Yöntem makalesi

Insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerinin (iPSCs), PiggyBac vektörler kullanarak fonksiyonel spinal ve kranial motor nöronlara dönüşümü

DOI:

10.3791/59321

⸱

1 Mayıs 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology and Biotechnology Charles Darwin, Sapienza University of Rome, Italy, 2Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, Italy, 3Laboratory of Stem Cell biology and Molecular Embryology, The Rockefeller University, USA, 4Department of Physiology and Pharmacology, Sapienza University of Rome, Italy

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol indüklenebilir piggyBac vektörler transkripsiyon faktörlerin ektopik ifade, bir spinal veya kranial kimlik ile motor nöronlar içine indüklenen pluripotent kök hücrelerinin hızlı ve verimli dönüşüm sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada insan indüklenen pluripotent kök hücrelerden fonksiyonel omurilik ve kraniyal motor nöronları elde etmek için bir yöntem tarif (ıpscs). Motor nöron içine doğrudan dönüşüm transkripsiyon faktörleri alternatif modüller ektopik ifade ile elde edilir, yani Ngn2, Isl1 ve Lhx3 (NIL) veya Ngn2, Isl1 ve Phox2a (NSIP). NIL ve NıP sırasıyla spinal ve kraniyal motor nöron kimliğini belirtir. Protokollerimiz, NIP 'nin bir piggybac transpozon vektörü ile genomda stabil entegre edildiği değiştirilmiş IPSC hatları ile başlar. Transgenlerin ifadesi daha sonra doksisiklin ve yol açar, 5 gün içinde, ıpscs MN progenitors dönüşümüne. Sonraki olgunlaşma, 7 gün boyunca, spinal veya kranial MNs homojen nüfusa yol açar. Bizim yöntemi önceki protokoller üzerinde çeşitli avantajları tutar: son derece hızlı ve Basitleştirilmiş; viral enfeksiyon veya daha fazla MN yalıtım gerektirmez; farklı MN alt kitleleri (omurilik ve kranial) olgunlaşma dikkat çekici bir derece ile Üreten sağlar, eylem potansiyelleri trenler yangın yeteneği tarafından gösterilmiştir. Dahası, çok sayıda motor nöronları karışık nüfus arıtmadan elde edilebilir. IPSC-türev spinal ve kraniyal motor nöronlar Amilotrofik lateral skleroz ve motor nöron diğer nörodejeneratif hastalıkların in vitro modelleme için kullanılabilir. Homojen motor nöron nüfus hücre tipi spesifik ilaç gösterimleri için önemli bir kaynak temsil edebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Motor nöron (MN) dejenerasyonu amilotrofik lateral skleroz (ALS) ve spinal kas atrofi (SMA) gibi insan hastalıklarında etken rol oynar. İnsan MN karmaşıklığı özetlemek uygun in vitro hücre modeli sistemleri kurulması yeni terapötik yaklaşımlar gelişimine yönelik önemli bir adımdır. Belirgin plurilineage farklılaşma özellikleri ile donatılmış olan indüklenen pluripotent kök hücreleri (ıpscs), şimdi motor nöron hastalıkları etkilenen hastaların bir dizi türetilmiştir1,2. MN hastalıklarına ilişkili patojen mutasyonları taşıyan ek IPSC hatları, kontrol "sağlıklı" pluripotent kök hücreleri3' ten başlayarak gen düzenleme ile üretilir. Bu çizgiler in vitro hastalık modelleme ve ilaç taraması için yararlı araçları temsil eder, MNs içine IPSC farklılaşma için uygun yöntemler mevcuttur sağlanır. Bu yöntemin gelişiminin arkasındaki mantık, MN hastalıklarıyla ilgilenen bilimsel toplumu, Olgun fonksiyonel MNs 'ye yol veren hızlı ve verimli bir farklılaşma protokolüyle sağlamaktayız. Bu yöntemin ilk avantajı, yürütme zaman dilimi olur. Güç başka bir ilgili noktası herhangi bir arıtma adım eliminasyon gelir. Son olarak, protokol motor nöronların iki farklı nüfus oluşturmak için kullanılabilir.

