Yöntem makalesi

Vasküler Endotel Hücrelerini Doğrudan Gözlemlemek Için En Yüz İmmünofloresan Boyama

DOI:

10.3791/59325

⸱

20 Ağustos 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Institute of Cardiovascular Diseases, Shanghai Jiao Tong University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, doğrudan fare aort endotel hücrelerini gözlemlemek için immünofloresan boyama için bir protokol sıyoruz. Bu teknik, endotel hücrelerinin farklı akış desenlerinde hücresel ve moleküler fenotiplerini incelerken ve ateroskleroz gelişiminde yararlıdır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endotel fenotip ve morfolojideki anormal değişiklikler ateroskleroz patogenezinde ilk olaylar olarak kabul edilir. Bozulmamış endotel doğrudan gözlem işlevsiz endotel hücrelerinde hücresel ve moleküler olayları anlamak için değerli bilgiler sağlayacaktır. Burada, bilim adamlarının bozulmamış endotel yüzeyinin net görüntülerini elde etmelerini ve molekül ekspresyon desenlerini yerinde analiz etmelerini sağlayan değiştirilmiş bir yüz immünofloresans boyama tekniğini tanımlıyoruz. Yöntem basit ve aort farklı sitelerde tüm endotel monolayer gözlemlemek için güvenilir. Bu teknik, özellikle erken bir aşamada, ateroskleroz patofizyolojisi anlamak için umut verici bir araç olabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vaskülatürerken erken değişiklikler öncelikle endotel, hangi hücreler arası sıkı kavşak kompleksleri ile kan ve damar duvarı arasında seçici bir bariyer olarak işlev ler başlatın1. Önemli kanıtlar endotel fonksiyonu2modülasyonunda kan akışının mekanik etkileri için kritik bir rol işaret ediyor. Sıvı kesme stresi, kan akımı tarafından oluşturulan bir sürtünme kuvveti, farklı damar hücre morfolojisi ve fonksiyonu ayırt edici şekillerde, farklı vasküler sitelerde belirli akış paradigmaları bağlı olarak2,3. Aterosklerotik lezyonlar tercihen rahatsız kan akımı bölgelerinde meydana (d-akış), damar eğrilikleri gibi, akış bölücüler, ve şube noktaları, sabit akış bölgeleri ile karşılaştırıldığında (s-akış), arter in düz segment gibi. Bu nedenle, endotel morfolojisi ve molekül ekspresyonu desenlerinin doğrudan gözlemi, değişen akış paradigmaları altında endotel hücrelerinin yapısal ve fonksiyonel fenotiplerine önemli bilgiler sağlamalıdır.

Kültürlü endotel hücreleri, sıvı kesme stresinin, çevreleyen sitokinlerin ve hücre-hücre dışı matriks etkileşimlerinin etkisinin kaybolması nedeniyle kısmen in vivo'da yaptıkları gibi gerçek fenotipi ifade edemeyebilirler. Bu yardım için, bozulmamış endotel hücre monolayer klasik immünohistokimya kullanılarak enine kesitler üzerinde incelenebilir. Ancak, endotel monolayer genellikle açıkça gözlemlenemez o kadar ince ve kırılgandır. En yüz immünohistokimya endotel iç yüzeyini gözlemlemek için kullanılmıştır ama endotel kolayca altta yatan doku dan sıyrılmış çünkü sonuçları ya karmaşık ya da düzensiz, ya da sıçan veya tavşan arteriyel duvarın sadece bir parçası, kimin duvarları kalın,4,5monte edilir.

Fare modelleri birçok açıdan diğer hayvanlara göre önemli avantajlara sahiptir. Burada C57BL/6 farede aort kemeri ve torasik aortun endotel hücrelerini analiz etmek için modifiye edilmiş bir en yüz immünofloresans tekniği ni uyguluyoruz. Böyle bir teknik yaygın olarak farklı akış desenleri endotel patofizyolojisi çalışma ve aterosklerozgelişiminde6,7,8,9,10kullanılmıştır. Bu yöntem bilim adamlarının endotel yüzeyinin tamamını net bir şekilde gözlemlemelerine ve farklı sıvı kesme stresi altındaki bölgelerde belirli bir proteinin ifade desenlerini karşılaştırmalarına olanak tanır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan deneyleri Şangay Jiao Tong Üniversitesi Hayvan Kaynakları Komitesi tarafından onaylanan deneysel protokollere uygun olarak yapılmıştır.

