Method Article

Ekstrasellüler matris Hidrogeller kullanarak normal doku radyasyon etkileri eğitim

DOI:

10.3791/59304

⸱

July 24th, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Vanderbilt University, 2Department of Radiation Oncology, Stanford University, 3Depattment of Biomedical Engineering, Vanderbilt University, 4Department of Radiation Oncology, Vanderbilt University Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, deselülarizasyon ve ex vivo ışınlama sonrasında murine meme Yağ pedleri sonraki hidrojel oluşumu için bir yöntem sunar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Radyasyon Üçlü negatif meme kanseri olan hastalar için bir terapidir. Radyasyon, sağlıklı meme dokusu ve primer tümör bölgesinde lokal nüks rolündeki rol dışı matris (ECM) üzerinde etkisi bilinmiyor. Burada, duvar meme yağlı pedlerden elde edilen ECM hidrojellerin deselülarizasyon, lyophilization ve imalatı için bir yöntem sunuyoruz. Bulgular deselülarizasyon sürecinin etkinliğinde sunulmuştur ve reolojik parametreler değerlendirildi. GFP-ve luciferase-etiketli meme kanseri hücreleri hydrojels içinde kapsüllenmiş hidrojellerin proliferasyon bir artış göstermiştir. Son olarak, phalloidin Konjugat boyama kapsüllenmiş tümör hücrelerinin siterit organizasyonu görselleştirmek için kullanıldı. Hedefimiz, tümör hücresi davranışlarını incelemek için in vivo meme dokusu ortamını ve radyasyona olan tepkisini taklit eden in vitro çalışma için Hidrojeller üretebilmek için bir yöntem sunmadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kanser apoptozis kaçınmak ve aynı zamanda uzak sitelere metastaz hücrelerin aşırı proliferasyon ile karakterize1. Meme kanseri ABD 'de kadınlar arasında en yaygın formlardan biridir, tahmini 266.000 yeni vaka ve 40.000 ölüm ile 20182. Özellikle agresif ve alt türü tedavi etmek zor üçlü negatif meme kanseri olduğunu (TNBC), hangi östrojen reseptörü yoksun (ER), progesteron reseptör (PR), ve insan epidermal büyüme faktörü (HER2). Radyasyon terapisi, lumpektomi sonrasında kalan tümör hücrelerini ortadan kaldırmak için meme kanserinde yaygın olarak kullanılır, ancak TNBC hastalarının% 13 ' ünden fazlası primer tümör bölgesin....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan çalışmaları, Vanderbilt Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylanan kurumsal yönergeler ve protokollere uygun olarak yapılmıştır.

1. MFP 'lerin hazırlanması ve ex vivo ışınlama

  1. Co2 boğulma kullanarak atymic Nu/nu fareler (8 – 10 hafta) kurban servikal dislocation tarafından takip.
  2. 70% etanol kullanarak cildi temizleyin.
  3. Tam rpmi medya içeren 15 ml konik tüp önceden sterilize makas ve forseps kullanarak feda fareler meme Yağ pedleri (MFP) toplamak (rpmi 1% penisilin-streptomisin ve% 10 fetal Sığır serum ile tamamlayıcı) ( malzeme tablosuna bakın

