Keratinosit yayılması üzerine iki ve üç boyutlu değerlendirilmesi tip ı kollajen yüzeylerde

Özet

Burada, iki farklı türde kültür yüzeylerde hazırlanması için bir iletişim kuralı mevcut kullanan tip ı kollajen. Bağlı olarak kollajen nasıl işlendiğini, kolajen molekülleri iki boyutlu, fibröz olmayan bir form korumak ya da üç boyutlu, Fibriller formuna yeniden birleştirmek. Hücre çoğalması olarak tip ı kollajen fibril oluşumu ile büyük ölçüde etkilenir.

Özet

Tip ı kollajen, bir substrat hücre kültürü, mevcut olduğundan iki biçimde yararlı: iki boyutlu, lifli form ve üç boyutlu, Fibriller formu. Her iki formu ile aynı hazırlanabilir tip ı kollajen. Genel olarak, lifli form hücre adezyon ve nükleer silahların yayılmasına karşı teşvik etmektedir. Fibriller formu (jeller) hücreleri birçok türde daha fazla fizyolojik şartlarda sağlar; Bu nedenle, jel kültür hücreleri, uyuşturucu etkinliği gibi fizyolojik davranışlarını incelemek için kullanışlıdır.

Araştırmacılar, kullanım amacına göre formu uygun seçebilirsiniz. Örneğin, keratinositler söz konusu olduğunda, jel üzerinde kültür modeli şifa bir yara kullanılmıştır. FEPE1L-8, keratinosit hücre kültürünü kültürlü fibröz form türü üzerinde ben kollajen, hücre adezyon teşvik. Özellikle, keratinosit yayılması daha lifli formu Fibriller formunda yavaştır. Protokolleri hazırlanması için tip ı kollajen hücre kültürü için basit ve deneysel gereksinimlerine bağlı olarak geniş uygulamalar vardır.

Giriş

İnterstisyel bağ dokuları oluşturan üç boyutlu bir protein meshwork heterojen kompozisyon, öncelikle oluşan türü ben kollajen liflerinde¹. Kollajen liflerinde Kök hücreleri^1,2,3 için bir iskele olarak önemli bir rol oynar ve diğer hücre dışı Matriks (ECM) proteinler³ile etkileşim. İn vitro, farklı formları tip ı kollajen yüzeyler işleme bağlı olarak hücre kültürü için kullanılabilir yöntem^1,2,3,4. Asitli koşullarda, tip ı kollajen fibröz form⁵korur. Kültür yemekleri fibröz formu ile yüzey kaplama hücre adezyon ve nükleer silahların yayılmasına karşı^6,7teşvik etmektedir. Fizyolojik pH ve sıcaklık, tip ı kollajen moleküllerin üç boyutlu yapısı^1,2,3,4, sahip jelleri oluşturan liflerinde yeniden monte ^5,6,7,8. Orada birkaç önemli farklılıklar Fibriller ve fibröz form türü ben kollajen, matris sertlik ve ECM bileşenleri hücreleri tarafından yeniden inşası sırasında kültür¹verimliliği de dahil olmak üzere. Matris sertlik hücre kültürü^{1, 9}en çok çalışılan düzenleyici faktörlerden biridir. Ancak, yüzeyler ve hücreler arasındaki karmaşık etkileşimler netleştirilmelidir kalır. Hücreleri ve çevresel faktörler arasındaki karmaşık etkileşimler incelemek için basit bir sistem yararlıdır. Karşılaştırma kollajen iki farklı formlarda hücresel davranışının çevresel faktörler etkisi kolaylaştırmak için yardımcı olabilir. Bunların kullanımı, farklı formları türü bilerek bağlı kollajen seçmeli olarak kullanılabilir. Normalde, keratinositler membran ile temas vardır ama ile değil tip ı kollajen. Ancak, yara iyileşmesi, keratinositler dermal bağ dokusu ile hareket sırasında çoğalırlar ve¹⁰yara iyileşmesi.