1. Fare aortu perfüzyonu

  1. Kısaca, sodyum pentobarbital (50 mg /kg vücut ağırlığı) intraperitoneal enjeksiyonları ile 12 haftalık C57BL/6 fareler anestezik. Kuyruğu hafifçe çimdikleyerek uygun anesteziyi onaylayın.
    NOT: Herhangi bir hareket gözlenmezise, hayvan deneylere başlamak için yeterince anesteziye başlar.
  2. Farenin patilerini yapışkan bantlarla kağıt havlu yığınına bantlayın.
  3. Pİşir ile farenin deri tutun ve toraks üstüne karın makas bir çift ile deri kesti.
  4. Göğüs kafesinin altındaki karın boşluğunu keskin bir makasla açın.
  5. Sternumu forsepsle kaldırın ve diyaframı kesin; sonra, göğüs kafesini kesilerek göğüs boşluğunu ortaya çıkar.
  6. Vena kavasını karaciğerin hemen üstünde, makasla kes.
  7. Basınç perfuse (100 mmHg) akciğerler ve karaciğer soluk hale gelene kadar sol ventrikül ile 40 adet / mL heparin içeren önceden chilled normal tuzlu ile 5 dakika için arterağacı. Daha sonra, 3 dakika için fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.4) prechilled% 4 paraformaldehit ile perfuse.
  8. Aort maruz kalana kadar tüm kasları, organları ve yağ çıkarın.
  9. Fareyi bir kesme mikroskobunun altına yerleştirin.

2. Aortun diseksiyonu ve uzunlamasına açılması

  1. Aortu bir diseksiyon mikroskobu altında açıkça ortaya çıkarın ve aort boyunca bağ dokularını mümkün olduğunca temiz, hassasçerterler ve bir çift hassas makas ile çıkarın (Şekil 1).
  2. Bir çift hassas makasla kalpten çölyak gövdesine kadar göğüs aortu inceltin ve PBS ile 6 cm hücrekültür çanak içine aort koyun. Düz segment karşılanana kadar aort uzunlamasına, daha küçük eğri boyunca ve daha büyük eğri boyunca açın. Şekil2'de gösterildiği gibi, aort kemerinin üç dalını, innominate de dahil olmak üzere, sol ortak karotis ve sol subklavian arteri mikrosiküllü olarak kesin.

3. Aortun ön tedavisi ve immünboyamı

  1. 10 dakika PBS%0.1 polioksietilen oktil fenil eter ile aortu permeabilize edin ve 12 kuyulu hücre kültür plakasında oda sıcaklığında %2,5 polisorbat 20'ye 1 saat oda sıcaklığında bulunan Tris-tamponlu salin (TBS) %10 normal keçi serumu ile engelleyin.
  2. Daha sonra, 5 g/mL tavşan anti-VCAM-1 ve 5 g/mL sıçan anti-VE-kadherin ile aort inkübülmesi engelleme tampon, bir gecede 4 °C.
  3. Numuneyi yıkama solüsyonuyla 3x duruladıktan sonra (%2,5 polisorbat içeren TBS 20), floresan konjuge ikincil antikorları (1:1.000 seyreltme, Alexa Fluor 555 etiketli anti-tavşan IgG ve Alexa Fluor 488 etiketli anti-rat IgG) 1 saat boyunca odada uygulayın Sıcaklık. Yıkama çözeltisinde 3 x durulayın.
  4. 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (1 μg/mL) ile aort le karşı leke 10 dakika ve yıkama çözeltisinde 3x durulayın.

4. Aortun cam kaydırağa montajı

  1. Aortu, parlak yüzeyi aşağı doğru bir kapak kaymasına yerleştirin ve daha önce kapak kayması üzerine bırakılan antifade montaj çözeltisine yavaşça hareket ettirin. Numuneyi düz tutmak için aortu hafifçe gerin.
  2. Kapak kayma ters ve slayt cam üzerine koyun. Numune ve cam arasında herhangi bir hava kabarcığı kalmasına izin vermemeye özen gerekir.

