Yöntem makalesi

Yalıtım, yayma ve insan diş Pulp kök hücrelerin Nöronal Farklılaşma sırasında Prion Protein ifade

DOI:

10.3791/59282

⸱

18 Mart 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Experimental Medicine and Environmental Pathology, Sabina Universitas - Rieti University Hub, 2Department of Experimental Medicine, Sapienza University of Rome, 3Department of Science Dentistry and Maxillofacial, Sapienza University of Rome

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada insan diş Pulp kök hücre izolasyon ve yayılması için bir protokol Nöronal Farklılaşma süreci sırasında prion protein ifade değerlendirmek için mevcut.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embriyonik kök hücre manipülasyon ilgili Biyoetik sorunları tıbbi araştırma alanındaki gelişmeler engelliyordu. Bu nedenle, farklı dokuların yağ, göbek kordonu, kemik iliği ve kan gibi yetişkin kök hücre elde etmek çok önemlidir. Biyoetik konuları ile ilgili olarak elde etmek kolaydır çünkü olası kaynaklar arasında diş pulp özellikle ilginçtir. Nitekim, insan diş Pulp kök hücreleri (hDPSCs) erişkin kök hücreleri nöronal benzeri hücrelerde ayırt etmek güçlü bir türüdür ve sağlıklı hastalar (13-19 yaş) üçüncü molar elde edilebilir. Özellikle, diş hamuru bir ekskavatör ile kaldırıldı, küçük dilimler halinde kesip, IV collagenase ile tedavi ve bir şişeye kültürlü. Nöronal Farklılaşma ikna etmek için hDPSCs 2 hafta boyunca EGF/bFGF ile teşvik. Daha önce ayırt etme işlemi sırasında Protein hDPSCs (PrPC) hücresel prion içeriğini artış göstermiştir. Cytofluorimetric analiz artmış Nöronal Farklılaşma süreci sonrasında PrPC erken ifadesi gösterdi. PrPC ablasyon siRNA tarafından PrP Nöronal Farklılaşma EGF/bFGF tarafından indüklenen engelledi. Bu yazıda, biz gibi biz yalıtım, ayrılık ve vitro yetiştirme yöntemleri hDPSCs birkaç kolay yordamlar ile gelişmiş, daha verimli Hücre klonlar Mezenkimal kök hücrelerin (MSCs) elde edilen ve büyük ölçekli genişleme olduğunu göstermek gözlenmiştir. Biz de nasıl iletişim kuralında, ayrıntılı yöntemleri ile elde edilen hDPSCs, MSCs Nöronal Farklılaşma süreci ve sonraki hücresel ve moleküler eğitim için mükemmel bir deneysel model olduğunu göster.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenkimal kök hücrelerin kemik iliği, göbek kordon kanı, insan diş pulp, yağ dokusu ve kan1,2,3,4,5 de dahil olmak üzere birkaç dokulardan izole edilmiştir , 6. çeşitli yazarlar tarafından bildirildiği gibi hDPSCs plastik bağlılık, tipik bir fibroblast benzeri Morfoloji göster. Bunlar farklı klonlar ve proliferatif ve farklılaştırıcı kapasitesi7,8farklılıkları ile son derece heterojen bir nüfusu temsil etmektedir. hDPSCs hızlı Mezenkimal Kök hücre (yani CD44, CD90, CD73, CD105, STRO-1) için belirli işaretleri, onlar bazı hematopoetik işaretleri (örneğin CD14 ve CD19) negatif ve yeteneğine sahip tüp bebek multilineage farklılaşma9/, 10,11.

Birden çok yazar bu hücreler NGF, bFGF, EGF12belirli medya ve takviyeleri7,ile birlikte ek içeren farklı protokolleri kullanarak nöron benzeri hücrelerine ayırt etmek mümkün olduğunu göstermiştir. Ayrıca, birçok protein Nöronal Farklılaşma işlemi sırasında söz konusu ve bunlar arasında bir ilgili rolü ve önemli ifade hücresel prion protein (PrPC), embriyonik ve yetişkin kök hücreleri13, her ikisi de birkaç belgelerini göster 14. PrPC temsil eden bir pleiotropic molekül hücrelere farklı işlevler bakır metabolizması, Apoptozis, sahip ve direnç oksidatif stres15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22.