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MFP 'ler Şekil 1a'da gösterilen prosedürü kullanarak ışınlama sonrasında deselülarize edildi. MFPs öncesi deselülarizasyon (Şekil 1B) ve sonrası Deselülarizasyon (Şekil 1C) gösterilir. Deselülarizasyon hematoksislin ve eozin (H & E) boyama kullanılarak onaylandı ve 1-([4-(Xylylazo) xylyl] azo) -2-naphthol boyama lipid içeriğini değerlendirmek için kullanıldı (Şekil 2). ECM hidrojellerin reolojik özellikleri de 37 °C '.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hidrojel oluşumu bu yöntem büyük ölçüde başlangıç dokusu miktarına bağlıdır. Murine MFP 'ler küçüktür ve deselülarizasyon süreci malzemenin önemli ölçüde azalmasına neden olur (Tablo 1). Son verimi artırmak için daha fazla MFP ile işlem tekrarlanabilir. Frezeleme, malzemenin kaybına yol açabilecek bir başka önemli adımdır. Diğerleri bir kriyojenik değirmen ile başarı göstermiştir, ancak bu protokol bir el harç ve bir havaneli eki ile elektrikli matkap ile frezeleme dayanmaktadır8<.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar Gfp-ve luciferase-4t1 hücreleri sağlamak için Dr. Laura L. Bronsart teşekkür ederiz, Dr. Edward L. lagory 1 üzerinde tavsiye için-([4-(xylylazo) xylyl] azo) -2-naphthol boyama, Dr. Craig L. Duvall Ivis ve kurutucu kullanımı için, ve Dr. Scott A. guelcher Reometre için Kullanın. Bu araştırma NıH Grant #R00CA201304 tarafından mali olarak destekleniyordu.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
% 10 Nötr Tamponlu Formalin, TıkaçVWR16004-128-2-metilbütan
ile Küp Alfa Aesar19387-AR
2000ex ReometreTA Aletleri10D4335reometre
Sığır Serumu AlbüminSigma-AldrichA1933-25G-kalsein
asetoksimetil (kalsein)Moleküler Problar, Inc.C1430-D-Luciferin
Ateşböceği, potasyum tuzuBiosynth Kimya & BiyolojiL-8820(S) -4,5-Dihidro-2- (6-hidroksi-2-benzotiyazolil) -4-tiyazolekarboksilik asit potasyum tuzu
Histoloji için DPX MountantSigma-Aldrich06522-500ML-Dulbecco'nun
fosfat tamponlu tuzlusu Gibco
14040133-Eosin-Y, Floksinile Richard-Allan Scientific71304eozin
etidyum homodimerMoleküler Problar, Inc.E1169etidyum homodimer-1 (EthD-1)
Fetal Sığır SerumuSigma-AldrichF0926-500ML-Fisher
Healthcare Tissue-Plus OCT BileşikFisher Scientific23-730-571kriyostat gömme ortamı
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01su bazlı montaj ortamı
FreeZone 4.5Labconco7751020liyofilizatör
Hoechst 33342 Çözelti (20 mM)Thermo Scientific62249mavi floresan boya
Hidroklorik asitSigma-Aldrich258148-500ML-IVIS
Lumina IIIPerkinElmerCLS136334biyolüminesans görüntüleme sistemi
Kimtech Science KimwipesKimberly Clarkhassas görev mendilleri
n-Propanol (Peroksit İçermeyen/Dizileme), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP1130-500-Yağ
Kırmızısı OSigma-AldrichO0625-25G1-([4- (Ksililanoz)ksil]azo)-2-naftol
OPS Teşhisi CryoGrinderOPS Teşhisi, LLCCG-08-02-PBS
(10X), pH 7.4Kalite Biyolojik, Inc.119-069-151Fosfat tamponlu salin
Penisilin-StreptomisinGibco15140-122-Pepsin,
domuz mide mukozasındanSigma-AldrichP6887-5Gpepsin
Perasetik asitSigma-Aldrich77240-100ML-Phalloidin-iFluor
594 Reaktif (ab176757)abcamab176757phalloidin konjugatı
Propilen glikolSigma-AldrichW294004-1KG-K-Richard-Allan
Bilimsel İmza Serisi Mavileştirme ReaktifiRichard-Allan Scientific7301Lmavileştirme ajanı
Richard-Allan Bilimsel İmza Serisi Hematoksilen 7211Richard-Allan Bilimsel7211-RPMI
Orta 1640Gibco11875-093-Sodyum
deoksikolat, %98Frontier ScientificJK559522deoksikolik asit
SükrozSigma-AldrichS5016-Triton
x-100Sigma-AldrichX100-100MLt-Oktilfenoksipolietoksietanol
Tripsin-EDTA (% 0.25), fenol kırmızısıGibco25200-056-Whatman
kalitatif filtre kağıdı, Sınıf 4Whatman1004-1104. sınıf kalitatif filtre kağıdı
Ksilenler (Sertifikalı ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificX5-4-
, ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
  3. Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. J.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular Matrix HydrogelsRadiation EffectsDecellularization ProcessMurine Mammary Fat PadHydrogel FabricationRheological PropertiesCell Proliferation AssayPhalloidin Conjugate StainingFluorescence MicroscopyScanning Electron Microscopy

Related Articles