Yöntem makalesi

Düşük-Orta Throughput'ta Kültürlü Memeli Hücrelerinde Hücre Büyümesini ve SağkalımLarını Etkileyen Bileşikleri Belirleme Stratejisi

8.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/59333

⸱

22 Eylül 2019

 ,  ,  , 
1National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS), Neurotherapeutic Development Unit (NTDU), National Institutes of Health (NIH)

Bu makalede

Özet

Genellikle kültürlü hücreler üzerinde bileşiklerin bir dizi potansiyel sitotoksisite değerlendirmek için gereklidir. Burada, 96-iyi formatında toksik bileşikler için güvenilir bir tarama stratejisi açıklar.

Özet

Sitotoksisite terapötik yararları olabilir ilaçlar çalışırken ölçülmesi gereken kritik bir parametredir. Bu nedenle, birçok ilaç tarama tahlilleri tek tek bileşikler için profilli kritik özelliklerinden biri olarak sitotoksisite kullanmak. Kültür hücreleri daha pahalı ve emek yoğun hayvan modellerinde umut verici kurşun bileşikleri takip geçmeden önce sitotoksisite değerlendirmek için yararlı bir modeldir. İnsan nöral kök hücreleri (NSC) hattında hücre büyümesini etkileyen bileşikleri belirlemek için bir strateji tanımlıyoruz. Strateji, hücre numarasını değerlendirmek için iki tamamlayıcı tahlil kullanır. Bir tsay 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromür (MTT) hücre numarası için bir proxy olarak formazan azaltılması ile çalışır ve diğer doğrudan tdTomato ifade NSCs sayar. İki tahlil tek bir deneyde aynı anda yapılabilir ve emek yoğun, hızlı ve ucuz değildir. Bu gösteride açıklanan strateji 96-iyi plaka formatında toksisite için bir keşif birincil ekranda 57 bileşikler test etti. Üç isabet birincil ekran olarak aynı testi set-up kullanarak altı noktalı doz yanıtı daha karakterize edildi. Toksisite için mükemmel doğrulama sağlamanın yanı sıra, iki tahlil sonuçlarının karşılaştırılması hücre büyümesinin diğer yönlerini etkileyen bileşiklerin belirlenmesinde etkili olabilir.

Giriş

Terapötik potansiyeli olan bir kimyasal bileşik için belirlenmesi gereken en önemli özelliklerinden biri hayvan hücrelerine toksisitesidir. Bu özellik bir ilaç daha kapsamlı bir çalışma için iyi bir aday olup olmadığını belirleyecektir. Çoğu durumda, minimal toksisite ile bileşikler aranır ama belirli hücre türlerini öldürmek için kapasiteye sahip bir bileşik ilgi olduğu durumlar vardır, örneğin, anti-tümörijenik ilaçlar. Tüm hayvanlar sistemik toksisiteyi belirlemek için en iyi model sistemler olmasına rağmen, maliyet ve işçilik dahil birkaç bileşikler den fazla test edilmesi gerektiğinde engelleyicidir. Bu tür memeli hücre kültürü genellikle en verimli alternatif olarak kullanılır1,2. Küçük ve orta ölçekli ilaç ekranları, hücre kültüründe toksisitenin değerlendirilebileceği önemli bir yöntemdir. Bu ekranlar, tek tek sinyal yollarını hedefleyen açıklamalı kitaplıkları sorgulamak için kullanılabilir. Böyle bir ekranın genel biçimi başlangıçta tek bir dozda kütüphanedeki tüm bileşikleri test etmektir (genellikle 10 μM) bir keşif birincil toksisite ekranında, ve sonra tam toksisite karakterize etmek için derinlemesine bir ikincil doz yanıt ekranı gerçekleştirmek birincil ekrandan isabet profili. Bu stratejiyi uygulamak için yöntemler burada açıklanacaktır ve toksik bileşikleri tanımlamak ve karakterize etmek için hızlı, verimli ve ucuz bir yol sağlar.