MNs farklı alt türleri oluşturma olasılığı MN hastalıkları modelleme için özellikle ilgilidir. Tüm MN alt türleri ALS ve SMA 'da eşit derecede savunmasız değildir ve farklı motor ünitelerinde semptomların başlangıcı prognozu büyük ölçüde etkiler. ALS 'de, üst ve alt ekstremitelerde başlayan semptomlarla spinal başlangıçlar yaklaşık 3-5 yıl içinde ölüme yol açar4. Tersine, kraniyal MNS dejenerasyonu ile başlayan bulber başlangıcı, en kötü prognoz vardır. Dahası, RNA-bağlayıcı proteinleri FUS ve TDP-43 mutasyonları olan hastalarda SOD1 mutasyonları5olan bireylere göre, bulber başlangıcı yüzdesi önemli ölçüde daha yüksektir. Alternatif MN farklılaşma protokollerinin neredeyse bütünlüğü, ipscs6,7,8türevlerini ayırt etmek için omurilik karakterini gösteren retinoik asit (ra) aktivitesine dayanır. Bu spesifik MN alt türlerinden9,10koruyucu olabilir içsel faktörler, eğitim olasılığını sınırlar.

Fare embriyonik kök hücrelerinde bir önceki çalışma ile tutarlı11, son zamanlarda ınsan ıpscs ektopik ifade Ngn2, Isl1 ve LHX3 (NIL) BIR spinal MN kimlik indükler göstermiştir, Ngn2 ve Isl1 artı Phox2a (n) kranial MNS12belirtin. Bu nedenle, 12 gün boyunca işlevsel özelliklere sahip insan MNs üretimini sağlayan etkili bir protokol geliştirdik. Bu yöntemin amacı, kısa bir zaman diliminde ve arıtma (örneğin, FACS) gerek kalmadan elde etmektir, hücre nüfusu yüksek spinal veya kranial kimlik ile MNs için zenginleştirilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Insan iPSCs 'nin Bakımı

  1. Matris kaplı plakaların hazırlanması
    1. Çözme bir 5 mL matris şişe (bkz. malzeme tablosu) 4 °c gece. Orijinal matris stokları farklı stok konsantrasyonlarda gelir ve plakaya veri sayfasında belirtilen seyreltme faktörü göre yapılır, bireysel lot için özel. Matrisin erken jelini önlemek için şişe ve tüpler buz soğuk tutmak önemlidir. Buz üzerinde önceden soğutulmuş cryotubes içinde plakaya içine matris dağıtma. Kullanılmayan plakaya-20 °c ' de dondur.
    2. Yaklaşık 2 h çözülmek için buzda bir kısım yerleştirin.
    3. 50 ml konik tüpte 20 ml soğuk dmem/F12 ile matrisin kısım seyreltmeli.
    4. İyi karıştırın ve 35 mm yemeklere (diğer yemeklerin yüzey alanı başına eşdeğer tutarlar) 1 mL seyreltilmiş matrisin dağıtımı yapın.
    5. Kaplama sağlamak için oda sıcaklığında 1 saat için seyreltilmiş matris içeren yemekleri tutun.
      Not: Parafilm ile mühürlenmiş yemekler, 2 haftaya kadar 4 °C ' de depolanabilir.
  2. Stok çözeltisi (20 ml) ve 1 adet yumuşak hücre dağılma reaktörünün çalışma plakaya hazırlanması (bkz. malzeme tablosu).
    1. PBS 'de 10 mg/mL 'ye toz eritin (CA2 +/mg2 + ücretsiz).
    2. 0,22 μm filtre membran ile filtre sterilize edilir.
    3. 20 plakaya (her biri 1 ml) hazırlayın ve-20 °c ' de saklayın.
    4. Kullanmadan önce, PBS 'de bir kısım seyreltin (CA2 +/mg2 + ücretsiz) 1 mg/ml (1x çalışma aliquots).
      Not: 1x çalışma plakaya 2 hafta kadar 4 °c ' de depolanabilir.
  3. İnsan IPhone 'ları geçmekle.
    1. Başlamadan önce: 4 °C ' de depolanırsa, 37 °C ' de kuluçsa ön sıcak matris kaplı plakalar 20-30 dk. oda sıcaklığında önceden sıcak insan iPSC orta miktarı (bkz. malzeme tablosu) gerekli. Ön sıcak DMEM/F12.
    2. Aspirate kültür ortamı.
    3. Ipscs 'yi PBS ile durulayın (CA2 +/mg2 + ücretsiz).
    4. 1x nazik ayrışma solüsyonu ekleyin (35 mm 'lik bir çanak için 0,5 ml). 37 °C ' de kolonilerin kenarları tabandan ayrılmaya başlayana kadar genellikle 3-5 dak.
    5. Yumuşak ayrışma çözümünü aspirate, IPSC kolonilerini ayırmamaya dikkat edin.
    6. Hücreleri dmem/F12 (35 mm çanak için 2 ml) ile yıkayın ve hücreleri ayırmak için dikkatli olmak Aspire. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın.
    7. İnsan iPSC Orta (35 mm çanak için 1 mL) ekleyin.
    8. Kolonileri bir hücre kaldırıcısı ile yavaşça ayırın ve 15 mL tüpüne aktarın.
    9. Bir P1000 pipetör 3-4 kez ile yukarı ve aşağı pipetleme tarafından yavaşça hücre kümeleri kırmak.
    10. Matris kaplı plaka (ler) den süpernatant aspirate.
    11. İnsan iPSC orta uygun kültür hacmi hücreleri tohum. Bölünmüş oranı satırdan satıra değişebilir ve yaklaşık 1:4-1:8. Günlük orta değiştirin.