Son zamanlarda, biz gösterdi ekstraselüler kalsiyum konsantrasyonu keratinosit yayılması için önemli kültür sistemi üzerinde Fibriller şeklinde kullanarak satır hücreleri tip ı kollajen dermal bag doku¹¹taklit. FEPE1L-8 Fibriller formda kültürlü keratinosit hücre kültürünü yazdığınızda ben kolajen hücrelerinin şekli yuvarlak, onların proliferations bir hücre dışı kalsiyum konsantrasyonu 30 mikron¹¹durdurmuş. Kalsiyum konsantrasyonu 1.8 mM ye çıkartılmış, hücre büyümesini kurtarılan¹¹oldu. Hücreleri her iki kalsiyum konsantrasyonu (30 mikron ve 1.8 mM) altında büyüdü ne zaman Fibriller formunda kültürlü zaman eksojen kalsiyum konsantrasyonu daha duyarlı olduklarını ise fibröz form¹¹, kültürlü. FEPE1L-8 transfection Papilloma virüsü türü 16 dönüşüm genlerin E6 ile aracılığıyla oluşturulan ve E7 insan servikal Karsinomu, Sigara tumorigenic, üzerinden sınırsız nükleer silahların yayılmasına karşı sınırlı farklılaşma normal lenfositi ^{gibi potansiyel ile inhibe 12,13}. FEPE1L-8 hücreleri keratinosit özel ortam, K110 tip-II ile katkı takviyesi K-1 (K110)⁶dahil olmak üzere bazı tür kullanılarak korunabilir. Burada, biz insan keratinosit hücre kültürünü kültür protokolünden sigara-lifli üzerinde tarif ve fibril formları tip ı kollajen.

Protokol

1. keratinosit kültür orta hazırlanması

Not: aseptik koşullar altında tüm yordamları gerçekleştirin.

1. 5 mL penisilin-streptomisin ve 10 mL K110 tip-II orta (K110) 500 ml katkı takviyesi K-1 bir pipet kullanarak ekleyin.

2. Fibriller şeklinde hazırlanması tip ı kollajen

Not: adım 2.6 aseptik koşullar altında kadar yordamları gerçekleştirin.

1. 10 x fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS (-)), deiyonize su, kollajen, bir 96-şey kültür plaka ve boş bir 2 mL tüp buz üzerinde tutun.
   Not: aynı plaka Fibriller ve fibröz olmayan formlar hazırlamak için kullanmayın.
2. 1.12 mL deiyonize su bir pipet kullanarak bir boş 2 mL tüp ekleyin. 10 x PBS (-) 200 µL bir pipet kullanarak 2 mL tüp deiyonize su ekleyin. Yavaşça tüp birkaç kez sallamak.
3. Kollajen 0,66 mL bir pipet kullanarak 2 mL tüp ekleyin. Yavaşça ve hızlı bir şekilde tüp birkaç kez sallamak.
   Not: kabarcık oluşumu çözüm mümkün olduğunca kaçının. Kollajen çözüm kullanmak için hemen önceden hazırlayın.
4. Adım 2.3 96-şey kültür plaka her kuyuya kollajen çözeltinin 100 µL dökün. Hafifçe sola doğru hareket içinde kültür plaka salla.
   Not: wells kollajen çözüm ile tüm yüzeyi kapsamaktadır. Çözüm tüm yüzey kapsamaz, pipet ucu kullanarak çözüm yaymak. Kabarcık oluşumu çözüm mümkün olduğunca kaçının.
5. Kültür plaka CO₂ kuluçka makinesine koyun ve 1 h. onay jelleşme kollajen için 37 ° C'de kuluçkaya ve kültür plaka temiz bir tezgah için hareket.
   Not: kültür plaka eğerek jelleşme onaylayın.
6. K110 150 µL kuyu, kültür CO₂ kuluçka makinesine plaka ve 1 h. temiz bir Bank kültür plaka taşımak için 37 ° C'de kuluçkaya yer duvar boyunca bir pipet kullanarak jeller üzerinde yavaşça dökün. Önce hücre kültürü, yavaşça K110 atmak bir pipet kullanarak.
   Not: jelleri korumak için pipet ucu kuyu duvarı dokunmatik gerekir.

3. sigara fibröz şeklinde hazırlanması tip ı kollajen

Not: aseptik koşullar altında tüm yordamları gerçekleştirin.

1. 1.2 mL 1 mM hidroklorik asit (HCl) 1,5 mL tüp 4 µL kollajen ekleyin ve karışımı yavaşça bir pipet kullanarak.
   Not: kollajen hemen kullanmak için önceden hazırlayın. Kollajen ve kullanım zamana kadar soğutulmuş HCl tutun.
2. 100 µL kollajen bir pipet kullanarak bir 96-şey kültür plaka her kuyunun içine dökün. Yavaşça hareket sağ ve 1 h için oda sıcaklığında kuluçkaya bir sol kültür plaka sallamak.
   Not: emin olun kuyuları tüm yüzeyine çözüm ile kaplıdır.
3. Kuluçka sonra kollajen çözüm atın ve wells iki kez bir pipet kullanarak PBS (-) ile yıkayın.
4. %1 sığır serum albümin/PBS (-) (%1 BSA) bir de 96-şey kültür plaka, 150 µL dökün ve hücre kültürü önce 1 h. için oda sıcaklığında kuluçkaya, % 1 BSA atın.
   Not: emin olun kuyuları tüm yüzeyine çözüm ile kaplıdır.

