzak damla olarak" Bu adım önerilir.
3. Saydam bandı yumurta kabuğu uygulamak. Açılı forseps ile puan ve eğri tenotomy makas kullanarak bir ~2.5 cm pencere kesmek.
4. İncelemek ve Hamburger ve Hamilton¹⁰ tarafından belirlenen ölçütlere göre embriyo sahne ve ponksiyon adım 3.2 şeffaf bant ile mühür.
   Not: Burada, 37−40 somites uzanan kuyruk tomurcuk haline sahip sahne HH 19 embriyo kullanılmıştır. Pencerenin yumurta (adım 3.3) üst kısmında açıldıktan sonra delik kadar kapalı olmalıdır değil.
5. ~ 200 µL ekli 1 mL şırınga ile 32 G iğne kullanarak embriyo altında (1:5) çini mürekkebi/HBSS karışımı enjekte.
   Not: çini mürekkebi embriyo ve sarısı altında arasındaki görsel kontrast sağlar. Alternatif tarafsız kırmızı veya piyasada bulunan Camgöbeği floresan gibi protein (CFP) boya veya mavi flüoresan protein (BFP) Floresan filtre setleri karşıtlığı artırmak için kullanılabilir.
6. HBSS 1 mL dropwise embriyonik diskin üzerine ekleyin ve parafin film ile pencereli kabukları mühür. Yumurta enjeksiyon için hazır kadar geri oksijen kuluçka makinesine koyun.

4. yalıtım donör doku

1. Donör verimli tavuk yumurta 38 ° c oksijen bir kuluçka sahne HH 19 (veya istediğiniz sahne) kadar kuluçkaya.
2. Embriyonun yumurtadan kaldırmak ve steril HBSS oda sıcaklığında (RT) içeren 100 mm x 15 mm petri kabına yerleştirin.
3. Cerrahi olarak microdissect atriyal donör dokudan ilk embriyo tüm embriyonik kalp yalıtma ve sonra kalp kulakçık izole ederek forseps, tenotomy makas ve microspatula bir stereo diseksiyon mikroskop altında kullanarak her embriyo. HBSS buz üzerinde 1 mL içeren bir steril 1.5 mL microcentrifuge tüp havuzda.
4. Bir kez toplanan tüm donör doku doku tarafından Santrifüjü 1000 x g sabit açılı microcentrifuge 4 ° C'de 5 min için de cips.

5. tripsin sindirim donör doku

1. Hücre topakları 1 mL prewarmed % 0.05 tripsin-EDTA resuspend ve sallayarak ısı taşını 300 devirde 15 dakika 37 ° C'de kuluçkaya. Alternatif olarak, bir su banyosu örnek periyodik ajitasyon ile kullanın.
2. Yukarı ve aşağı kalan herhangi bir doku kırmaya ve adım 4.4 olduğu gibi cips sindirim çözüm pipette.
3. Pelet çözüm ve santrifüj olduğu gibi adım 4.4 nötralize tripsin 1 ml resuspend.
4. Kırmızı floresan boya çözüm etiketleme 400 µL hücrelerde resuspend ve 37 ° c ısı blok içinde 20 dk için kuluçkaya. Alternatif olarak, bir su banyosu kullanın.
5. Etiketleme reaksiyon tamamlandıktan sonra hücre adım 4.4 olduğu gibi cips ve 1 mL HBSS (sayı 1 ile 3 adımları değiştirilebilir yıkama) ile yıkayın.
6. ~ 50.000 hücreleri/hangi genel olarak 5−10 µL çalışma birimdeki bağlı olarak toplam hücre verim sonuçları µL, konsantrasyon, etiketli, pelleted hücreleri resuspend.
   Not: Hücre konsantrasyonları aşağıda ~ 50.000 hücre/µL zavallı enjeksiyon verimliliği neden olabilir.

6. In-vivo enjeksiyon

1. Backload hücre süspansiyon içine adım 1.2 prosedürleri aşağıdaki silikon tedavi cam kılcal bir pipet. Pipet basınç microinjector aparatı monte.
2. Ana bilgisayar embriyo oksijen kuluçka çıkarın ve bir yumurta tutucu floresan stereo diseksiyon mikroskop altında yerleştirin.
   1. Vitelline membran steril iyi forseps kullanarak açın ve küçük bir insizyon attım (~0.5−1.0 mm uzunluğunda) kalp zarını içinde olun. Ek işleme/diseksiyon bağlı olarak hedef bölge enjeksiyon için gerekli olabilir.
3. Öyle ki hedef doku mikroenjeksiyon iğne ucu nüfuz microinjector getirin.
   1. Basınç hücreleri enjekte ve floresan etiket implante hücreleri istenen dokuda mevcut olduğunu belirlemek için kullanın. Tipik enjeksiyonlar için 0,5'den küçük tek darbeleri uygulamak basınç 100-400 hectopascals arasında değişen süre s.
      Not: Pulse uzunluğu ve mutlak basınç enjekte edilir hücre sayısına bağlı olarak değişir ve bireysel ihtiyaçlarına uygun şekilde değiştirilebilir.
   2. Microinjector aparatı geri çekmek ve basınç enjekte sonra sahibinden yumurta kaldırın.
4. 1 mL sıcak HBSS dropwise embriyo ekleyin, şeffaf ambalaj bant kullanarak yumurta mühür ve 24 h posta implantasyon için 38 ° C'de kuluçka oksijen kuluçkaya.

