Method Article

Üç boyutlu kemik hücre dışı matriks modeli osteosarkom için

DOI:

10.3791/59271

⸱

April 12th, 2019

 ,  , 
1MOE Key Laboratory of Gene Function and Regulation, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kemik hücre dışı Matriks (BEM) modeli osteosarkom (OS) için de kurulan ve gösterilen işte. Bu uygun bir iskele birincil tümör büyüme vitro taklit ve OS histolojik ve cytogenic heterojenlik eğitim için ideal bir model sağlamak için kullanılabilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Osteosarkom (OS) en yaygın ve çok agresif birincil kemik tümörü var. Bu tanılama ya da prognostik zorluklar ile birlikte histolojik ve anatomik varyasyonlar ile karakterizedir. İşletim sistemi genotypically ve phenotypically türdeş olmayan kanser hücreleri oluşur. Kemik microenvironment öğeleri hesabına tümör heterojenite ve hastalık ilerleme için kanıtlanmıştır. Kemik hücre dışı Matriks (BEM) microstructural Matrisler ve biyokimyasal yerel hücre dışı matriks bileşenlerinin korur. Bu doku özel niş bir olumlu ve uzun vadeli iskele OS hücre tohum ve yayılması için sağlar. Bu makalede, BEM modeli ve daha fazla deneysel uygulama hazırlanması için bir iletişim kuralı sağlar. İşletim sistemi hücreleri büyümek ve birden çok fenotipleri OS klinik örneklerin histopatolojik karmaşıklığı ile tutarlı içine ayırt etmek. Model aynı zamanda çeşitli türleri morfoloji ve onların dernek genetik değişiklikler ve temel düzenleyici mekanizmaları ile görselleştirme sağlar. İnsan OS için homolog olarak bu BEM-OS model olabilir geliştirilen ve patoloji ve klinik araştırma OS için uygulanır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Osteosarkom (OS) genellikle alanları, uzun kemikler, metaphysis ergenlik döneminde aktif büyüyen oluşur. OS etkilenen sitelerin % 80'den fazla proksimal tibia ve proksimal humerus hem de büyüme plaka1konumuna karşılık gelen distal ve proksimal femur metaphysis için tercih var. OS Mezenkimal özellikleri ve histolojik özellikleri ve sınıf içinde önemli çeşitlilik ile birden çok hücre alt türlerinden oluşur. Delillerin Mezenkimal Kök hücre (MSCs), dokusunu taahhüt öncüleri ve perisitlerden kökenli2,3,4,5hücreler olarak destekler. Bu hücreler genetik veya epigenetik değişiklikler birikir ve çıkmasına OS için bazı kemik microenvironmental sinyalleri etkisi altında. İçsel ve dışsal mekanizmaları genomik istikrarsızlık ve OS, heterojen birden çok morfolojik ve klinik fenotipleri6,7ile sonuçlanır. Bireyselleştirilmiş tedavi veya yeni uyuşturucu testi ile taranması için roman modelleri heterojenite veya diğer klinik bozukluklar karşı oluşturulması gerekiyor.

İşletim sistemi bir intra kemik Malign solid tümör var. Karmaşıklığı ve microenvironment öğeleri çevresindeki etkinlik fenotipik ve işlevsel farklılıklar üzerine farklı yerlerde tümör hücrelerinde OS görüşmek. Kemik hücre dışı Matriks (BEM) bir yapısal ve biyokimyasal iskele mineral ifade ve kemik remodeling için sağlar. Hücre dışı Matriks (ECM) organik bölümünü esas oluşur türü ben iken, mineralized kısmı Kalsiyum fosfat hidroksiapatit8şeklinde oluşan osteoblastik lineage hücreleri tarafından salgılanan kollajen. ECM ağlar dinamik rolü hücre adezyon düzenlemektir, farklılaşma, çapraz-hadis ve doku bakım9fonksiyonu.

Demineralize BEM ve ECM hydrogels başarılı bir şekilde hücre kültüründe kullanılmıştır ve Hücre proliferasyonu10,11geliştirebilirsiniz. Yapay kemik gibi ECM havuz boyutu, kader karar ve soy ilerleme MSCs12,13,14düzenleyen. Ayrıca, sonuçları Osteojenik etkinlik kemik oluşumu ve rejenerasyon15,16,17sırasında uyarıcı hücresel süreçler tarafından sağlamak için klinik önemini kanıtlar.