4. FEPE1L-8 hücre kültürü

Not: aseptik koşullar altında tüm yordamları gerçekleştirin.

1. K110 FEPE1L-8 hücrelerde 100 mm çanak CO₂ kuluçka kültür ve 37 ° C ve % 5 CO₂, yarı confluency için inkübe korumak.
2. K110, tripsin ve tripsin inhibitörü olarak 37 ° C'de bir su banyosu hazırlamak
3. Dikkatli bir şekilde orta kültür çanak kaldırmak, 3 mL % 0.05 tripsin bir pipet kullanarak ekleyin, CO₂ kuluçka makinesine çanak yerleştirin ve 5 min için 37 ° C'de kuluçkaya. Kuluçka sonra faz kontrast mikroskobu 10 x büyütme oranında kullanarak kültür çanak yüzeyinden hücre dekolmanı denetleyin.
   Not: Müstakil hücre morfolojisi yuvarlak haline gelir. Hücreleri yaymak, 5 min ek bir süre için kuluçkaya.
4. Tripsin inhibitörü 3 mL ekleyin ve bir pipet kullanarak 15 mL santrifüj tüpü müstakil hücrelerde toplamak. 15 mL santrifüj tüpü 200 x g 5 min için de hücrelerde santrifüj kapasitesi.
5. Süpernatant atın ve Pelet 10 bir pipet kullanarak mL K110 yeniden askıya alma. Faz kontrast mikroskobu 10 x büyütme oranında kullanarak hücreleri saymak ve 5.0 x 10⁴ hücre/mL hücre konsantrasyonu ile K110 uygun seyreltme hazırlayın.
6. Yavaşça K110 0.1 mL hücrelerde her şey kuyunun duvar boyunca bir pipet kullanarak kültür plaka ile tohum. Kültür plaka CO₂ kuluçka makinesine koyun ve 37 ° C'de belirtilen süre (2 h, 1 gün, 3 gün) için kuluçkaya.
   Not: jelleri korumak için pipet ucu kuyu duvarı dokunmatik gerekir.

5. hücrelerin sayısı tahmini

1. 37 ° C'de bir su banyosunda K110 kuluçkaya Mix 130 µL tetrazolium tuz, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H tetrazolium, monosodyum tuz (WST-8) ve K110 1.3 mL bir pipet kullanarak 2mL tüp içinde.
2. Temiz bir Bank kültür plaka taşımak ve yavaşça K110 atın bir pipet kullanarak. Yavaşça K110 hücrelerle yapışık olmayan bir pipet kullanarak silsin
3. Kültür plaka CO₂ kuluçka makinesine koyun ve 37 ° c 2 h için kuluçkaya her şey bir pipet kullanırken K110 110 µL WST-8 ile karışık ekleyin.
4. Kültür plaka taşımak için temiz bir Bank, klimalı orta 100 µL her kuyudan toplamak ve başka bir 96-şey kültür plaka bir kuyunun içine taşıyın. Ölçmek bir dalga boyunda 450 Absorbans Mikroplaka okuyucu ve tahmini hücrelerin sayısını kullanarak nm (OD₄₅₀).

Sonuçlar

Tedavi kullanarak kültür yemekleri yüzeylerinin şematik gösterimi tip ı kollajen şekil 1' de tasvir. Hücre türleri Morfoloji fibröz sigara ve fibril formları üzerinde gözlenen sırasıyla Şekil 2, sol ve sağ taraftaki kapı aynası mevcuttur. FEPE1L-8 hücreleri için 2 h (üst panelleri) ve 3 gün (alt panelleri) kültürlü. İlk kültür, 2s, hücreleri yapıştırılır ve kollajen (Şekil 2, üst panelleri) her iki formu üzerinde yayılmış. Tohum sonra üç gün fibröz sigara formdaki hücreleri yaymak ve artan numaraları (Şekil 2, alt sol panelde) hücre devam etti. Buna ek olarak, Fibriller formdaki hücreleri sınırlı (Şekil 2, alt doğru kapı aynası) yayılan gösterdi. FEPE1L-8 hücreleri çoğalırlar fibröz form türü üzerinde ben (şekil 3, düz siyah çizgi, siyah daireler kapalı) kolajen devam etti ve tedavi edilmezse çanak üzerinde (gri çizgi, kapalı gri daireler noktalıResim 3) yüzeyler. Buna ek olarak, hücre (şekil 3, noktalı çizgi, açık dairelerden) Fibriller formunda çoğalırlar değil. Şekil 2 ve şekil 3 Fujisaki ve ark¹¹' den değiştirildi.