Memeli hücrelerinde küçük bileşiklerin ve nanomateryalin sitotoksisitesini değerlendirmek için birden fazla yöntem geliştirilmiştir3,4. Bazı malzemelerin yanıltıcı sonuçlar sağlayan tahkikat ile etkileşime girebileceği unutulmamalıdır ve bu tür etkileşimler toksisite ekranlarından isabet karakterize ederken test edilmelidir4. Sitotoksisite tahlilleri trypan mavi dışlamaiçerir 5, laktat dehidrogenaz (LDH) serbest tahlil6, Alamar mavi tahlil7, kalsin asetoksimtil ester (AM)8, ve ATP tahlil9. Tüm bu tahliller hücre numarası için bir proxy olarak hizmet verebilir hücre metabolizmasının çeşitli yönlerini ölçmek. Tüm faydalar sunarken, tetrazolium tuz bazlı tahliller 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromür (MTT), 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfopheny)-2H-tetrazolium-5-karboksiyanilid iç tuz (XTT)-1, ve 4-4-4-4-4-4-[ İyodofenil]-2-[4-nitrofenil]-2H-5-tetrazolio)-1,3-benzen disülfür (WST-1)10,11 düşük maliyetle iyi doğruluk ve kullanım kolaylığı sağlar. Bu gösteride kullanılacak olan MTT, mitokondriyal redüktaz ile çözünmez formazan'a indirgenir ve bu dönüşüm oranı hücre sayısı ile güçlü bir şekilde ilişkilidir. Bu titrek rutin olarak hem küçük ölçekte hem de 2.000 bileşiğin12'yekadar olduğu tarama kütüphanelerinde kullanılmaktadır. Hücrelerin etiketli bir işaretçi tarafından doğrudan sayma hücresel sayıyı değerlendirmek için başka bir yöntem sunar ve MTT tsay aksine hücresel büyüme dinamikleri hakkında ek bilgi sağlayabilir. Birkaç kamuya açık algoritmalar otomatik hücre sayısı analizleri gerçekleştirmek için kullanılabilir ve görüntüleme okuyucuları için yazılım paketlerinin bir parçası olan özel algoritmalar da vardır13,14. Bu yöntem açıklamasında, genetik olarak tdTomato15'i ifade etmek için düzenlenmiş bir insan nöral kök hücresi (NSC) hattı, MTT tahlilleri ile otomatik hücre sayımı arasındaki hücresel canlılık sonuçlarını karşılaştırmak için bir test hattı görevi göreceksiniz. 57 test bileşiğinin toksisitesini değerlendiren bir ekranda test edin. Bu stratejinin birincil amacı toksik bileşikleri belirlemek ve karakterize etmek olmasına rağmen, potansiyel olarak büyüme inhibitörü ve büyüme arttırıcı bileşikleri belirleme nin ek yararına sahiptir ve böylece ilaçların tanımlanması için etkili bir yöntem sağlar hücresel büyümeyi modüle edebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. NSC kültürü

NOT: Bir insan NSC satırının manipülasyonu aşağıda açıklanacaktır, ancak bu protokol için herhangi bir hücre satırı kullanılabilir. Tüm hücre kültürü çalışmaları biyolojik bir güvenlik kabininde gerçekleştirilir.