Bu makalede, bizim grup değiştirilmiş modeli ve üç boyutlu uzun vadeli kültür için uygun bir alternatif oluşturur. İşletim sistemi hücreleri doku kaynaklı BEM enjekte heterogeneously Mezenkimal fenotip kolayca plastik iki boyutlu kültürleri ile karşılaştırıldığında sunuyoruz. İşletim sistemi yerel bir niş olmak vitro hücreleri ve OS teorik ve klinik araştırmalarda büyük bir potansiyele sahip BEM siteye özgü homolog doku gösterisinden dramatik avantajı elde. Bu karakterize BEM platform basit ama verimli vitro araştırma ve birden fazla kanser modelleme uzatılabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan bakım ve kullanım Ulusal Sağlık Rehberi Enstitüleri göre bakım ve kullanmak, laboratuvar hayvanları (NIH yayın NO.80-23, 1996 yılında revize) hayvan Etik Komitesi, Sun Yat-Sen'in Üniversitesi onayını sonra yapılmaktadır.

1. kemik hazırlık

  1. 4'e 6-hafta-yaşlı BALB/c fare (olmadan seks özel gereksinim) edinin. Bir fare aseptik tarafından servikal çıkığı ötenazi ve taze fibula, tibia ve uyluk bir hindlimb üzerinden steril cerrahi makasla kesti. Epitel doku soyma ve çok yumuşak doku makas ve cımbız kullanarak mümkün olduğunca kaldırın.
  2. Bacak kemikleri steril 10 mM fosfat tamponlu tuz iki kez kan bir 6 cm tabak içinde kaldırmak için (PBS) ile yıkayın. 3 min için % 75 etanol kemiklerde bırakın sonra PBS ile iki kez durulayın. Temiz kemikler için gerekli kadar ay steril 50 mL santrifüj tüpü-80 ° C'de steril PBS ile saklanabilir.
    Not: Aşağıdaki adımlarda kullanılan PBS 10 mM PO43−vardır.

2. kemik Demineralizasyon ve decellularization

  1. Oda sıcaklığında donmuş kemikleri çözülme ve 1 h. konu için kemikleri için en fazla 2-3 donma-çözülme çevrimleri hücre lizis ve doku dökümünü-80 ° C'de tekrar donmasına.
  2. 0,5 ile steril 50 mL santrifüj tüpü kemiklerde kuluçkaya N HCl gecede, oda sıcaklığında hafif sallanan/sallayarak ile sallanan bir platform veya orbital shaker üzerinde kemik tam ve hatta kapsama sağlamak için.
    Not: kemikler tamamen asit hareket sırasında daldırılır ve işlemi sırasında razı değil emin olun. Birimin HCl bir çözüm olarak bu kemiklerin on katından fazla olmalıdır.
  3. Kalsiyumun sonra tamamen HCl çözüm dikkatle boşaltmak ve durulama 1 h için suyun altına. Sonra kemikler üzerinde sallanan bir platform veya orbital shaker distile su ile yıkama başına 15 dk için iki kere yıkayın.
    Not: çözüm veya su yıkama arasında ve son yıkama sonra distile su ile tamamen kaldırdığınızdan emin olun.
  4. Metanol 1:1 karışımı ile demineralize kemik lipidler ve kloroform oda sıcaklığında101 h için kalay folyo ile sarılmış bir 50 mL santrifüj tüp ayıklayın.
  5. Sonra başka bir tüp ile 30 dakika süreyle kalay folyo sarılı metanol, içine kemik metanol tamamen kaldırmak ve ile durulayın transfer distile su ile hafifçe sallayarak 15dk için iki kez. Son yıkama suyu dikkatle boşaltmak ve steril koşul altında aşağıdaki adımlarla devam edin.
    Not: ayıklama adımı sırasında ışık kloroform ayrışma önlemek için kaçınılması gerekir. Karışımı ışık dayanıklı kap içinde saklanabilir veya kalay folyo ile bir santrifüj tüpü sarılmış. Tüm tedavi gerçekleştirmek ve adımları mütevazı döndürme veya hareket sallanan altında yıkayın.
  6. 3 min için steril PBS ile 6 cm çanak kemikleri durulayın ve sonra yeni bir 50 mL santrifüj tüpüne kemikleri aktarın. 40 mL steril % 0.05 tripsin-EDTA (TE) tüpün içine ekleyin ve kemikleri CO2 kuluçka 37 ° C1823 h için kuluçkaya.
  7. TE çözüm atın ve iki kez 90 μg/mL Ampisilin ve 90 μg/mL sefaloridin ile steril PBS ile durulayın. Son decanting sonra PBS tamamen yıka, 40 mL steril PBS ile doldurmak. 24 saat oda sıcaklığında hafif sallanan veya antibiyotik ıslatmak sallayarak için iyice yıkayın.
    Not: Bu ve aşağıdaki adımları kullanılan steril PBS 90 μg/mL Ampisilin ve 90 μg/mL sefaloridin içerir. Gece yıkama döndürme veya hareket sallanan altında uzun süre antibiyotik etkili sterilizasyon gözenek mekanların ulaşmak için kapsamlı daldırma yapılma.
  8. Ve steril PBS ile dolu bir taze 50 mL santrifüj tüpü içine kemikleri transfer PBS çıkarın. Hazırlanan demineralize ve decellularized kemik kemik hücre dışı Matriks (BEM) olarak adlandırılır ve 4 ° C'de 2 gerekli kadar ay saklanabilir okunur.