2. NIL ve NıP Indüklenebilir iPSC hatları üretimi

  1. Hücre transfeksiyon.
    1. Hücreleri PBS ile durulayın (CA2 +/mg2 + ücretsiz).
    2. Hücre ayrışma reaktif ekleyin (bkz. malzeme tablosu) (35 mm çanak Için 0,35 ml) ve tek hücreler ayrılıncaya kadar 37 °c ' de inkübasyon (5-10 dk).
    3. Bir P1000 pipetör 3-4 kez ile yukarı ve aşağı pipetleme ile yavaşça komple hücre ayrımı.
    4. 15 mL 'Lik bir tüpte toplayın ve PBS (CA2 +/mg2 + ücretsiz) ' ye 10 ml ekleyin. Hücreleri say.
    5. Pellet 106 hücreler ve pelletini içinde 100 μL tampon R (hücre Elektroporasyon kiti dahil, bkz. malzeme tablosu).
    6. Transfeksiyon için Plasmid DNA ekleyin: 4,5 μg transpoze vektörü (EPB-BSD-TT-NIL veya EPB-BSD-TT-NIP12) ve 0,5 μg piggybac transposase Plasmid13.
    7. Hücre Elektroporasyon sistemi ile transfect ( malzeme tablosunabakın) üreticinin talimatlarına göre ve daha önce aşağıdaki parametrelerle3 açıklanan: 1.200 V voltaj, 30 MS genişlik, 1 darbe. 10 μM Y-27632 ile tamamlayıcı insan IPSC orta hücreleri tohum (ROCK inhibitörü, malzeme tablosubkz) 6 mm matris kaplı çanak.
  2. Antibiyotikler ile seçim.
    1. Transfeksiyondan iki gün sonra kültür ortamına 5 μg/mL Blasticidin ekleyin.
    2. Transfürif olmayan hücrelerin çoğu 48 h 'de Blasticidin seçimi içinde ölecek. Genomda transgenler entegre değil hücreleri karşı-seçmek için en az 7-10 gün boyunca Blasticidin hücreleri tutun.
    3. Farklı sayıda transgenler ve farklı entegrasyon sitesi içeren hücrelerden oluşan karışık bir nüfus olarak stabil transfenli hücreleri koruyun veya tek klonları yalıtın.
    4. 1 μg/mL doksisiklin indüksiyonunda, Ngn2 için transgeni özgül astar ile RT-PCR tarafından, transgenlerin etkili bir ifade için kontrol etmek için ek bir çanak hazırlamak (Forward: TATGCACCTCACCTCCCCATAG; Ters: GAAGGGAGGAGGGCTCGACT), daha önce açıklanan12.
    5. Bu aşamada, insan iPSCs (bkz. malzeme tablosu) için donma ortamında NIP-ipsc hatlarının romanını dondur.