5. Aort gözlemi

  1. Bir lazer tarama konfokal mikroskop ile aort inceleyin.
  2. Image-Pro Plus yazılımı ile en yüz görüntülerinde istenilen bölgeden farklı kanalların renk yoğunluklarını analiz edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

12 haftalık Bir C57BL/6 fare ötenazi ve 40 adet / mL heparin içeren normal tuzlu ile perfüzyon ve daha sonra, prechilled 4% paraformaldehit. Fare aort bir diseksiyon mikroskobu altında maruz kaldı (Şekil1), diseksiyon, ve uzunlamasına açık kesilmiş (Şekil 2). Vasküler endotel hücrelerinin en yüz immünoreskence boyaması Şekil 3 ve Tablo1'de gösterildiği gibi yapılmıştır. En yüz immüno...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endotel lipidler, inflamatuar mediatörler ve sıvı kesme stresi1,11,12dahil olmak üzere çok sayıda proaterojenik faktörlere maruz kalmaktadır. Yerinde endotel hücrelerinin doğrudan gözlem hücre morfolojisi değişiklikleri analiz etmek için özel avantajlar sağlar, hücreler arası kavşaklar, ve yaralanma uyaranlarına yanıt molekül ekspresyon desenleri.

Önceki çalışmalar arteriyel duvar endotel gözlemlemek ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 81670451, 81770430), Şangay Rising-Star Programı (Grant No. 17QA1403000) ve Şangay Belediye Hükümeti Bilim Teknolojisi Komitesi (Grant No. 14441903002, 15411963700).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Antifade mountantServicebioG1401
Hassas ForsepsRWD Yaşam BilimleriF11001-11
Hassas MakasRWD Yaşam BilimleriS12003-09
Diseksiyon ForsepsRWD Yaşam BilimleriF12005-10
Mciro Yaylı MakasRWD YaşamBilimleri S11001-08
Polioksietilen oktil fenil eter (Triton X-100)AmrescoM143
Polisorbat 20 (Tween 20)Amresco0777
VCAM-1 antikoruAbcamab134047
VE-Cadherin antikoruBD Biosciences555289
Alexa Fluor 555 etiketli anti-tavşan IgGinvitrojenA-31572
Alexa Fluor 488 etiketli sıçan önleyici IgGinvitrogenA-21208
Lazer Tarama Mikroskobu Carl Zeiss
·

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gimbrone, M. A. Jr, Garcia-Cardena, G. Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis. Circulation Research. 118 (4), 620-636 (2016).
  2. Zhou, J., Li, Y. S., Chien, S. Shear stress-initiated signaling and its regulation of endothelial function. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (10), 2191-2198 (2014).
  3. Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).
  4. Warren, B. A. A method for the production of "en face" preparations one cell in thickness. Journal of Microscopy. 85 (4), 407-413 (1965).
  5. Azuma, K., et al. A new En face method is useful to quantitate endothelial damage in vivo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 309 (2), 384-390 (2003).
  6. Son, D. J., et al. The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis. Nature Communications. 4, 3000(2013).
  7. Go, Y. M., et al. Disturbed flow enhances inflammatory signaling and atherogenesis by increasing thioredoxin-1 level in endothelial cell nuclei. PLOS ONE. 9 (9), e108346(2014).
  8. Kundumani-Sridharan, V., Dyukova, E., Hansen, D. E. 3rd, Rao, G. N. 12/15-Lipoxygenase mediates high-fat diet-induced endothelial tight junction disruption and monocyte transmigration: a new role for 15(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid in endothelial cell dysfunction. The Journal of Biological Chemistry. 288 (22), 15830-15842 (2013).
  9. Liu, Z. H., et al. C1q/TNF-related protein 1 promotes endothelial barrier dysfunction under disturbed flow. Biochemical and Biophysical Research Communications. 490 (2), 580-586 (2017).
  10. Wang, X. Q., et al. Thioredoxin interacting protein promotes endothelial cell inflammation in response to disturbed flow by increasing leukocyte adhesion and repressing Kruppel-like factor 2. Circulation Research. 110 (4), 560-568 (2012).
  11. Mitra, S., Deshmukh, A., Sachdeva, R., Lu, J., Mehta, J. L. Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis implications in antioxidant therapy. The American Journal of the Medical Sciences. 342 (2), 135-142 (2011).
  12. Stancel, N., et al. Interplay between CRP, Atherogenic LDL, and LOX-1 and Its Potential Role in the Pathogenesis of Atherosclerosis. Clinical Chemistry. 62 (2), 320-327 (2016).
  13. Nerem, R. M., Levesque, M. J., Cornhill, J. F. Vascular Endothelial Morphology as an Indicator of the Pattern of Blood Flow. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 172-176 (1981).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Aort DiseksiyonuKonfokal MikroskopiVCAM 1 EkspresyonuVE Kaderin Mark rAk kan Kayma GerilmesiDAPI Kar BoyamaEndotelyal MorfolojiAteroskleroz Ara t rmalar

İlgili makaleler