Enzim aktivitesinin termal kararlılık kolayca izotermal titrasyon Kalorimetre (ITC) tarafından ölçülür. Çoğu protein istikrar deneyleri şu anda ölçü protein unfolding kullanılan ancak enzimatik etkinliği hakkında bilgi sağlamaz. ITC enzim değişiklikleri istikrarı üzerinde enzim aktivitesinin etkisini doğrudan tayini sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İzotermal titrasyon Kalorimetre tarafından ölçüm enzimatik istikrar
Bu makalede
Özet
Özet
Bu eser izotermal titrasyon Kalorimetre (ITC) enzim aktivitesi kararlılığını ölçmek için yeni bir yöntem gösterir. Substrat çözeltisi tek bir enjeksiyon bir enzim çözüm içine enzim aktivitesi ile ilişkili sonra gözlenen en yüksek ısı hızı. Belgili tanımlık substrate zaman içinde birden çok enjeksiyonları aynı enzim çözüm içine kayıp enzim aktivitesinin göster. Tahlil gerektiren çok az personel zaman, özerk ve çoğu medya ve enzimler için geçerlidir.
Giriş
Proteinler organik reaksiyonlar geniş bir dizi katalizlerler yetenekli enzimlerdir. Çoğu enzim işlevinde yakınındaki nötr pH böylece sert çözücüler kullanımı kaçınarak sulu çözüm. Onların yüksek seçicilik nedeniyle daha az katalize enzim reaksiyonlar üretmek (bazı durumlarda hiçbir yan) yan asitler ve bazlar1gibi non-selektif katalizörler daha. Bu tüm kimyasal reaksiyonlar nihai ürün insan tüketimi için güvenli bu yüzden burada yapılması gereken gıda üretiminde özellikle önemlidir. Şu anda, enzimleri yüksek fruktoz mısır şurubu2, peynir3, bira4, laktozsuz süt
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. hazırlanması örnekleri
-
1000 mL 0.1 M sodyum asetat arabelleği pH 4.6
- 800 mL distile su bir 1000 mL mezun ölçek ölçmek.
- Susuz sodyum asetat 8.2 g tartmak ve kabı için ekleyin.
- Kabı bir heyecan tabağa yerleştirin, bir heyecan çubuk ölçek kabı yerleştirin, heyecan plaka üzerinde açmak ve tamamen eriyene kadar karıştırın.
- Ne zaman susuz sodyum asetat tamamen çözülmüş, kalibre edilmiş pH metre ile pH çözüm ölçmek.
- Buna göre 1 M HCl veya NaOH istenen pH 4,6 elde etmek için ekleyin.
- Kadar toplam hacmi 1000 mL distile su ekleyin.
- Oda sıcaklığında kullanmak kadar saklamak....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 1 ve şekil 5 temsilcisi sonuçlarında iki enzimler, laktaz ve invertase gelen verileri göstermek. Laktaz ve invertase bir disaccharide hidroliz iki bol katalizler endothermically ve exothermically, anılan sıraya göre. Her iki enzimatik reaksiyonları doygunluk enzim durdurulmasını emretti konsantrasyonları işletilmiştir.
Laktaz veri ITC verileri enzim istikrar tahmin etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Dört sıralı.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada açıklanan ITC enzim istikrar tahlil önemli bir avantajı otomasyon sistemidir. Tüm uygun arabellek ve çözümleri yapıldıktan sonra her tahlil için hazırlık süresi yaklaşık 15dk için tahlil yapan biri var. Buna ek olarak, geleneksel deneyleri invertase ve laktaz aktivitesi için tahlil yapan kişinin sürekli katılımı ile yaklaşık 2 h gerektirir ve birçok enzimatik aktivite deneyleri miktardan çok daha fazla adam-saat değerlerini alır. Bir önceki yayında veri ITC yönteminden daha geleneksel bir spectrophotrometric yönte.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| a-Laktoz | Fisher Scientific | bilinmeyen (çok eski) | 500g |
| Sodyum Asetat, Susuz% 99 min | Alfa Aesar | A13184-30 | 250g |
| Laktaz | MP Bio | 100780 | 5g |
| Hidrokolrik Asit Çözeltisi, 1N | Fisher Bilimsel | SA48-500 | 500mL |
| Masaüstü Ölçüm Cihazı - pH | VWR | 89231-622 | |
| Etanol %70 | Fisher Scientific | BP8231GAL | 1 galon |
| Micro-90 | Fisher Scientific | NC024628 | 1L (temizleme solüsyonu) |
Kaynaklar
- Anastas, P., Eghbali, N. Green chemistry: principles and practice. Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).
- Jin, L. Q., et al. Immobilization of Recombinant Glucose Isomerase for Efficient Production of High Fructose Corn S....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