3. motor neuron farklılaşma

  1. Hücrelerin hücre kesilmesi reakajıyla açıklandığı gibi ayırmak (Steps 2.1.1.-2.1.3.). 15 mL tüp ve DMEM/F12 5 hacimiyle seyreltilmiş hücreleri toplayın. 10 μM kaya inhibitörü ile tamamlayıcı hücre ve insan ipsc orta pelletini Pellet. 62.500 hücreler/cm2yoğunluğu matris kaplı yemeklerle hücreler ve tohum saymak.
  2. Sonraki gün, DMEM/F12 ile orta değiştirin, 1x istikrarlı L-glutamin analog ile tamamlayıcı, 1x esansiyel olmayan amino asit (NEAA) hücre kültürü takviyesi ve 0.5 x penisilin/streptomisin, ve içeren 1 μg/mL doksisiklin. Bu farklılaşma gün 0 olarak kabul edilir. 1. gün, orta ve doksisiklin yenileyin.
  3. 2. gün, 5 μM DAPT, 4 μM SU5402 ve 1 μg/mL doksisiklin içeren (1x B27, 1x istikrarlı L-glutamin analog, 1x NEAA ve 0.5 x penisilin/streptomisin) olan Nörobasal Orta (neurobasal/B27) orta, orta değiştirmek (bkz . malzeme tablosu ). Her gün 5 kadar orta ve doksisiklin yenileyin.
  4. 5. gün: hücre ayrışma reaktif ile hücreler ayrışma (bkz. malzeme tablosu).
    1. Hücreleri PBS ile durulayın (CA2 +/mg2 + ücretsiz).
    2. Hücre ayrışma reakajının (35 mm 'lik bir çanak için 0,35 ml) ekleyin ve tüm hücre tek tabakalı çanak ayrılır kadar 37 °c ' de inkübasyon. Tek hücrelerin inkübasyon sırasında ayrılmaz unutmayın.
    3. 1 mL DMEM/F12 ekleyin ve hücreleri 15 mL 'Lik bir tüpte toplayın.
    4. Bir P1000 pipetör 10-15 kez ile yukarı ve aşağı pipetleme ile yavaşça komple hücre ayrımı.
    5. 4 mL DMEM/F12 ekleyin ve hücreleri saymak.
    6. Bu aşamada, üretici talimatlarına göre, hücre donma Orta ( malzeme tablosunabakın) motor nöron ataları dondurmak.
    7. Pellet hücreleri ve nöronal Orta içinde pelletini (nörobazal/B27 orta ile tamamlayıcı 20 ng/ml BDNF, 10 ng/ml GDNF ve 200 ng/ml L-askorbik asit, bkz: malzeme s tablosu) 10 μM kaya inhibitörü ile desteklenmektedir.
    8. Poly-ornitin/laminin üzerindeki hücreleri tohumlama-veya alternatif olarak matris kaplı desteklerin yoğunluğu 100.000 hücreler/cm2. İmmünostatik analiz için polimer lamel magazini (bkz. malzeme tablosu) ile μ-Slide plastik destekler kullanın.
  5. 6. gün, taze nöronal orta ROCK inhibitörü yoksun orta değiştirin. Sonraki günlerde, her 3 günde bir ortamın yarısını yenileyin. Kültür ortamı, yüzeyden dekolmanı önlemek için çok dikkatli bir şekilde değiştirilmelidir.

4. immünostam Analizi

  1. Hücre fikreme. Hücreleri PBS ile durulayın (CA2+/mg2 +ile) ve PBS 'de% 4 civarında formaldehite (CA2 +/mg2 +ile) Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inküye yapın.
    Dikkat: Paraformaldehyde zehirli ve kansere neden olduğundan şüpheleniliyor. Cilt ve gözler ile temasından kaçının ve kimyasal duman kaputu altında tutunuz.
  2. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 0,1 Triton X-100 içeren PBS (CA2 +/mg2 +ile) ile geçirgen.
  3. Antikor engelleme çözeltisi içinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inküye (ABS:% 3 BSA, PBS 'de CA2 +/mg2 +ile).
  4. ABS: Anti-TUJ1 (1:1000; tavşan) ve anti-Oct4 (1:200; fare) veya anti-sohbet (Anti-Kolin asetiltransferaz; 1:150; keçi) Primer antikorlar ile Oda sıcaklığında 1 h için inküye. Bkz. malzeme tablosu.
  5. ABS 'de uygun eşek ikincil antikor çifti ile Oda sıcaklığında 45 dk için inküat: Anti-fare Alexa Fluor 647 (1:250), Anti-tavşan Alexa Fluor 594 (1:250) ve anti-keçi Alexa Fluor 488 (1:250). Bkz. malzeme tablosu.
  6. 0,4 μg/mL DAPı 'de 5 dakika boyunca oda sıcaklığında, çekirdekleri etiketlemek için inküye yapın.
  7. Floresan mikroskobun görüntülenmesi için hücreleri montaj Orta (bkz. malzeme tablosu) ile bağlayın.