7. izolasyon ve analiz

1. RT HBSS forseps, tenotomy makas ve microspatula 4.3 adıma benzer kullanarak ana bilgisayar embriyolar izole ve %4 PFA gecede 4 ° c hafif sallanan ile düzeltin.
2. Embriyo 3 x 5 dk HBSS RT, hafif sallanan ile yıkayın ve daha fazla aşağı akım analiz (mikroskopi, immünhistokimya, in-situ hibridizasyon, vb) 4 ° C'de HBSS içinde saklayın.

Sonuçlar

24 saat kuluçka, kalp ve surround doku konağın sonra embriyolar izole edildi, (Şekil 1A) fotoğraflandı ve immünfloresan analiz için işlenmiş. Bu örnekte, donör atriyal miyositler benzer bir aşamalı ana proepicardium microinjected embriyo. Ana bilgisayar embriyo sonra kas marker (MF20 yeşil) ile 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; mavi) lekeli ve. Enjekte (kırmızı) açıkça görülebilir (Şekil 1B) hücrelerdir. Hücreleri görünür olmayan dikkate almak olası ayarlamalar içerir: donör doku üzerinde sindirmek (hücreleri eklemek mümkün olurdu), boya çözüm etiketleme çok seyreltik, hücreleri aşırı soluk veya birden çok hücre bölünmeler etiket kaybına neden.

Bu örnekte eklenen hücreleri miyokardiyal onaylamak için optik confocal mikroskop (Şekil 1C-E) kullanarak bu embriyo kesitli. Tek MF20 pozitif hücrelerinin proepicardium (PE) içinde focally implante edildi floresan kırmızı pozitif hücreler vardır.

Resim 1 : Temsilcisi görüntüleri embriyolar izole 24 saat mesaj enjeksiyon. (A)düşük büyütme aydınlık alan görüntü bir E3.5 (HH sahne 19) civciv embriyo gövde bölgesinin. (B) enjekte birleştirilmiş görüntü gösteren hücreleri (kırmızı), cardiomyocytes (yeşil) ve DAPI. Hücreleri kulakçık izole edildi ve proepicardium microinjected. (C) yüksek büyütme confocal görüntüleme gösterilen özünü proepicardium hücreler etiketli. (D) yüksek büyütme confocal görüntüleme CT kırmızı etiketli hücreleri teyit cardiomyocytes vardır. (E) panelleri D ve Eeklenen hücreleri üç boyutlu (3D) yeniden inşası. Atria, Gerçekten, çıkış yolu; PE, proepicardium; VT, ventrikül; MF20, Myosin 4. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışma

Nasıl microenvironmental koşulları etkisi kardiyak hücre kader belirtimi ve soyu sabitleme tanımlama yeteneği konjenital kalp hastalığının verimli iletişim kuralları için uygun geliştirmek için de basınç bir anlayış yaratmak için esastır kök hücre veya somatik hücre REPROGRAMING tabanlı cardiomyocytes olgunlaşma. Protokol içinde vivo koşullarda hücre özerk olgunlaşma süreçleri parakrin/juxtacrine ve/veya hemodinamik ipuçları ayrı kalmak için izin, doğrudan kalp hücre gelişimi altında tahlil yeteneği değişmiş müfettişler verir özetlenen. Yüksek kararlılık düşsel, genetik analiz ve fizyolojik deneyleri ile birleştirildiğinde, bu teknik varolan transgenik modelleri güçlü bir tamamlayıcı olarak hizmet verebilir.

Teknik stand noktası formu, verimli yalıtım, etiketleme ve donör kalp hücreleri hassas implantasyonu ana bilgisayar embriyonik dokuların içine burada sunulan protokolü kullanır. Mikroenjeksiyon sistemi büyük ölçüde donör hücreleri hedefleme yardımcı olur ve bir büyük engraftment site ana bilgisayar doku oluşturmak için gerek kalmadan başarılı implantasyonu için sağlar. Bazı operasyonel beceri bu teknik ancak, gerçekleştirmek için gereken enjeksiyon iğne dikkatle (kalp ya da yerel damarlara yırtılması neden) hedef dokuda koymamış durumunda azaltılmış canlılık neden olabilir. Bakım ve düşünce de yalıtım ve etiketleme adımları verilmelidir. Donör sindirim üzerinde doku zavallı implantasyon verimlilik için yol açabilir ve teknikleri etiketleme geçici (hücre bölünmesi etiket seyreltik olabilir gibi) üzerinde donör hücreleri izlenebilir zaman penceresi sınırlayabilirsiniz.