Bizim önceki kağıt23' te, biz PrPC hDPSCs Nöronal Farklılaşma sürecindeki rolü araştırdık. Aslında, hDPSCs tanımışlar PrPC hızlı ve Nöronal Farklılaşma sonra ek artış gözlemlemek mümkün. Diğer yazarlar PrPC kök hücrelerin Nöronal Farklılaşma süreçlerde olası bir rol olan. Nitekim, PrPC insan embriyonik kök hücre farklılaşma nöronlar, oligodendrocytes ve astrocytes24götürmek. Bu çalışmada kök hücre diş pulp, onun farklılaşma süreci ve PrPC rolünü Nöronal Farklılaşma sırasında elde etmek için metodoloji vurgulamak oldu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Üçüncü büyük azı dişleri çalışmada kullanılan hastalarda (13-19 yaş arası) uyuşturucu ya da alkol tüketimi önceki öyküsü, tüm sigara ve uygun ağız hijyeni ile eksize. Açıklama, bilim diş hekimliği bölümü ve "Sapienza" Roma Üniversitesi, Maxillofacial gününde aydınlatılmış onam hastalar veya veliler elde edildi. Aydınlatılmış onam dayalı etik kaygılar ve Etik Kurulu onayı alındı.

1. diş ve diş Pulp çıkarma

  1. Koruma veya ulaşım için uygun ortamı hazırlanması.
    1. Dulbecco'nın modifiye kartal orta düşük konsantrasyon glikoz (DMEM-L) L-glutamin (494.5 mL) ile hazırlayın.
    2. 5 mL penisilin/streptomisin (% 1) ekleyin ve Amfoterisin (% 0,1) 0.5 mL.
  2. Üçüncü molar hasta--dan hulâsa, hızlı bir şekilde PBS ile durulayın, orta ile 15 mL tüp bebek koymak ve az 2 h laboratuvarda aktarmak.
  3. Biohazard başlık altında dişin koronal kesme pass paralel ve teğet hamuru oda tavana bir kesici ile açın.
  4. Yavaşça hamuru ile küçük bir ekskavatör çıkarın ve bir test tüpü yerleştirin.
  5. PBS ile üç kez yıkayın ve 2500 x g 10 dk RT. az için santrifüj kapasitesi

2. diş Pulp ve kök hücre yayın işleme

  1. Süpernatant çıkarın, pelet Hank'in çözümde resuspend ve bir Petri kabına yerleştirin. %5 CO237 ° C'de 2 h için kuluçkaya.
  2. IV collagenase eriyik hazırlığı yazın.
    1. DMEM-L. 0.8 mL hazırlamak
    2. Türü IV collagenase DMEM-L ve birkaç dakika için girdap 0.8 ml 1 mg eritebilir.
    3. DMEM-L eklemek son bir konsantrasyon olması 1 mL 1 mg/mL.
    4. Çözüm 0,22 µM filtre ile filtre.
  3. Hank'in çözüm Santrifüjü 2500 x g RT, 10 min için de kaldırmak ve hamuru küçük dilimler halinde approximatively 1 mm her biri tek kullanımlık bir neşter ile ayırın.
  4. Hamuru dilimleri bir petri kabına yerleştirin ve tip IV collagenase %5 CO237 ° C'de 15 dakika 1 mL ile kuluçkaya.
  5. Orta kültür hazırlama (500 mL).
    1. DMEM-l L-glutamin ile 445 mL için.
    2. 50 mL Fetal sığır Serum (FBS) (%10) ekleyin.
    3. 5 mL penisilin/streptomisin (% 1) ekleyin.
  6. 2500 x g RT, 10 dk da örneğine santrifüj kapasitesi, süpernatant kaldırmak, pelet orta (Adım 2,5) ve T25 şişesi kök hücre için belirli kültüründe % 5 CO237 ° C'de resuspend.