5. yama ile fonksiyonel karakterizasyon-kelepçe kayıtlar

  1. HEPES hazırlamak-equilibrated dış solüsyon (NES) aşağıdaki gibi: 140 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mm MgCl2, 10 mm HEPES, ve 10 mm glikoz. 290-300 MΩ arasında Osmolarite ayarlayın. 1N NaOH kullanarak 7,3 için pH ayarlayın ve çözümü 4 °C ' de saklayın.
  2. İç solüsyonu hazırlayın: 140 mM K-glukonat, 2 mM NaCl, 5 mM BAPTA, 2 mM MgCl2, 10 mm HEPES, 2 mm MG-ATP, 0,3 mm na-GTP. 1m Koh ile 7,3 için pH ayarlayın ve Osmolarite yaklaşık 290 MΩ ayarlanır kontrol edin. Çözümü-20 °C ' de küçük aliquots 'da dondurur.
  3. Deneyleri çalıştırmadan önce, NES çözümünü su banyosundan yaklaşık 28-30 °C ' ye önceden ısıtın.
  4. Bazı borosilikat mikropipetleri çekin (ID 0,86 mm; OD 1,5 mm) bir uç direnci taşıyan: 5-6 MΩ ve pipet tutucusuna monte etmeden önce hücre içi çözeltisi ile doldurun.
    Not: Tel yüzeyinde AgCl 'nin üniforma tabakası oluşturmak için en az 30 dakika boyunca kayıt elektrot ve referans elektrot su klorür Gümüş Teller unutmayın.
  5. Petri çanağını kayıt odasına aktarın ve 1-2 mL/dak 'da NES çözümüyle odasına bırakın. Solüsyonu sıcak tutmak için 30 °C sıcaklıkta bir satır içi ısıtıcıdan geçen akışa izin verin.
  6. Electrofizyoloji kayıt odasını dik mikroskop altında yerleştirin. Yama kelepçe amplifikatör ile membran akımları kaydedin ve uygun bir yazılım ile veri elde.
  7. Amplifikatör kontrol yazılımını açın ve 1 değeri ve 10 kHz 'de Bessel filtresinde sinyal kazanımı ayarlayın. Bessel filtresinin örnekleme frekansından 2,5 kat daha düşük olduğundan emin olun.
  8. Kayıt yazılımında gerilim kelepçe ve akım kelepçe denemeleri için deneysel protokolleri ayarlayın.
  9. Protokol ayarında, epizodik stimülasyon modunu işaretleyiniz ve örnekleme sıklığını 25 kHz olarak ayarlayın. Sonra, dalga formu sekmesine gidin ve gerilim veya geçerli adım genlik ve uzunluğu takip olarak yazın.
  10. Voltaj-Gated sodyum akımları için, 15 gerilim basamakları (50 MS süresi)-100 mV ila + 40 mV (10 mV artışı) kullanın. Yamalı hücreye atladıktan sonra protokol çalıştırın-60 mV amplifikatör üzerinden bir tutma potansiyeli. Benzer şekilde, voltaj-Gated potasyum akımları (250 MS süresi her)-30 mV ile + 50 mV (10 mV artışı)-40 mV kaydedilmiş hücre tutan voltaj basamakları ile uyarılır.
  11. IPSC-türetilmiş kranial ve spinal MNs, kelepçe hücreleri, geçerli kelepçe modunda, bir membran potansiyeli-70 mV ve kullanım 4 akım darbeleri (1 s süresi her) artan amplitüd (+ 20 pA + 80 pA; 20 pA artışı) ateş özelliklerini araştırmak için.
  12. Her hücre voltajı-aktif akımları için elde, uyarılmış ateş aktivitesi ve üç pasif özellikleri tüm hücre kapasitans (cm), hücre membran direnci (RM) ve Istirahat membran potansiyeli (RMP) olarak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1' de farklılaşma yönteminin şematik bir açıklaması gösterilir. İnsan ipscs (WT I Line3) EPB-BSD-TT-NIL veya EPB-BSD-TT-NIP ile transfekte edildi, oluşturulan, Blasticidin seçimi üzerine, istikrarlı ve indüklenebilir hücre hatları12, bundan sonra IPSC-NIL ve IPSC-NIP olarak anılacaktır, sırasıyla. Farklılaşan hücreler pluripotency Marker OCT4 ve Pan-neuronal Marker TUJ1 ifadesi için karakterize edildi. İmmünostik analizi, TUJ1 pozitifliği...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, insan ıpscs 'yi, kemiğe özel transkripsiyon faktörlerinin ektopik ifadesi sayesinde Spinal ve kranial motor nöronlara verimli bir şekilde dönüştürmeyi sağlar. Bu transgenler, doksisiklin ile indüklenebilir ve piggyBac transposon tabanlı vektörü sayesinde genomda stabil bir şekilde entegre edilir. Karma bir nüfusa göre, piggyBac vektörünün bir veya birkaç kopyası, tek hücrelerin genomuna rasgele entegre edilecek ve genom bütünlüğü değişimi riskini arttırır. Dahası, iPSC subklonların Progressive seçimi zaman i...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar açıklamak için hiçbir şey var