Bu teknik son derece değiştirilebilir ve çok çeşitli amaçlar için adapte edilebilir. Örneğin, çok sayıda doku ve etap hücrelerden (enzimatik sindirim duruma getirilmesi gerekli olmasına rağmen) izole edilmesi ve benzer şekilde yapabilirsiniz donör farklı gelişim aşamalarında ana bilgisayar dokular çeşitli içine enjekte edilir. Benzer şekilde, etiketleme yaklaşımı hücreleri floresan inorganik yarı iletken nanocrystals artık bu geçici etiketleme için kullanımı ve bıldırcın hücreleri ya da yeşil hücre implantasyonu dahil olmak üzere farklı zamansal pencereler arasında izlemek için değiştirilebilir permeant etiketleme floresan proteini transgenic (GFP +) donör embriyolar için¹¹ .

Biz şu anda bu teknik kuş implantasyon çalışmaları için kullanırken, bu gelecekte chimeric çalışmalar geniş bir yelpazesi için kullanılan olabilir hissediyorum. Örneğin, transgenik organizmalar genetiği değiştirilmiş kalp hücreleri izole olabilir ve çok benzer bir iletişim kuralı kullanılarak kuş kalbine microinjected. Ayrıca, cardiomyocytes içine farklılaşmış hücreler hücreleri kaynaklanıyor veya somatik hücre ile yaklaşımlar REPROGRAMING doku ve/veya olgunlaşma biyomekanik içinde vivo altında kendi entegrasyon değerlendirmek için embriyonik kalp içine microinjected koşullar.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1 mL İnsülin Şırıngası	BD	329654
1.7 mL Mikrotüpler, Clear	Genesee Scientific	24-282
10 ml Şırınga	BD	305482
1000ul Reach Bariyer Ucu Raflı, Steril	Genesee Scientific	24-430
15 mL Santrifüj Tüpleri, Raflı	Genesee Scientific	28-101
1588 Genesis Hova-Bator İnkübatör	GQF	813927021221
18G x 1 1/2 İğne	BD	305196
200ul Bariyer Ucu Düşük Bağlamalı, Raflı, Steril	Genesee Scientific	24-412
32G x 1/2" İğne	TSK Steriject Air-Tite	TSK3213
Alkol Mendili %70	Thermo Fisher Scientific	19015744
Açılı Forseps	İnce Bilimsel Araçlar	11260-20
Geri Yükleme İpuçları	Eppendorf	930001007
Siyah Hindistan Mürekkebi	KOH-I-NOOR	3084-F
CellTracker Yeşil CMF	Thermo Fisher Scientific	C7025	DMSO CellTracker'da 1 mM
Kırmızı CMTPX	Thermo Fisher Scientific	C34552	DMSO Santrifüjde 1 mM
	Eppendorf	5424R
Ticari Sınıf Ambalaj Bandı	Zımba	2619001
Kavisli Tenotomi Makası	İnce Bilimsel Araçlar	14067-11
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	11330-032
DMSO, susuz	Thermo Fisher Scientific	D12345
DPBS (10X), kalsiyum yok, magnezyum Thermo	Fisher Scientific	14025092
Femtojet 4i	Eppendorf	5252000021
Fetal Sığır Serumu	Thermo Fisher Scientific	10437-028
Kuluçkalık Yumurtalar	Pilgrim's Hatchery	-
HBSS, kalsiyum, magnezyum, fenol kırmızısı yok	Thermo Fisher Scientific	14025-092
Injectman 4	Eppendorf	5192000027D
Mikromanipülatör	Leica Microsystems
Parafilm	SIGMA	P6543-1EA
Sulu çözeltide paraformaldehit %32, EM Sınıfı	VWR	100496-496
Penisilin / Streptomisin	Thermo Fisher Scientific	15140-022
Petri Kabı	Genesee Scientific	32-107
Pipet Öğütücü	Narishige	EG-44
Pipet Çektirme	HEKA	PIP 6
Scotch Şeffaf Bant	Zımba	487909
Sigmacote	SIGMA	SL2-25ML
Stereo Mikroskop	Leica	-
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000023
İnce Duvar Cam Kılcal	Damarlar Dünya Hassas Aletler	TW100F-4
Transfer Pipeti	Thermo Fisher Scientific	273
Tripsin-EDTA (%0,05), fenol kırmızısı	Thermo Fisher Scientific	25300-054