Resim 1 : Kültür çanak yüzeyler şematik gösterimleri tedavi türü ile ben kollajen. Asidik şartlar altında tip ı kollajen molekülleri adsorbe fibröz formu (sol panelde) bir çanak yüzeyi. 37 ° C'de tarafsız koşullarda, tip ı molekülleri liflerinde yeniden birleştirilen ve adsorbe kollajen yüzeyinde oluşan yemekler jel formunda (doğru kapı aynası). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 : FEPE1L-8 hücre morfolojisi. K110 FEPE1L-8 hücrelerde kültürlü fibröz sigara formunu kullanarak (10 µg/mL; sol kapı aynası) veya Fibriller şeklinde (1 mg/mL; doğru kapı aynası) tip ı kollajen için 2 h (üst panelleri) ya da 3 gün (alt panelleri). Beyaz Çubuklarõn 100 µm. Şekil 2 modifiye edilmiştir Fujisaki ve ark. üzerinden Resim 1E-H¹¹'. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3 : FEPE1L-8 hücre çoğalması. Hücrelerin sayısını fibröz formunda (siyah düz çizgi, siyah doldurulmuş daireler) tahmin edilmiştir veya üzerinde Fibriller (noktalı çizgi, açık Daire) şeklinde tip ı kollajen veya tedavi edilmemiş çanak yüzeyler (gri noktalı çizgi, gri dolgulu daireler) için 2 h, 1 gün ve 3 gün. Deneyler triplicates içinde gerçekleştirilen ve değerler gösterilir anlamına gelir + SD olarak Bu şekil şekil 1J¹¹' Fujisaki ve ark. üzerinden değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışma

ECM bileşenleri de dahil olmak üzere bazı tip ı kollajen, içinde vivo¹formu üç boyutlu yapılar. Böyle bir üç boyutlu kültür, jel substrat vitro daha fazla fizyolojik şartlarda iki boyutlu, plastik bir yüzeye sağlar^1,2,3,4. Jel kültür yöntemi ile ilgili çok sayıda iletişim kuralları bildirilmiştir, kullanarak gibi tip ı kollajen^{1,2,3,4,6,7, 11}, tip IV kollajen^14,15ve Matrigel¹⁶. Tip ı kollajen olduğunu iyi tanımlanmış ve yaygın olarak kullanılan malzeme onun bereket ve işleme kolaylığı nedeniyle. Saflaştırılmış türü özelliklerini ben kollajen hayvan türleri, yaş ve arıtma yöntemleri^5,17üzerinde bağlıdır. Tip ı kollajen saf Asetik asit ve/veya proteaz, pepsin, papain ve proctase^5,17gibi kullanarak. Asit çözünür kollajen amino-Telopeptid ve proteaz çözünür kollajen i ciddi amino-Telopeptid^5,17yaşındasın tutar. Amino-Telopeptid ayrılmış uzunluğu proteaz türüne bağlıdır ve fibril Morfoloji etkiler ve gücü^5,17jel Telopeptid varlığı. Asit çözünür kollajen liflerinde viskozite proteaz tedavi collagens¹⁷yüksektir. Bu çalışmada, biz asit çözünür kullanılan sığır tip ı kollajen. Pepsin çözündürüldükten kollajen bu jel kültür protokol için de kullanılabilir; Ancak, jel gücü zayıf¹⁷yaşında. Malzemeler bu farklılıkları hücre davranış farklılıklar neden olabilir, ama onlar şu anda değil de anlaşılır.