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, destek ve teknik tavsiyeler için Life nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia Center 'da Imaging tesisine teşekkür etmek istiyor. Biz yararlı tartışma için yaşam nano bilim merkezi üyelerine minnettarız. Bu çalışmanın kısmen AriSLA (pilot Grant 2016 "StressFUS") dan AR için bir hibe tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Elektrofizyolojik çözeltiler için5-BaptaSigma-AldrichA4926-1G
AccutaseSigma-AldrichA6964-100ML Hücre ayrışma reaktifi
anti-CHATEMD Millipore AB144PAnti-Kolin Asetiltransferaz. İmmün boyama deneylerinde kullanılan birincil antikor. RRID: AB_2079751; Lot numarası: 2971003
anti-keçi Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Bilimsel A11055İmmonofloresan deneyleri için kullanılan ikincil antikor. RRID: AB_2534102; Lot numarası: 1915848
anti-fare Alexa Fluor 647Thermo Fisher Scientific A31571İmmonofloresan deneyleri için kullanılan ikincil antikor. RRID: AB_162542; Lot numarası: 1757130
anti-Oct4 BD Biosciences611202İmmün boyama testlerinde kullanılan birincil antikor. RRID: AB_398736; Lot numarası: 5233722
anti-Phox2bSanta Cruz Biyoteknoloji A.Ş.sc-376997İmmün boyama deneylerinde kullanılan birincil antikor. Lot numarası: E0117
anti-tavşan Alexa Fluor 594 İmmünolojik BilimlerIS-20152-1İmmonofloresan testleri için kullanılan ikincil antikor
, anti-TUJ1 Sigma-Aldrich T2200İmmün boyama deneylerinde kullanılan birincil antikor. RRID: AB_262133
B27Miltenyi Biotec130-093-566Nöronal hücre bakımı için serum içermeyen takviye
BambankerNippon GeneticsNGE-BB02Hücre dondurma ortamı, burada motor nöron progenitörleri için kullanılır
BDNFPreproTech450-02Beyin Kaynaklı Nörotrofik Faktör
BlasticidinSigma-Aldrich203350Prokaryotlarda ve ökaryotlarda protein sentezini inhibe eden nükleosit antibiyotik
BSASigma-AldrichA2153Sığır Serum Albümini. İmmün boyama deneylerinde antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için bloke edici ajan
CaCl2Sigma-AldrichC3881elektrofizyolojik çözeltiler için kimyasallar
Clampex 10 yazılımıMoleküler CihazlarClampex 10Membran akımları kayıt sistemi
Corning Matrigel hESC nitelikli MatrixCorning354277Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) fare sarkomundan sulandırılmış bazal membran hazırlığı. iPSC'nin plastik ve cam desteklere yapıştırılması için kullanılır
CRYOSTEM ACF DONDURMA ORTAMIBiyolojik Endüstriler05-710-1Eİnsan iPSC'leri için dondurma ortamı
D-GlukozSigma-AldrichG5146elektrofizyolojik çözeltiler için kimyasallar
DAPI tozuRoche 102362760014&asal;,6-diamidino-2-fenilindol. Adenin ile bağlanan floresan lekesi– immünofloresan deneylerinde çekirdek boyama için kullanılan DNA'daki timin açısından zengin bölgeler
DAPTAdipoGenAG-CR1-0016-M005Gama sekretaz inhibitörü
DispaseGibco17105-041İnsan iPSC'lerinin nazikçe ayrışması için reaktif
DMEM/F12Sigma-AldrichD6421-500MLHücre kültürü için bazal ortam
DoksisiklinSigma-AldrichD9891-1G & nbsp;epB-Bsd-TT-NIL ve epB-Bsd-TT-NIP vektörlerinden transgenlerin ekspresyonunu indüklemek için kullanılır
DS2U WiCellUWWC1-DS2UTicari insan iPSC hattı
E.Z.N.A Toplam RNA Kiti Omega bio-tekR6834-02Kültürlenmiş ökaryotik hücrelerden RNA'nın toplam ekstraksiyonu için kit
GDNFPreproTech450-10Glial Türetilmiş Nörotrofik Faktör
Gibco Epizomal hiPSC HattıThermo Fisher ScientificA18945Ticari insan iPSC hattı