  1. Kat 96-iyi plaka ile bodrum membran / ekstrasellüler matris (ECM).
    1. NSC'nin buz üzerinde bağlanmasını kolaylaştıracak Olan ECM(Malzeme Tablosu)ve eritme aliquot'u. Uygun konsantrasyona seyreltin ECM (genellikle 1:100) 10 mL taban orta(Malzeme Tablosu)ve 96-iyi plaka 60 iç kuyuların her biri için kuyu başına 50 μL ekleyin(Şekil 1). Kenar etkisi16neden olabilir eserleri önlemek için sadece iç 60 kuyukullanın.
    2. Plaka oda sıcaklığında veya hücre kültürü kuluçka makinesinde (37 °C, %5 CO2)en az 30 dakika oturun.
  2. Ayrıştırık ve plaka nöral kök hücreleri.
    NOT: Bu yöntemde kullanılacak hücreler bir T75 şişesinde en az %80 biraraya kadar yetiştirilmelidir.
    1. Baz orta, B27, esansiyel olmayan amino asitler, 2 mM glutamin ve 10 ng/mL temel fibroblast büyüme faktöründen (FGFb veya FGF2) oluşan NSC ortamında 37 °C ve %5 CO2'de hücre kültürü kuvözdeki T75 şişedeki kültür hücreleri.
    2. %80 birleştiğinde hücreleri kuvözden çıkarın ve NSC ortamını aspire edin. Uygun miktarda hücre dissosilasyon reaktifi ekleyin (T75 şişesi için 3 mL; Malzeme Tablosu) ve kuvözde 5 dakika kuluçka.
    3. Kuluçkadan sonra, tüm hücrelerin kopmasını sağlamak için T75 şişesine 7 mL NSC ortamı ve pipet ekleyin. Ayrıştırılmış hücre çözeltisini 15 mL'lik bir tüpe ve santrifüje 200 x g'de 5 dk aktarın.
    4. Santrifüjden sonra, tüpten süpernatant çıkarın ve NSC orta ve sayım hücrelerinin 10 mL hücreleri resuspend.
    5. NSC orta ile 200.000 hücre/mL'ye hücrelerin rejust konsantrasyonu. Hücreler tamamen kuyulara homojen kaplama için resuspended olduğundan emin olun.
    6. Bölüm 1.1'de açıklandığı gibi kaplanmış üç 96 kuyulu üç iç kuyudaki hücre karışımının (20.000 hücre) 100°L plakası. 8 kanallı çok kanallı pipettorun sekiz yuvasından altısını, sütun lar arası hücreleri kapamak için kullanın.
    7. En dıştaki kuyulardan olası buharlaşmayı en aza indirmek için hücresiz tüm kuyulara 100°L baz orta veya NSC ortamı ekleyin.
    8. Hücre kültürü mikroskobu altında, hücrelerin beklenen yoğunlukta tohumlu olduğunu doğrulamak için üç 96 kuyulu plakanın her birinde en az 10 kuyuyu görsel olarak inceleyin. Hücreler çok seyrek veya yoğun bir yoğunlukta kaplanmış olup olmadığını titret ile devam etmeyin.

2. Bileşiklerile hücreleri tedavi

NOT: Bu gösteride test edilen ev yapımı kütüphane, kanatsız/entegre (Wnt), retinoik asit, dönüşüm faktörü-beta (TGF-β) ve sonik kirpi sinyal yollarının yanı sıra çeşitli tirozin kinazlarını modüle eden bileşikler içerir.