3. hücre tohum ve kültür

  1. BEM 4 ° C buzdolabından alın ve o % 75 etanol 30 s sonra PBS ile durulama için iki kez bırakın. BEM temiz 6-şey hücre kültür plaka üzerine aktarın. 2 mL tam kültür orta (Dulbecco'nın kartal orta/F12 (DF12) % 5 fetal sığır serum, 90 μg/mL Ampisilin ve 90 μg/mL sefaloridin içeren değiştirilmiş) ekleyin. BEM CO2 kuluçka 37 ° C'de geceleme kuluçkaya
  2. İnsan OS hücre hatları (MNNG/HOS ve MG-63) edinin. Yaklaşık 1.0 x 105 işletim sistemi hücreleri içeren fenol red göstergesi olarak 100 μL PBS ile askıya alma.
    Not: daha iyi izlemek ve çok katmanlı hücreleri üç boyutlu BEM modeli içinde gözlemlemek için MNNG/HOS ve MG-63 lentiviral vektör floresan mCherry ve yeşil flüoresan protein (GFP) ifade ile bulaşmış.
  3. BEM tam ortamda batırılmış sonra iğne BEM medüller boşluğuna eriştiğinde OS hücreleri distal veya proksimal epifiz BEM enjekte. OS-BEM modeli en az oksijen %5 2 h kuluçkaya CO2 atmosfer 37 ° C'de enjekte hücreleri sıkıca bağlı BEM için emin olmak için.
    Not: hücre kültürü için kullanılan tüm medya önceden ısıtmak. Hücre kültürü için kullanılan kuluçka bir oksijen vardır % 5 CO2 atmosfer 37 ° C'de
  4. 1 mL tam kültür orta tamamen BEM kültüründe gecede CO2 kuluçka 37 ° C'de yüzey kat için plaka içine ekleme
  5. Transfer OS-BEM modeli 6-şey plaka refeed 1 mL taze kültür orta bir steril cımbız ile yeni bir kuyuya yavaşça. Model 37 ° C'de CO2 kuluçka 14 gün boyunca kültür ve işletim sistemi hücrelerinin proliferasyonu duruma göre kültür orta yenileyin.
  6. Orta renk ve hücre durumu ters floresan mikroskop altında kültür işlemi sırasında izleme tutmak. Yavaşça OS hücreleri plakasına genişlettiğinizde, OS-BEM modeli de steril cımbız ile yeni diğerine aktarın.
    Not: Kültür orta pH 7.4, parlak kırmızı olan en memeli hücre kültürü için optimum pH değeri olmasıdır. Orta turuncu ya da sarı dönüşürse, hemen OS hücreler için sağlıklı bir ortam sağlamak için orta yenilemek.
  7. OS-BEM modeli yeni bir kuyuya cımbızla aktarmak ve yavaşça kültür orta kaldırmak için PBS ile durulayın. Sonra bir 15 mL santrifüj tüpüne aktarmak ve histolojik tanımlama için arabelleğe alınan % 10 formalin ile düzeltmek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Demineralizasyon ve decellularization sonra BEM daha güçlü esneklik ve yerel fare kemiğe göre azim ile yarı saydam olarak düşünülür. Küçük kas kalıntı ve medüller kavite boşluk (şekil 1A, B) açıkça görülebilmektedir. BEM etkili decellularization belirlemek için BEM fiksasyon sonra parafin içinde gömülü olup Hematoksilen-Eozin (H & E) boyama için 3-5 mikron bölümlere dilimlenmiş. Hücre çekirdeği ayrıntılı kaldırılması parlak alan görüntüleme tarafından gösterilir. Doğal g...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genel olarak, işletim sistemi olarak osteoblastik sınıflandırılabilir, chondroblastic ve fibroblastic alt türlerinden bağlı olarak kendi baskın histolojik bileşeni. Onun prognoz sadece ama aynı zamanda anatomik kendi sitesindeki histolojik parametreleri bağlıdır. Kemik ve extraosseous siteleri19yüzeylerde (intramedüller veya intracortical bölme), kemikleri içinde ortaya çıkabilir. Ortaya çıkması ve OS heterojen bir fiil oncogenic olaylar ve uzak organlara20,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar destek Liuying Chen için onun yönetim yardım ve uzun Zhao kemik hücre dışı matriks iskele inşaatı sırasında onun mükemmel teknik destek için değer. Bu çalışmada hibe Ulusal doğal Bilim Vakfı, Çin'den (31871413) tarafından desteklenmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL santrifüj tüpüGreiner188271
50 mL santrifüj tüpüGreiner227270
6 cm hücre kültürü kabıGreiner628160
6 oyuklu plakaGreiner657160
AmpisilinSigma-AldrichA9393
C57-BL/6J fareSun Yat-sen Üniversitesi Laboratuvarı Hayvan Merkezi
CO2 inkübatörüSHEL LABSCO5A
Dibazik sodyum fosfatGuangzhou Kimyasal Reaktif FabrikasıBE14-GR-500G
DMEM/F12Sigma-AldrichD0547
Fetal sığır serumuHiklonSH30084.03
HemositometreBLAU717805
KanamisinSigma-AldrichPHR1487
MG-63Çin Bilim Akademisi, Şangay Hücre Bankasıİnsan osteosarkom hücre hattı
MNNG/HOSÇin Bilim Akademisi, Şanghay Hücre Bankasıİnsan osteosarkom hücre hattı
Fenol kırmızısıSigma-AldrichP4633pH indikatörü olarak bir fenol kırmızısı çözeltisi kullanılır: rengi, 6.6 ila 8.0 pH aralığında sarıdan kırmızıya kademeli bir geçiş gösterir.
Potasyum klorürSangon BiotechA100395
Potasyum Fosfat MonobazikSangon BiotechA501211
Sodyum klorürSangon BiotechA501218