GlutamaxThermo Fisher Scientific35050038Arttırılmış stabiliteye sahip L-glutamine bir alternatif. Hücre sağlığını iyileştirir.
Elektrofizyolojik çözümler içinHepesSigma-AldrichH4034
RT-qPCR için iScript Ters Transkripsiyon Süper Karışımı GerçekiTaqTM Universal SYBRkullanarak gen ekspresyon analizi için Bio-Rad 1708841 Kiti
 Bio-Rad172-5121 Herhangi bir gerçek zamanlı PCR cihazında boya bazlı kantitatif PCR (qPCR) için optimize edilmiş, kullanıma hazır reaksiyon ana karışımı
K-GlukonatSigma-AldrichG4500kimyasalları Elektrofizyolojik çözeltiler için
KClSigma-AldrichP9333kimyasalları
L-askorbik asitLKT LaboratuvarlarıA7210Hücre kültüründe antioksidan
olarak kullanılır LamininSigma-Aldrich11243217001İn vitro nöral hücrelerin bağlanmasını ve büyümesini teşvik eder
Lazer taramalı konfokal mikroskop Olimpos  iX83 FluoView1200İmmün boyama görüntülerinin elde edilmesi için konfokal mikroskop
Mg-ATPSigma-AldrichA9187elektrofizyolojik çözeltiler için kimyasallar
MgCl2Sigma-AldrichM8266elektrofizyolojik çözeltiler için kimyasallar
Montaj Ortamı Ibidi50001Konfokal mikroskopi ve immünofloresan testleri için kullanılan montaj çözümü
Multiclamp yama-kelepçe amplifikatörüMoleküler Cihazlar700BMembran akımları kayıt sistemi
Na-GTPSigma-AldrichG8877elektrofizyolojik çözeltiler için kimyasallar
NaClSigma-Aldrich71376elektrofizyolojik çözeltiler için kimyasallar
NEAAThermo Fisher Scientific11140035Esansiyel Olmayan Amino Asitler. Hücre büyümesini ve canlılığını artırmak için hücre kültürü ortamı için ek olarak kullanılır.
Neon 100 & mu; L KitiThermo Fisher ScientificMPK10096Hücre elektroporasyon kiti
Neon Transfeksiyon SistemiThermo Fisher ScientificMPK5000Hücre elektroporasyon sistemi
Neurobazal MediumThermo Fisher Scientific21103049Astrosit besleyici katmana ihtiyaç duymadan nöronal hücre popülasyonlarının uzun süreli bakımı ve olgunlaşması için tasarlanmış bazal ortam
NutriStem-XF/FF Biyolojik Endüstriler05-100-1Aİnsan iPSC kültür ortamı
ParaformaldehitElektron Mikroskobu Bilimleri157-8İmmün boyama deneylerinde hücre fiksasyonu için kullanılır
PBSSigma-AldrichD8662-500MLDulbecco'nun Fosfat Tampon Salin, Kalsiyumlu, Magnezyumlu
PBS Ca < sup>2 + < / sup> / Mg2 + < / sup> ücretsizSigma-AldrichD8537-500MLDulbecco'nun Fosfat Tampon Salini, Kalsiyumsuz, Magnezyum
Penisilin / Streptomisin ve nbsp;Sigma-AldrichP4333-100MLPenisilin / Streptomisin çözeltisi, bakterilerden hücre kültürü kontaminasyonunu önlemek için kullanılır.
poli-ornitinSigma-AldrichP4957İn vitro
SU5402Sigma-AldrichSML0443-5MGVasküler endotelyal büyüme faktörü reseptörü 2'nin seçici inhibitörü (VEGFR-2)
Triton X-100 ve nbsp;Sigma-AldrichT87874- (1,1,3,3-Tetrametilbutil) fenil-polietilen glikol,  t-Oktilfenoksipolietoksietanol, Polietilen glikol  tert-oktilfenil eter. İmmün boyama testlerinde hücre geçirgenliği için kullanılır
Dik mikroskopOlympusBX51VICoolSnap Myo kamera ile donatılmış elektrofizyolojik kayıt için mikroskop 
Y-27632  (KAYA inhibitörü)Enzo Yaşam BilimleriALX-270-333-M005 Rho ile ilişkili, sarmal bobin içeren protein kinazın (ROCK) hücre geçirgen seçici inhibitörü. iPSC sağkalımını artırır
μ-Slayt 8 İyi Ibidi80826High&ndash desteği; Sabit hücrelerin mikroskobik analizini sonlandırın