3. kök hücre kültür ve yayılma

  1. Her gün kültür denetleyin ve büyüme 3 gün sonra balonun içindeki yapışık hücreleri farklı klonlar gözlemlemek.
  2. 3 günde kültür orta değiştirin.
  3. Yapışık hücreleri ulaşmak izdiham sonra 7 ve 12 gün arasında onları tripsin-EDTA 3 dk. 37 ° c için 1 mL hücrelerle tedavi veya hafifçe bir hücre kazıyıcı kullanarak ayırabilirsiniz.
  4. 4 ml (oranı 1:5) kültür tripsin eylemi durdurmak için orta (Adım 2.5) ekleyin.
  5. Hücre süspansiyon için 259 x gde 6 dk santrifüj kapasitesi, süpernatant kaldırmak ve hücreleri yaymak için bir T25 şişeye koyun.
    Not: 3 günde hücreleri izdiham ulaşmak.
  6. Hücreleri olmayan kök hücreler kültür gibi varlığı önlemek için 21-28 gün (yaklaşık 6-8 pasajlar) kadar yaymak.
  7. Tripsin-EDTA 3 dk. 37 ° C veya hafifçe kazıma için 1 mL hücrelerle bağlantısını kesin. Hücre süspansiyon için 259 x gde 6 dk santrifüj kapasitesi.
  8. Süpernatant kaldırmak ve test hücreleri cytofluorimetric analizi (adım 6) için.

4. geçici PrPC Silencing siRNA tarafından

  1. Kültür orta (Adım 2.5) için 24 h 2 mL ile hDPSCsin 6-şey plaka (2 x 105 hücre/mL) kültür.
  2. Bir gün sonra siRNA PrP orta (400 µL) hazırlayın.
    1. Steril tüp bebek için 384 µL eklemek DMEM-L.
    2. DMEM-L için 5 son bir konsantrasyon olması siRNA PrP her türü için 1 µL eklemek nM (PrP kullanılan ve devirme verimlilik ≥70% güvence altına almak için tedarikçi tarafından doğrulanmadı 4 siRNA).
    3. Transfectionreagent 12 µL DMEM-L. için ekleyin
    4. Girdap karışımı ve RT transfection kompleksleri oluşumu izin vermek için 10 min için kuluçkaya.
  3. Her örnek için 400 μL siRNA PrP orta ekleyin ve 37 ° C'de 6 h için kuluçkaya
  4. SiRNA PrP orta atarak olmadan, 1.6 mL (1-5 oranında) kültür orta (Adım 2.5) ekleyin.
  5. 37 ° C'de 72 h için hücre bıraktığınızdan
  6. Süpernatant kaldırmak ve 3 kez PBS RT., 2 mL ile yıkayın
  7. Nöronal kültür orta 2 mL 7/veya 14 gün (Adım 5.1) ekleyin.
  8. Nöronal kültür orta 3 günde değiştirin.
    Not: SiRNA PrP çözüm her zaman değiştir nöronal kültür orta yerine.
  9. Zaman sonunda, 3 kez PBS RT, 2 mL ile yıkama ve nöronal yüzey antijenleri için Western Blot analizi ile test.