  1. Toksisite/hücre numarası için keşif birincil ekranı
    1. Aliquot 50−100 mL kadar 57 test bileşikleri(Ek Tablo 1) 10 mM konsantrasyonda % 100 dimetil sülfoksit (DMSO) iç 60 kuyuiçine U dipli, V dipli veya yuvarlak dipli 96-iyi plaka üç DMSO kuyusu ile (bkz. Plaka haritası için Şekil 1). Bu dondurulmuş ve birkaç kez çözülmüş olabilir bileşik 25 μL ile ana bileşik plaka olarak hizmet edecektir.
      NOT: Düz dipli plakalar, bir tezgah üstü pipettor ile küçük hacimli bileşiklerin aspire edilmesi daha zor olacağından kullanılmamalıdır.
    2. Bölüm 1'de açıklandığı gibi bölündükten sonra hücre kültürü plakalarını 16-24 h'den çıkarın ve sekiz çok kuyulu yuvadan sadece altısını kullanarak 8 kanallı çok kuyulu pipettor ile NSC orta sütun-by-kolon aspire edin. Üç çoğaltma plakasının her birinde hücrelere 95 μL taze NSC ortamı ekleyin ve aşağıdaki adım 2.1.4 tamamlanana kadar plakaları kuvöze geri yerleştirin.
    3. Boş u dipli, V dipli veya yuvarlak dipli 96 kuyulu ve 8 kanallı çok kuyulu pipettorlu iç 60 kuyunun her birine 49 μL NSC orta ekleyin. Ana bileşik plakayı çıkarın ve ana plakadan iç 60 kuyunun her birinde 49 μL NSC ortamına kadar pipet 1 μL biliğe bir tezgah üstü pipet veya eşdeğer alet kullanın.
    4. Tezgah üstü pipettor ile seyreltilmiş bileşik 3x karıştırın.
    5. NSC'nin üç adet 96 kuyuluk plakasını kuvözden çıkarın, pipet 15°L'lik her seyreltilmiş bileşiğin 15'ini tezgah üstü pipettorile çıkarın ve üç plakanın her birine 5 μL'lik bir bileşik aliquot dağıtın.
      NOT: 2.1.3 adımdaki ilk 1:50 seyreltme ile birlikte hücrelere bileşik 1:20 seyreltilmesi, NSC'lerde bileşiklerin son konsantrasyonunun %0,1 DMSO konsantrasyonu ve son konsantrasyonu ile 10 μM olacak şekilde 1:1000 seyreltme sağlar. DMSO kontrolleri için konsantrasyon %0.1 olacaktır.
    6. 72 saat bileşik hücreleri inkübte ve sitotoksisite tahlilleri ile devam edin. Daha kısa aralıklarla kullanılabilir ancak 72 saatlik kuluçka süresi test edilen bileşiklerin potansiyel sitotoksik etkilerini en üst düzeye çıkarmalıdır.
  2. Doz yanıtı tonu
    NOT: Doz yanıtı için kullanılan 96-iyi için kurulum Şekil 2'degösterilmiştir.
    1. Altı DMSO kontrol çoğaltmaları ve 10 μM yüksek doz ile başlayan altı dozda iki kat seri seyreltme ler üç farklı bileşiklerin triplicates test için sütun 2 kullanın.
    2. DMSO'daki 4 μL'lik DMSO veya test bileşiği1,5 mL mikrosentrifuge tüpte 196 μL NSC ortamına seyreltin. B2-G2'den kuyusütununa 25 μL DMSO ve B3-B11'den gelen üç test bileşiği yle B3-B11'den gelen test bileşiklerinin 50 μL'sini b3-B5, B6-B8 ve B9-B11 sıralarında üç test bileşikleri ekleyin.
    3. Pipet 25 μL NSC orta 96-iyi plaka iç kısmında kalan boş sütunlar için. Çok kanallı pipettor ile B3-B11 kuyularından 25 μL'lik bileşiğin çıkarılmasını, C3-C11 kuyularına ekleyin ve en az beş kez karıştırın. Bileşiklerin her biri için altı doz toplam için iki kat seyreltme ler triplicates oluşturmak için kalan satırlar için işlemi tekrarlayın.
    4. Bölüm 2.1'deki birincil ekranda açıklandığı gibi doz yanıtı için NSC'ler oluşturun. Doz yanıtı için bileşikler eklenir ve tam olarak adımlar 2.1.5 ve 2.1.6 açıklandığı gibi hücrelerüzerinde inkübe.
      NOT: Doz yanıtı tayininin üç biyolojik kopyalanması, ayrı günlerde farklı pasajlarda NSC'ler üzerindeki tayini tekrarlayarak gerçekleştirilir.