Bu çalışmada açıklanan jel kültür Protokolü çok basittir. Bu yöntemin birçok değişiklikler bildirilmiştir. Membran taklit etmek için lenfositi kültür için olası bir değişiklik olduğunu. Tip IV kollajen jelleri vitro^15,18' bir membran benzeri yüzey yapısını korumak için daha iyi olabilir. Ancak, uzun bir kuluçka dönemi türü IV kollajen jelleri^14,15,18hazırlanması için gereklidir. Bunun yerine, tip IV kollajen ile karıştırma tip ı kollajen jelleri roman kültür yüzeylerde üretebilir (tip ı / IV kollajen hibrid jelleri türü)¹⁹. Bu melez jellerin kolay işlemek, kısa bir süre için jelleşme gerektirir ve daha fazla membran benzeri koşul lenfositi için verim. Açık tip ı / tip IV kollajen hibrid jelleri, keratinositler hayatta, koloniler oluştururlar ve terminal farklılaşma¹⁹ikna etmek. Bu karma yöntem çok yönlü uygulamalar vardır.

Jel üzerinde kültür kullanarak tip ı kollajen kanser hücreleri etkiler. Fibriller şeklinde üzerinde tip ı kollajen, Akt harekete geçirmek ve Caco-2 hücreleri (kolon kanseri hücre kültürünü) büyüme bastırılmış⁷. Buna ek olarak, Fibriller formdaki (M24met) insan Melanom hücrelerinin büyümesini G1/S denetim noktası²⁰tutulub. Ayrıca, Reaktif oksijen türleri, daha belirgin yüksek düzeyde Fibriller formunda kültürlü fare 3T3-L1 preadipocytes gözlenir. Ayrıca, hücre çoğalması ve geçiş ters yönde sigara-lifli tarafından uyarılır ve fibril formları tip ı kollajen²¹.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Albümin, sığır serumundan (BSA)	Merck KGaA	A4503
1 % BSA	Merck KGaA	A4503	1 g BSA tozunu 100 mL PBS (-) içinde çözün ve süzün
Hücre Sayma Kiti-8	Dojindo Moleküler Teknolojiler A.Ş.	347-07621	tetrazolyum tuzu, 2- (2-metoksi-4-nitrofenil) -3- (4-nitrofenil) -5- (2,4-disülfofenil) -2H ve nbsp; tetrazolium, monosodyum tuzu (WST-8)
Kollajen tip I (Asitte çözünür collgen)	Nippi Inc.	Sığırdan elde edilen ASC-1-100-20	(mevcut diğer türler, konsantrasyon 3.0 mg / mL'dir
tek kullanımlık membran filtre ünitesi DISMIC selüloz asetat	ADVANTEC Co., LTD.	25CS020AS	0.2 ve mikro; M gözenek boyutu
insan keratinosit hattı hücresi & nbsp; FEPE1L-8			Bağışlanan Dr.W.G. Carter (Fred Hutchinson Kanser Araştırma Merkezi, Seattle, WA)
K-1	Kyokuto Seiyaku A.Ş.	28204	500 mg BSA, 500 mg sığır hipofiz özü, 2.5 mg insülin, 0.05 ve mikro içeren katkı takviyesi; g h-EGF ve 5 mg heparin
K110 Tip-II orta	Kyokuto Seiyaku Inc.	28204	KERATİNOSİT BAZAL KÜLTÜR BESİFİYETİ
K-1 ve Penisilin-Streptomisin (K110) ile K110 Tip-II ortamı,	Kyokuto Seiyaku Inc.	28204	500 mL K110 tip-II keratinosit bazal kültür ortamına 5 mL Penisilin-Streptomisin ve 10 mL katkı maddesi takviyesi (K-1) ekleyin.
PBS (-)	Merck KGaA	P-5368	1 torba PBS (-) tozunu 1000 mL deiyonize suda çözün ve süzün
10x PBS (-)	Merck KGaA	P-5368	1 torba PBS (-) tozunu 100 mL deiyonize su ve süzüntü içinde çözün
Penisilin-Streptomisin	MP Biomedicals, LLC	1670049	10000 birim / mL penisilin G ve 10.000μ fizyolojik tuzlu suda g / mL streptmisin sülfat
Fosfat tamponlu salin BioPerformance CertiCertified, pH 7.4	Merck KGaA	P-5368-10 paketi
Domuz pankreasından Tripsin	Merck KGaA	T4799
%0,05 tripsin ve nbsp;	Merck KGaA	T4799	0.25 g  tripsin ve  0.186 g EDTA.2Na'yı 500 mL PBS (-)  ve süzüntü  içinde çözün;
FUJIFILM Wako Pure Chemical	corporation'dan tripsin inhibitörü	202-20123
Tripsin inhibitörü ve nbsp;	FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation	202-20123	50 mg tripsin inhibitörü ve 500 mg BSA'yı 500 mL PBS (-) ve filtrat içinde çözün;