kimyasalları, kimyasalları zamanlı qPCR Green Supermix  Elektrofizyolojik çözeltiler için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dimos, J. T., et al. Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons. Science (New York, NY). 321 (5893), 1218(2008).
  2. Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457 (7227), 277-280 (2009).
  3. Lenzi, J., et al. ALS mutant FUS proteins are recruited into stress granules in induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) derived motoneurons. Disease models & mechanisms. 8 (7), 755-766 (2015).
  4. Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. Amyotrophic lateral sclerosis. Orphanet journal of rare diseases. 4 (3), 1-22 (2009).
  5. Yan, J., et al. Frameshift and novel mutations in FUS in familial amyotrophic lateral sclerosis and ALS/dementia. Neurology. 75 (9), 807-814 (2010).
  6. Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).
  7. Amoroso, M. W., et al. Accelerated high-yield generation of limb-innervating motor neurons from human stem cells. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (2), 574-586 (2013).
  8. Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
  9. Allodi, I., et al. Differential neuronal vulnerability identifies IGF-2 as a protective factor in ALS. Scientific reports. 6, 25960(2016).
  10. Kaplan, A., et al. Neuronal matrix metalloproteinase-9 is a determinant of selective neurodegeneration. Neuron. 81 (2), 333-348 (2014).
  11. Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).
  12. De Santis, R., Garone, M. G., Pagani, F., de Turris, V., Di Angelantonio, S., Rosa, A. Direct conversion of human pluripotent stem cells into cranial motor neurons using a piggyBac vector. Stem Cell Research. 29, 189-196 (2018).
  13. Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
  14. Sances, S., et al. Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Nature Neuroscience. 16 (4), 542-553 (2016).
  15. Miller, J. D., et al. Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging. Cell stem cell. 13 (6), 691-705 (2013).
  16. Lenzi, J., et al. Differentiation of control and ALS mutant human iPSCs into functional skeletal muscle cells, a tool for the study of neuromuscolar diseases. Stem Cell Research. 17 (1), 140-147 (2016).
  17. Zhang, Y., et al. Rapid Single-Step Induction of Functional Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  18. Theka, I., et al. Rapid generation of functional dopaminergic neurons from human induced pluripotent stem cells through a single-step procedure using cell lineage transcription factors. Stem cells translational medicine. 2 (6), 473-479 (2013).
  19. Pawlowski, M., et al. Inducible and Deterministic Forward Programming of Human Pluripotent Stem Cells into Neurons, Skeletal Myocytes, and Oligodendrocytes. Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).
  20. Li, X., et al. Fast Generation of Functional Subtype Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 11 (4), 998-1008 (2018).
  21. Nehme, R., et al. Combining NGN2 Programming with Developmental Patterning Generates Human Excitatory Neurons with NMDAR-Mediated Synaptic Transmission. Cell reports. 23 (8), 2509-2523 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Human iPSCsMotor Neuron DifferentiationPiggyBac VectorsNgn2 Isl1 Lhx3Ngn2 Isl1 Phox2aSpinal Motor NeuronsCranial Motor NeuronsDoxycycline InductionCholine AcetyltransferaseAction Potential Firing

İlgili makaleler