3. Plaka okuyucudaki görüntüleme hücreleri

  1. Hücreler ayrılan süre için bileşiklerle kuluçkaya yattıktan sonra, bir plaka okuyucuüzerindeki görüntü hücreleri her kuyubaşına işlem öncesi hücre sayısını belirler.
    NOT: Görüntüleme hücreleri için talimatlar okuyucuya özgüdir ancak genellikle benzer bir strateji izler. Aşağıdaki yol tarifleri bu gösterimde kullanılan okuyucu için geçerlidir (Malzeme Tablosu).
  2. Tabağı kuvözden çıkarın ve plaka okuyucusunun içine yerleştirin. Çalışma için protokol ve deneme dosyaları ayarlamak için görüntüleyici yazılımını açın. Task Manager'da Imager Manuel Modu'na gidin ve şimdi Yakala'yı tıklatın....
  3. Damar tipi olarak 96-iyi plaka seçin, büyütme için 10x seçin, ve kırmızı floresan protein (RFP) 531 ve 593 görüntüleme tdTomato için. Bir kuyu seçin, ardından görüntüyü odaklamak için Otomatik Netleme'yi tıklatın ve uygun pozlama süresi için Otomatik Pozlama'yı tıklatın. Gerekirse odaklama ve pozlamayı manuel olarak ayarlayın.
  4. Doğru netleme ve pozlama elde edildikten sonra, resmi yakalamak için kamera simgesine tıklayın. Ardından, protokolü oluşturmaya devam etmek için resmin üstündeki PROCESS/ANALZYE'yi tıklatın ve ANALYSIS sekmesini seçin.
  5. Görüntünün sağındaki ANALIZ ADIMI EKLE'de Hücresel Analiz'i tıklatın ve START'ı tıklatın. Görüntü, her bir hücreyi göstermek için vurgulanan hücreleri gösterir. Floresan eşiğine veya hücre boyutuna göre hücreleri daha iyi seçmek için parametreleri değiştirmek için Seçenekler seçimi tıklanabilir. Görüntüleyici hücreleri düzgün bir şekilde sayıyorsa, ekranın altındaki ADD STEP'i tıklatın.
  6. Denemeyle birlikte bir pencere açacak olan görüntü kümesinden deneme oluşturmakiçin ekranın üst kısmındaki simgeyi tıklatın. Açtıktan sonra Protokol sekmesialtında Yordam'ı tıklatın ve Oku'yuaçan yeni pencerede , ardından yeni pencerede hücreleri içeren yalnızca 60 kuyuyu seçmek için tam plakayı tıklatın (B2... G11). Değişiklikleri kaydetmek için Tamam'ı tıklatın ve ardından Yordam penceresinde Tamam'ı tıklatın.
  7. Plaka artık bu protokol tarafından görüntülenebilir ve deneysel dosya kaydedilebilir. Plakayı çalıştırmak için oynat simgesini tıklatın. İlk plaka görüntülendikten sonra, diğer iki plakayı görüntüleyin. Görüntüleme tamamlandıktan sonra, hücre sayısı verilerini analiz için bir elektronik tabloya indirin. 10x büyütme tüm görüntüleri alın.

4. Terminal MTT sitotoksisite tsalimi

NOT: TDTomato görüntülemeişlemini tamamladıktan sonra iki saat içinde MTT tgelincetesini başlatın.

  1. 25 mg MTT tartarak ve 5 mL NSC ortamda yeniden suyararak 5 mg/mL MTT stok çözeltisi yapın. Girdap çözeltisi birkaç dakika sürebilir MTT, görünür çökeltiler kadar.
  2. Hücre kültür plakalarını kuvözden çıkarın ve hücre kültürü ortamını aspire edin. Hücre kültürü ortamında MTT 1:10 seyreltin ve hücrelerin her kuyuya 100 μL MTT ekleyin.
  3. 37 °C'de 2 saat boyunca kuluçka yada hücreler. Morumsu bir çökelti kuyudaki hücre sayısı ile orantılı olarak kabaca görülmelidir. MTT çözeltisini plakalardan aspire edin veya çözeltiyi plakadan çıkarmak için plakayı hızlıca ters çevirin.
  4. Her kuyuya %100 DMSO'nun 50 000'ini ekleyin ve 400 rpm'de 10 dakika oda sıcaklığında plakaları sallayın. Her kuyunun emiciliğini bir plaka okuyucusunda 595 nm'de okuyun ve verileri analiz için bir elektronik tabloya aktarın.