5. nöronal indüksiyon sürecinin hDPSCs

  1. Nöronal kültür orta hazırlık (500 mL).
    1. Bazal medya için nöronal hücre formüle 444.7 mL hazırlayın.
    2. Orta olarak embriyonik ve yetişkin nöron kök hücreleri (% 10) uzun vadeli canlılığı desteklemek için kullanılan serum ücretsiz ek 50 mL ekleyin.
    3. 200 µL temel Fibroblast büyüme faktörü (bFGF) (son konsantrasyonu 40 ng/mL) ve 100 µL Epidermal büyüme faktörü (EGF), orta (son konsantrasyonu 20 ng/mL) ekleyin.
    4. 5 mL penisilin/streptomisin (% 1) ekleyin Orta olarak.
  2. 6-şey plaka (2 x 105 hücre/mL) kültür hDPSCs için 28 gün hamuru ayrılması ve onları nöronal kültür orta 2 mL ile teşvik.
  3. 3 günde süpernatant atmak, 3 kez PBS RT, 2 mL ile yıkayın ve 2 mL nöronal kültür orta yerine.
  4. 7 ve/veya 14 gün sonra hücreleri tripsin-EDTA 3 dk. 37 ° c için 1 mL veya hafifçe bir kazıyıcı ile bağlantısını kesin.
  5. 4 mL (oranı 1:5) kültür tripsin eylemi durdurmak için orta (Adım 2.5) ekleyin.
  6. Nöronal yüzey antijenleri (adım 6) varlığı veya prion protein deyim (7. adım) için Akış Sitometresi Analizi ile test.

6. hDPSCs Akış Sitometresi tarafından karakterizasyonu

  1. Mezenkimal stromal (MSC) seçin-özel veya nöronal yüzey antijenleri.
  2. 6-şey plaka (2 x 105 hücre/mL) 2 mL kültür orta (Adım 2.5) ile hDPSCs kültür.
  3. HDPSCs, 28 gün diş pulp ayrılması veya 3 dk. 37 ° C veya hafifçe kazıyıcı için 1 mL tripsin-EDTA ile nöronal kültür ortamının (Adım 5.1) 14 gün sonra bağlantısını kesin.
  4. 4 ml (oranı 1:5) kültür tripsin eylemi durdurmak için orta (Adım 2.5) ekleyin ve centrifugate 259 x g 6 dk RT. az için yıkama başka bir PBS 2 mL ile 2 kez RT.
  5. Tedavi edilmemiş veya tedavi hDPSCs 4 ° C'de 10 dakika için PBS içinde %4 paraformaldehyde ile saptamak
  6. HDPSCS %0,1 (v/v) iyonik olmayan yüzey aktif PBS içinde RT., ek 10 dk ile permeabilize
  7. PBS 1 ml RT. 1 h için %5 yağsız kuru süt ile engelleme gerçekleştirmek
  8. Yıkama PBS ile 3 kez 1 mL ve anti-CD105 hücrelerle kuluçkaya (1: 100 / 5 x 105 hücreleri), anti-CD44 (1: 100 / 5 x 105 hücreleri), anti-STRO-1 (1: 100 / 5 x 105 hücreleri), anti-CD90 (1: 100 / 5 x 105 hücreleri), anti-CD73 (1: 100 / 5 x 105 hücreleri), β3-tübülin anti (1: 100 / 5 x 105 hücreleri), anti-NFH (1: 100 / 5 x 105 hücreleri) ve anti-GAP43 (1: 100 / 5 x 105 hücreleri) mAb RT. 1 h için
  9. 3 kez PBS 1 mL içeren hücreleri yıkama ve anti-fare PE (1:50 / 5 x 105 hücreleri) veya anti-tavşan CY5 ile kuluçkaya (1:50 / 5 x 105 hücreleri) mAb RT. ek 1 h için
  10. İkincil antikorlar (Anti-fare PE ya da anti-tavşan CY5 mAb) immunopositive hücreleri geçişi için kullanın ve bir Akış Sitometresi ile tüm örneklerini analiz ve en az 20.000 olaylar elde etmek.