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Longhi, A., Errani, C., De Paolis, M., Mercuri, M., Bacci, G. Primary bone osteosarcoma in the pediatric age: State of the art. Cancer Treatment Reviews. 32, 423-436 (2006).
  2. Mohseny, A. B., et al. Osteosarcoma originates from mesenchymal stem cells in consequence of aneuploidization and genomic loss of Cdkn2. Journal of Pathology. 219, 294-305 (2009).
  3. Mutsaers, A. J., Walkley, C. R. Cells of origin in osteosarcoma: mesenchymal stem cells or osteoblast committed cells. Bone. 62, 56-63 (2014).
  4. Sato, S., et al. Mesenchymal tumors can derive from Ng2/Cspg4-Expressing pericytes with β-Catenin modulating the neoplastic phenotype. Cell Reports. 16, 917-927 (2016).
  5. Patane, S., et al. MET overexpression turns human primary osteoblasts into osteosarcomas. Cancer Research. 66, 4750-4757 (2006).
  6. Poos, K., et al. Genomic heterogeneity of osteosarcoma - shift from single candidates to functional modules. PLoS One. 10, 123082(2015).
  7. Martin, J. W., Squire, J. A., Zielenska, M. The genetics of osteosarcoma. Sarcoma. 2012, 1-11 (2012).
  8. Alfranca, A., et al. Bone microenvironment signals in osteosarcoma development. Cellular and Molecular Life Sciences. 72, 3097-3113 (2015).
  9. Alford, A. I., Kozloff, K. M., Hankenson, K. D. Extracellular matrix networks in bone remodeling. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 65, 20-31 (2015).
  10. Sawkins, M. J., et al. Hydrogels derived from demineralized and decellularized bone extracellular matrix. Acta Biomaterialia. 9, 7865-7873 (2013).
  11. Alom, N., Peto, H., Kirkham, G. R., Shakesheff, K. M., Bone White, L. J. Bone extracellular matrix hydrogel enhances osteogenic differentiation of C2C12 myoblasts and mouse primary calvarial cells. Journal of Biomedical Materials Research Part B-Applied Biomaterials. 106, 900-908 (2018).
  12. Datta, N., Holtorf, H. L., Sikavitsas, V. I., Jansen, J. A., Mikos, A. G. Effect of bone extracellular matrix synthesized in vitro on the osteoblastic differentiation of marrow stromal cells. Biomaterials. 26, 971-977 (2005).
  13. Rubio, R., et al. Bone environment is essential for osteosarcoma development from transformed mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32, 1136-1148 (2014).
  14. Sadr, N., et al. Enhancing the biological performance of synthetic polymeric materials by decoration with engineered, decellularized extracellular matrix. Biomaterials. 33, 5085-5093 (2012).
  15. Gautschi, O. P., Frey, S. P., Zellweger, R. Bone morphogenetic proteins in clinical applications. Anz Journal of Surgery. 77, 626-631 (2007).
  16. Rochet, N., et al. Modification of gene expression induced in human osteogenic and osteosarcoma cells by culture on a biphasic calcium phosphate bone substitute. Bone. 32, 602-610 (2003).
  17. Spang, M. T., Christman, K. L. Extracellular matrix hydrogel therapies: in vivo applications and development. Acta Biomaterialia. 68, 1-14 (2018).
  18. Schenke-Layland, K., et al. Impact of decellularization of xenogeneic tissue on extracellular matrix integrity for tissue engineering of heart valves. Journal of Structural Biology. 143, 201-208 (2003).