5. Veri analizi

  1. Uygun yazılım (ticari elektronik tablo, R) ile tdTomato hücre sayıları ve absorbansları bir analiz gerçekleştirin. Normalleştirme amacıyla her bir plaka üzerinde üç DMSO çoğaltmak emicilik veya hücre sayısı için ortalamaları hesaplamak, sonra bu ortalama ile plaka üzerinde her kuyu için hücre sayıları veya emiciler için değeri bölmek ve bir yüzde dönüştürmek. Bu, her plaka için DMSO kontrolüne göre normalleştirilmiş hücre sayımı veya emicilik verir.
  2. Üç plaka üzerindeki çoğaltma kuyuları için ortalama normalleştirilmiş sayımı veya emiciliği ve standart sapmayı hesaplayın.
    NOT: Bu noktada normalleştirilmiş dört farklı değer kümesi olmalıdır: her plaka için bir tane ve üç çoğaltma plakası için bir ortalama.
  3. Konservatif olun ve bir bileşiği toksik olarak sınıflandırmak için üç çoğaltma plakası arasında ortalama %25 veya altında normalleştirilmiş bir değer kullanın. Ayrıca, bileşik başına sadece tek bir tedavi her plaka üzerinde yapılır çünkü, toksik olarak her üç çoğaltma plakaları bu eşiğin altına düşen sadece etiket bileşikleri. Bu analizin toksisiteyi görsel olarak doğrulamak için toksik olarak filtrelediği tüm bileşiklerin floresan görüntülerini inceleyin.
    NOT: Büyüme önleyici veya büyüme arttırıcı etkiye sahip bileşiklerin tanımlanması, her plakada çoğalma olmaması nedeniyle bu tür bir keşif tetkikinde değerlendirilmek daha zordur. Ancak, aşağıdaki ya yavaşlatabilir veya hücresel büyümeyi artırmak bileşikleri belirlemek için hızlı bir yoldur.
  4. Her plakadaki üç çoğaltma DMSO denetimi için standart sapmayı hesaplayın ve ardından DMSO denetiminin üzerinde veya altında ortalama değerlere sahip bileşikler için filtre uygulayın. Üç plakanın her birinde bu filtreden çıkan bileşikler daha fazla araştırma yapılmasını gerektirebilir.
  5. Birincil toksisite ekranı olarak doz yanıtı için aynı analiz stratejisini kullanın. Her biyolojik çoğaltma için DMSO kontrollerinin ortalamalarını hesaplayın ve her bileşik/doz kombinasyonu için yüzde canlı hücreleri veya yüzde emicilikleri normalleştirmek için bu değerleri kullanın. Üç biyolojik çoğaltma için tüm bileşik/doz kombinasyonları için ortalamaların ve standart hatahesaplamak.
  6. Konsantrasyonu günlük değerine dönüştürün, konsantrasyon kütüğü için normalleştirilmiş canlılık için bir doz yanıt eğrisi oluşturun ve doğrusal olmayan bir regresyon analizi ile eğriyi sığdırın (analiz R veya çeşitli ticari istatistiksel paketleri). Ölümcül doz hesaplamak 50 (veya teknik olarak bu durumda uygun doz 50) veya bu eğrinin denkleminden% 50 toksisite ile sonuçlanan bileşik konsantrasyonu. Birçok yazılım paketi bu rakamı otomatik olarak hesaplar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Otomatik hücre sayısı verileri DMSO kontrolüne normalleştirildiğinde %'ten daha az canlılığa sahip on bir bileşik tespit ederken, MTT verileri bu bileşikleri artı iki ek bileşikleri tanımlamıştır(Tablo 1 ve Tablo 2, gölgeli kırmızı). Sadece MTT testinde toksik olduğu tespit edilen iki bileşik (F3 ve G10 kuyuları) sırasıyla 1 ve 9'a sahipti, kontrol olarak tdTomato pozitif hücrelerin sayısı ve sıra sırasına göre bu kütüphanede toksik olduğu düşünülenlerden sonraki en toksik iki bileşik va...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu makalenin temel amacı, düşük ila orta verimli taramada hücre büyümesini etkileyen bileşikleri verimli ve ucuz bir şekilde tanımlayabilecek bir stratejiyi tanımlamaktı. Sonuçlara olan güveni artırmak ve sadece tek bir töz kullanılmışsa mevcut olmayacak ek bilgiler sunmak için hücre sayısını değerlendirmek için iki ortogonal teknik kullanılmıştır. Tahlillerden biri doğrudan tdTomato-pozitif hücreleri saymak için bir floresan hücre görüntüleyici kullanılan ve ikinci böylece hücre numarası10için bi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma NINDS Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
B-27 (50X)ThermoFisher Scientific17504001Nöral kök hücre besiyeri bileşeni.  
Tezgah üstü pipetleyiciSorenson Bioscience73990Bileşik kitaplığını tek seferde 96 oyuklu bir plakaya pipetleme yeteneği sağlar.
BioLite 96 kuyulu çok çanaklıThermo Scientific130188Herhangi bir 96 kuyulu hücre kültürü plakası çalışacaktır. Bunları çalışmalarımızda kullanıyoruz.
Hücre kültürü mikroskobuNikonEclipse TS100Uygun yoğunluğu sağlamak için hücrelerin görsel olarak incelenmesi.
Sitasyon 5 / Görüntüleme okuyucuBioTekCYT3MFVHücre görüntüleme ve absorbans okumaları için kullanılır.
DMSOFisher Scientific610420010Ekranda kullanılan bileşikler için çözücü. Absorbans ölçümlerini kolaylaştırmak için MTT çökeltilerini çözer.
FGF-basicPeprotech100-18BNöral kök hücre besiyeri bileşeni.  
GelTrexThermoFisher ScientificA1413202Nöral kök hücre bazal membran matrisi. Hücrelerin hücre kültürü plakalarına yapışmasını sağlar.
Gen5 3.04tdTomato eksprese eden hücreler için hücre sayımlarını belirlemek içinBioTek
GlutaminThermoFisher Scientific25030081Nöral kök hücre ortamı bileşeni.  
Microtest U-BottomBecton Dickinson3077Bileşik kitaplıkların depolanması.
MTTThermoFisher ScientificM6494Hücresel canlılığı belirlemek için aktif tahlil reaktifi.
Çok kanallı pippetteRaininE8-1200Hücre kültürü ortamı, MTT veya DMSO'nun sütun sütun eklenmesi.
Nörobazal ortam:ThermoFisher Scientific21103049 Nöral kök hücre baz ortamı.
RFP filtre küpüBioTek1225103Filtre, tdTomato eksprese eden hücreleri görüntülemek için kullanılan Cytation 5'te kullanılır.
TrypLEThermoFisher Scientific12605036Hücre ayrışma reaktifi.
Analiz yazılımı.