7. hDPSCs Akış Sitometresi Analizi tarafından ifadede PrPC değerlendirilmesi

  1. Kültür orta (Adım 2.5) 2 mL ile hDPSCsin 6-şey plaka (2 x 105 hücre/mL) kültür.
  2. HDPSCs at 21 ve 28 gün diş pulp ayrılması ve nöronal kültür orta (Adım 5.1) ile 1 mL tripsin-EDTA ile 7 ve/veya 14 gün sonra bağlantısını kesin ve tripsin eylem 6.4 adımda anlatıldığı gibi durdurun. Numune 4 ° C'de 10 dakika için PBS içinde %4 paraformaldehyde ile saptamak
  3. %0,1 (v/v) non-iyonik surfactantin PBS 10 dakika dik kaldır at ile süpernatant permeabilize ve tavşan anti-PrP mAb EP1802Y hücrelerle (1:50 / 5 x 105 hücreleri) leke mAb Anti-tavşan CY5 ile dik Incubate (1:50 / 5 x 105 hücreleri), 1 h için mAb için RT ek 1 h
  4. Akış Sitometresi ile tüm örneklerini ve en az 20.000 olaylar elde etmek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HDPSCs gelen diş pulp, üçüncü molar elde edilen yalıtım ve ayrımı prosedürleri küçük değişiklikler yıkıcı bir sonuç açabilir karmaşık işlemlerdir. Bu yazıda, Arthur ve diğerleri. iletişim kuralı kullanın 12 birkaç yenilik. Yordamlar temsilcisi düzeninin şekil 1' de gösterilen.

hDPSCs hücreleri farklı klonlar ve proliferatif ve farklılaştırıcı kapasitesi

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, yalıtım ve hDPSCs Nöronal Farklılaşma için metodoloji üzerinde duruldu; Ayrıca, PrPC bu süreçte rol değerlendirildi. Yalıtmak ve hDPSCs nöron benzeri hücreler ve kritik adımları işlemi sırasında ayırt etmek için birkaç yöntem vardır. hDPSCs chondroblasts, adipositler, dokusunu ve sinir hücreleri gibi birkaç soy ayırt edebiliyoruz. Bizim gazetede Nöronal Farklılaşma mekanizmaları ve PrPCvarlığı araştırıldı. Yukarıda da açıklandığı gibi bu hücreler CD44, CD90, CD105, CD73 ve vuruş-1

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser "Fondazione Varrone" ve Rieti Üniversitesi Hub Vincenzo Mattei için "Sabina Universitas" tarafından desteklendi.