  19. Klein, M. J., Siegal, G. P. Osteosarcoma: anatomic and histologic variants. American Journal of Clinical Pathology. 125, 555-581 (2006).
  20. Lipinski, K. A., et al. Cancer evolution and the limits of predictability in precision cancer medicine. Trends in Cancer. 2, 49-63 (2016).
  21. McGranahan, N., Swanton, C. Clonal heterogeneity and tumor evolution: past, present, and the future. Cell. 168, 613-628 (2017).
  22. Brown, H. K., Schiavone, K., Gouin, F., Heymann, M., Heymann, D. Biology of bone sarcomas and new therapeutic developments. Calcified Tissue International. 102, 174-195 (2018).
  23. Abarrategi, A., et al. Osteosarcoma: cells-of-origin, cancer stem cells, and targeted therapies. Stem Cells International. 2016, 1-13 (2016).
  24. Tsukamoto, S., et al. Mesenchymal stem cells promote tumor engraftment and metastatic colonization in rat osteosarcoma model. International Journal of Oncology. 40, 163-169 (2012).
  25. Rodriguez, C. J., et al. Aerosol gemcitabine: preclinical safety and in vivo antitumor activity in osteosarcoma-bearing dogs. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 23, 197-206 (2010).
  26. Rodriguez, C. J. Using canine osteosarcoma as a model to assess efficacy of novel therapies: Can old dogs teach us new tricks. Advances in Experimental Medicine and Biology. 804, 237-256 (2014).
  27. Mohseny, A. B., et al. An osteosarcoma zebrafish model implicates Mmp-19 and Ets-1 as well as reduced host immune response in angiogenesis and migration. Journal of Pathology. 227, 245-253 (2012).
  28. Saalfrank, A., et al. A porcine model of osteosarcoma. Oncogenesis. 5, 210(2016).
  29. Zhang, Y., Pan, Y., Xie, C., Zhang, Y. MiR-34a exerts as a key regulator in the dedifferentiation of osteosarcoma via PAI-1–Sox2 axis. Cell Death & Disease. 9, (2018).
  30. Hashimoto, Y., et al. The effect of decellularized bone/bone marrow produced by high-hydrostatic pressurization on the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Biomaterials. 32, 7060-7067 (2011).
  31. Benders, K. E. M., et al. Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration. Trends in Biotechnology. 31, 169-176 (2013).
  32. Grayson, W. L., et al. Effects of initial seeding density and fluid perfusion rate on formation of tissue-engineered bone. Tissue Engineering Part A. 14, 1809-1820 (2008).
  33. Mikulic, D., et al. Tumor angiogenesis and outcome in osteosarcoma. Pediatric Hematology and Oncology. 21, 611-619 (2004).
  34. Ren, K., et al. Vasculogenic mimicry: a new prognostic sign of human osteosarcoma. Human Pathology. 45, 2120-2129 (2014).
  35. Bonuccelli, G., et al. Role of mesenchymal stem cells in osteosarcoma and metabolic reprogramming of tumor cells. Oncotarget. 5, 7575-7588 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bone Extracellular MatrixOsteosarcoma ModelDecellularization ProtocolFreeze Thaw CyclesHCl DecalcificationLipid ExtractionTE Solution TreatmentSterilization WashOS Cell SeedingImmunohistochemical Analysis

Related Articles