Kaynaklar

  1. National Research Council. Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy. , National Academies Press. Washington DC. (2007).
  2. Llorens, J., Li, A. A., Ceccatelli, S., Sunol, C. Strategies and tools for preventing neurotoxicity: to Test, to predict, and how to do it. Neurotoxicology. 33 (4), 796-804 (2012).
  3. Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).
  4. Ciofani, G., Danti, S., D'Alessandro, D., Moscato, S., Menciassi, A. Assessing cytotoxicity of boron nitride nanotubes: interference with the MTT assay. Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (2), 405-411 (2010).
  5. Tennant, J. R. Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability. Transplantation. 2 (6), 685-694 (1964).
  6. Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
  7. Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. A new rapid and simple nonradioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay. Journal of Immunological Methods. 170 (2), 211-224 (1994).
  8. Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: Standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
  9. Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
  10. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  11. Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
  12. Malik, N., et al. Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons. Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).
  13. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  14. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100(2006).
  15. Cerbini, T., et al. Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated CLYBL targeting enables enhanced transgene expression and one-step generation of dual reporter human induced pluriopotent stem cell (iPSC) and neural stem cell (NSC) lines. PLoS One. 10 (1), 0116032(2015).
  16. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  17. Qie, S., et al. Glutamine depletion and glucose depletion trigger growth inhibition via distinctive gene expression reprogramming. Cell Cycle. 11 (19), 3679-3690 (2012).
  18. Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells. Scientific Reports. 8 (1), 3029(2018).
  19. Carmichael, J., DeGraff, W. G., Gazdar, A. F., Minna, J. D., Mitchell, J. B. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Research. 47 (4), 936-942 (1987).
  20. Romijn, J. C., Verkoelen, C. F., Schroeder, F. H. Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects. Prostate. 12 (1), 99-110 (1988).
  21. Jo, H. Y., et al. The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells. Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).
  22. Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay. Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

H cre B y me AnaliziSitotoksisite TaramasMTT AnalizitdTomato G r nt lemeN ral K k H crelerBile ik TaramasDoz Yan tH cre Say mDMSO UygulamasPlaka Okuyucu

İlgili makaleler