Şekil 5 (A, B) Taylor & Francis Ltd yayımcı izni ile yayımlanmaktadır: rol Prion protein-EGFR multimolecular karmaşık insan diş hamuru elde edilen kök hücreleri Nöronal Farklılaşma sırasında. Martellucci, S., Manganelli V., Santacroce C., Santilli F., Piccoli L., Sorice M., Mattei V. deli dana. 2018 4 Mart. Taylor & Francis Ltd.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Amfoterisin B çözeltisiSigma-AldrichA2942Hücre kültürü ortamını desteklemek için kullanılır, Streptomyce Anti-B3tubulin Hücre Sinyal Teknolojisi'nden bir polien antifungal antibiyotiktir
;# 4466Altı B-tubulin izoformundan biri, fetal ve doğum sonrası gelişim sırasında yüksek oranda eksprese edilir, periferik sinir sisteminde yüksek kalır
Anti-CD105 İnsan vasküler endotelyumunun önemli bir glikoproteini olan BD Biosciences 611314 Endoglin (CD105), geniş bir hücre dışı bölgeye, hidrofobik bir transmembran bölgesine ve kısa bir sitoplazmik kuyruğa sahip bir tip I integral membran proteinidir
Anti-CD44MilliporeCBL154-20ulPozitif hücre belirteçleri mezenkimal kök hücrelere yönelik antikorlar
Anti-CD73 Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi 13160CD73, hücre dışı nükleosit monofosfatların biyoaktif nükleozitlere hidrolizini katalize eden 70 kDa glikosil fosfatidilinositol bağlantılı, zara bağlı bir glikoproteindir
Anti-CD90MilliporeCBL415-20ulPozitif hücre belirteçleri mezenkimal kök hücrelere yönelik antikorlar
Anti-GAP43 Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi #8945Büyüme konilerinde ve yüksek plastisiteli alanlarda sinir sistemine özgü, büyüme ile ilişkili bir proteindir
Anti-fare PE Abcamab7003Akış sitometrisinde veya FACS analizinde kullanılan bir antikordur
Anti-NFH Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi #2836Toplam Nörofilament-H proteini
Anti-PrP mAb EP1802Y Abcamab52604Tavşan monoklonal [EP 1802Y] Prion proteini PrP
Anti-tavşan CY5 Abcamab6564Akış sitometrisi veya FACS analizinde kullanılan bir antikordur
Anti-STRO 1MilliporeMAB4315-20ulPozitif hücre belirteçleri mezenkimal kök hücrelere karşı yönlendirilmiş antikorlar
B27 Supp XF CTSGibco yaşam teknolojileri tarafındanA14867-01B-27  pluripotent kök hücrelerden (PSC'ler) insan nöral kök hücrelerinin (hNSC'ler) indüksiyonunu, hNSC'lerin genişlemesini desteklemek için kullanılabilir, hNSC'lerin farklılaşması ve kültürde olgun farklılaşmış nöronların korunması
BD Accuri C6 akış sitometresi lazer (488 nm) ve kırmızı lazer (640 nm) ile donatılmışBD BiosciencesAC6531180187
sitometresiBD Accuri C6 Software BD Biosciences, veri elde etmek, istatistik oluşturmak ve sonuçları analiz etmek için BD Accuri C6 akış sitometre sistemini kontrol eder
bFGFPeproThec, DBA100-18Btemel Fibroblast Büyüme Faktörü 
Santrifüj CL30RTermo fisher Scientific11210908sıvıların, gazın veya sıvının yoğunluğa göre ayrılması için kullanılan bir cihazdır.
CO2 İnkübatörü 3541Termo fisher Scientific317527-185hücre kültürleri için optimal ve tekrarlanabilir büyüme koşulları sağlar
Kollajenaz, tip IV Yaşam Teknolojileri17104019Kollajenaz, nötr bir amino asit (X) ile glisin arasındaki bağı, kollajende yüksek sıklıkta bulunan Pro-X-Glyc-Pro dizisinde parçalayan bir proteazdır
. Tek kullanımlık neşter Swann-Morton501Dokuları kesmek için kullanılır
DMEM-LEurocloneECM0060LDulbecco'nun Sodyum Pirüvat ile L-Glutamin ile Modifiye Eagle'ın Orta Düşük Glikozu
EGF PeproThec, DBAAF-100-15Epidermal Büyüme Faktörü & nbsp;
Fetal Sığır SerumuGibco by life technologies10270-106FBS, hücre kültüründe çok çeşitli işlevler sağladığı için popüler bir medya takviyesidir. FBS, besinleri, büyüme ve bağlanma faktörlerini sağlar ve serumsuz ortam (SFM) sistemlerinde çoğaltılması zor mekanizmalarla hücreleri oksidatif hasar ve apoptozdan korur
Filtropur BT50 0.2,500 mL Şişe üstü filtreSarstedt831,823,101çözeltilerinin filtrasyonu için kullanılan bir cihazdır
QiagenGS5621için Flexitube GeneSolutionEntrez geni 5621 için 4 siRNA. Hedef dizisi N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA  N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA  N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA  N.4  CAGTGACTATGAGGACCGTTA
Hank'in çözümü 1xGibco by life technologies240200083Hanks&prime'ın temel işlevi; Dengeli Tuz çözeltisi, pH'ın yanı sıra ozmotik dengeyi de korumaktır. Ayrıca hücrelere su ve esansiyel inorganik iyonlar sağlar
HiPerFect Transfeksiyon Reaktifi Qiagen301705HiPerFect Transfeksiyon Reaktifi, etkili siRNA alımını ve siRNA'nın hücreler içinde verimli bir şekilde salınmasını sağlayan katyonik ve nötr lipidlerin benzersiz bir karışımıdır, bu da düşük siRNA konsantrasyonları kullanıldığında bile yüksek gen yıkımı ile sonuçlanır
Nörobazal A Gibco by life technologies10888022Neurobazal-A Medium, saf doğum sonrası ve yetişkin beyin nöronlarının uzun süreli bakımı ve olgunlaşması için tasarlanmış bir bazal besiyeridir.
ParaformaldehitSigma-Aldrich30525-89-4Paraformaldehit, boyama prosedürleri sırasında hücrelerin ve doku bölümlerinin sabitlenmesi için kullanılmıştır
; penisilin / streptomisin ve nbsp;EurocloneECB3001D Bakteriyel kontaminasyonu kontrol etmek için hücre kültürü ortamını desteklemek için kullanılır
Fosfat tamponlu tuzlu su  (PBS)EurocloneECB4004LX10 PBS, memeli hücrelerinin işlenmesi ve kültürlenmesi için kullanılan dengeli bir tuz çözeltisidir. PBS, memeli hücrelerini sulamak, yıkamak ve seyreltmek için kullanılır. Fosfat tamponlama, pH'ı fizyolojik aralıkta
tutar TC-Platte 6 kuyusu, Hücre +, FSarstedt833,920,300Yapışık hücreler için bir büyüme yüzeyidir
Doku kültürü şişesi T-25, Hücre +, Bacalı KapakSarstedt833,910,302Doku kültürü şişesi T-25, polistiren, Hassas yapışık hücreler için hücre + büyüme yüzeyi, örneğin birincil hücreler, eğimli boyun, ventilasyon kapağı, sarı, steril, Pirojen içermeyen, sitotoksik olmayan, 10 adet/torba
Triton X-100 Sigma-Aldrich9002-93-1Hafif denatüre olmayan koşullar altında membran bileşenlerinin geri kazanımı için yaygın olarak kullanılan iyonik olmayan yüzey aktif madde
Tripsin-EDTA EurocloneECB3052D Tripsin, lizin ve arginin amino asit kalıntılarının C-terminal tarafındaki peptitleri parçalayacaktır. Tripsin, bir kültür yüzeyinden yapışan hücreleri çıkarmak için kullanılır
TüpSarstedt62,554,502Tüp 15 mL, 120 mm x17 mm, PP
VBH 36 C2 KompaktSterilST-003009000Çevre ve çalışan için tam koruma sağlar
ZEISS Axio Vert.A1 – Ters  MikroskopZeiss3849000962ZEISS Axio Vert.A1, benzersiz bir giriş seviyesi fiyatı sunar ve parlak alan, faz kontrastı, PlasDIC, VAREL, geliştirilmiş Hoffman Modülasyon Kontrastı (iHMC), DIC ve floresan dahil olmak üzere tüm kontrast tekniklerini sağlayabilir. Floresan etiketli hücreler için hassas görüntüleme için LED aydınlatmayı dahil edin. Axio Vert.A1, rutin işler için ergonomik olarak tasarlanmıştır ve doku kültürü başlıklarının içine oturacak kadar kompakttır.
endojen seviyelerini tespit eden bir antikordur;Mavi FlowPRNP

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Robey, P. G., Kuznetsov, S. A., Riminucci, M., Bianco, P. Bone marrow stromal cell assays: in vitro and in vivo. Methods in Molecular Biology. 1130, 279-293 (2014).
  2. Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418, 1-49 (2002).
  3. Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24, 1294-1301 (2006).
  4. Zannettino, A. C. W., et al. Multi-potential Human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. Journal of Cellular Physiology. 214, 413-421 (2008).
  5. Mattei, V., et al. Role of lipid rafts in neuronal differentiation of dental pulp-derived stem cells. Experimental Cell Research. 339, 231-240 (2015).
  6. Jansen, J., Hanks, S., Thompson, J. M., Dugan, M. J., Akard, L. P. Transplantation of hematopoietic stem cells from the peripheral blood. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 9 (1), 37-50 (2005).
  7. Young, F. I., et al. Clonal heterogeneity in the neuronal and glial differentiation of dental pulp stem/progenitor cells. Stem Cells International. 2016, 1290561(2016).
  8. Pisciotta, A., et al. Human dental pulp stem cells (hDPSCs): isolation, enrichment and comparative differentiation of two sub-populations. BMC Developmental Biology. 15, 14(2015).
  9. Atari, M., et al. Dental pulp of the third molar: a new source of pluripotent-like stem cells. Journal of Cell Science. 125, 3343-3356 (2012).
  10. Koyama, N., Okubo, Y., Nakao, K., Bessho, K. Evaluation of pluripotency in human dental pulp cells. Journal of oral and maxillofacial surgery: official journal of the American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 67, 501-506 (2009).
  11. Gronthos, S., et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. Journal of Dental Research. 81, 531-535 (2002).
  12. Arthur, A., Rychkov, G., Shi, S., Koblar, S. A., Gronthos, S. Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues. Stem Cells. 7, 1787-1795 (2008).
  13. Lee, Y. J., Baskakov, I. V. The cellular form of the prion protein is involved in controlling cell cycle dynamics, self-renewal, and the fate of human embryonic stem cell differentiation. Journal of Neurochemistry. 124, 310-322 (2013).
  14. Steele, A. D., Emsley, J. G., Ozdinler, P. H., Lindquist, S., Macklis, J. D. Prion protein (PrPc) positively regulates neural precursor proliferation during developmental and adult mammalian neurogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 3416-3421 (2006).
  15. Wulf, M. A., Senatore, A., Aguzzi, A. The biological function of the cellular prion protein: an update. BMC Biology. 15, 34(2017).
  16. Mattei, V., et al. Recruitment of cellular prion protein to mitochondrial raft-like microdomains contributes to apoptosis execution. Molecular Biology of the Cell. 22, 4842-4853 (2011).
  17. Linden, R. The Biological Function of the Prion Protein: A Cell Surface Scaffold of Signaling Modules. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 77(2017).
  18. Garofalo, T., et al. Role of mitochondrial raft-like microdomains in the regulation of cell apoptosis. Apoptosis. , 621-634 (2015).
  19. Watt, N. T., et al. Reactive oxygen species-mediated beta-cleavage of the prion protein in the cellular response to oxidative stress. The Journal of Biological Chemistry. 280, 35914-35921 (2005).
  20. Mattei, V., et al. Morphine Withdrawal Modifies Prion Protein Expression in Rat Hippocampus. PLoS One. 12, 0169571(2017).
  21. Hu, W., et al. Prion proteins: physiological functions and role in neurological disorders. Journal of the Neurological Sciences. 264, 1-8 (2008).
  22. Sorice, M., et al. Trafficking of PrPC to mitochondrial raft-like microdomains during cell apoptosis. Prion. 6, 354-358 (2012).
  23. Martellucci, S., et al. Role of Prion protein-EGFR multimolecular complex during neuronal differentiation of human dental pulp-derived stem cells. Prion. 12 (2), 117-126 (2018).
  24. Lee, Y. J., Baskokov, I. V. The cellular form of the prion protein guides the differentiation of human embryonic stem cell into neuron-, oligodendrocyte- and astrocyte-committed lineages. Prion. 8, 266-275 (2014).
  25. Huang, G. T., Sonoyama, W., Chen, J., Park, S. H. In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments. Cell and Tissue Research. 324, 225-236 (2006).
  26. Suchanek, J., et al. Dental pulp stem cells and their characterization. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacký. 153, Olomouc, Czechoslovakia. 31-35 (2009).
  27. Bressan, E., et al. Donor age-related biological properties of human dental pulp stem cells change in nanostructured scaffolds. PLoS One. 7 (11), 49146(2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kollagenaz IV UygulamasAk Sitometrisi AnaliziWestern Blot AnaliziTrypsin EDTA ile Ay rmaEGF bFGF Stim lasyonusiRNA PrP SusturmaH cre K lt r o altma

İlgili makaleler