PDMS kullanarak yüksek verim çekiş kuvveti mikroskobu dönüşüm büyüme faktörü-β epitelyal-mezenkimal geçiş üzerinde doz bağımlı etkileri ortaya çıkarır

Summary

Biz silikon kauçuk (PDMS) ile imal yüksek verim çekiş kuvveti tahlil sunuyoruz. Bu roman tahlil çeşitli biyolojik ve Biyomedikal süreçler ve hastalıklar sırasında hücre kontrazlığı fiziksel değişiklikler okumak için uygundur. Bu yöntemin yardımcı programını, epitelyal-mesenkimal geçiş sırasında bir TGF-β bağımlılık artışına göre ölçerek gösteriyoruz.

Abstract

Hücresel contrility biyoloji çeşitli yönleri, motilsiyon ve bölme, doku kasılma ve mekanik stabilite ve çoklu hücresel hayvan yaşamının temel bir unsuru temsil eden sürüş süreçleri esastır. Yapışma hücrelerinde, hücrelerin substrat üzerinde oluşturan çekiş kuvvetlerinde ACTO-miyosin kasılma görülür. Hücresel kontrazlığın disyönetmeliği, sayısız patolojinin içinde görülür ve biyofizik kullanarak çeşitli tanı yaklaşımlarındaki kontrazlık, ölçüm olarak tanısal bir hedef haline gelmektedir. Dahası, yeni terapötik stratejiler hücre kontrazlığı belirgin arızayı düzeltmek dayalı olabilir. Ancak bu uygulamalar, bu kuvvetlerin doğrudan ölçülmesini gerektirir.

Paraleli Multi-Well formatında silikon elastomer bazlı çekiş kuvveti mikroskobu (TFM) geliştirdik. Silikon kauçuk kullanımı, özellikle polydimetilsiloxane (PDMS), yaygın olarak kullanılan hidrojel Poliakrilamid yerine (PAA) bize hiçbir özel depolama koşulları gerektiren belirsiz raf hayatları ile sağlam ve İnert Substratlar yapmak sağlar. GPa aralığında bir modülere sahip Pillar-PDMS tabanlı yaklaşımlar aksine, PDMS burada kullanılan çok uyumlu, yaklaşık 0,4 kPa 100 kPa kadar. Bu büyük monolitik alt yüzeylerden biyokimyasal bağımsız kuyulara bölünerek, mevcut Multi-Well sistemlerle uyumlu çekiş kuvveti taraması için çok iyi bir platform oluşturarak TFM için yüksek verim platformu oluşturacağız.

Bu yazıda, epitelyal mesenkimal geçişi (EMT) incelemek için bu çok iyi çekiş kuvveti sistemini kullanıyoruz; NMuMG hücrelerinde EMT 'yi TGF-β ' a göstererek ve EMT sırasında Biyofizik değişikliklerin ölçülmesine neden oluyoruz. Biz konsantrasyon ve TGF-β maruz kalma süresi bir fonksiyon olarak kontrazlık ölçmek. Burada Bulgularımız hastalık Biyofizik bağlamında parallelized TFM yarar göstermektedir.

Introduction

ACTO-miyosin kontrazlığı, aktif hücre mekaniğinin temel bir unsurudur, motilite ve proliferasyon hücre davranışlarını etkileyen kök hücre farklılaşma. Dokularda, kontraksiyonda embriyogenin Polar ayrılması, hava yolu daralma ve kardiyak aktivite için aktivite sürücü. Kritik olarak, gerginlik oluşturmak için, hücreler önce kendi hücre içi çevreye uymalıdır. Bu sayede, bu kontraksiyonda çevrede çekiş kuvvetleri oluşturulur. Çekiş kuvveti mikroskopisi (TFM) farklı koşullarda çeşitli hücrelerden bu güçleri ölçmek için bir yol olarak formları çok sayıda ortaya çıkmıştır.

TFM 'nin alanında olağanüstü bir yenilik ve uygulama genişliği görüldü ve sonuçlar, mekaniği ve fiziksel güçleri birleştiren biyolojide yeni perspektiflerin yolunu açtı. Kırışıklıklar silikon substratlar ile başlayan¹, araştırmacılar hücre çekiş kuvvetleri ölçmek için çeşitli teknikler uyguladıysanız. Bu yaklaşımlar sürekli geliştirilmiş ve şimdi birkaç mikron sipariş üzerinde bir çözünürlük düzeyine ulaştı². Ancak, bir asıl sorun ortaya çıkmıştır, kullanılabilir silikonları kullanarak uygun düşük Moduli substratlar oluşturma zorluk olduğunu. Bu sorunu aşmak için, poliakrilamid 1-20 kPa³sırasına göre substratlar oluşturma kolaylığı nedeniyle bir yedek olarak kabul edildi. Son zamanlarda TFM⁴' te çok uyumlu Silikonlar uyguladık, polyacrylamid olarak aynı Moduli yelpazesini üretmemize izin verdik, ancak inert ve sağlam silikon avantajları ile.

TFM yaklaşımlar değerli mechano-biyolojik keşifler etkin, ancak, kalıcı bir eksikliğinin karmaşıklığı, genellikle mühendislik veya Fizik Bilimleri disiplinlerinde araştırmacılar için kullanımını kısıtlayarak. Bu, kontrazlığı ölçmek için gerekli olan ayrıntılı Kalibrasyonlar ve zorlu hesaplamalar için büyük bir kısmı nedeniyle. Başka bir önemli zorluk TFM yöntemleri büyük ölçüde düşük verim ve bu nedenle kötü birçok farklı koşullar veya nüfus aynı anda⁵çalışmak için uygun olmasıdır. Bu, TFM 'nin uzman bir Biyofizik ayarından daha geniş biyolojik ve farmakolojik uygulamalara transferini engelleyen bir darboğaz sundu.

Son zamanlarda, araştırmacılar, farklı bileşiklerin etkisini keşfetme ve aynı zamanda daha az reaktifleri kullanarak kendi TFM ölçümleri daha hızlı kontraktiflik ölçümleri için parallelize sağlar çok iyi Format TFM plaka, geliştirdik⁴ . Bu metodoloji, bileşiklerin hücresel aktivite üzerindeki etkilerini değerlendirerek, farklılaşma veya hastalıkta kontril değişikliklerin ölçülmesi için çeşitli mechanobolojik çalışmalarda geniş bir yardımcı programdır.

TFM 'den büyük avantaj sağlayacak Biyomedikal araştırmanın bir alanı, fiziksel ipuçların kanser hücrelerinin malign fenotiplerini nasıl etkilediğini incelemektir. Kansere bağlı ölümlerin% 90 ' inden sorumlu metasjen, orijinal tümör yerlerini bırakarak ve ikincil bir site kolonize edilen kanserli hücreler ile karakterize edilir. Hücreler doku üzerinden göç ve vasküler sistem içinde ve dışına geçmek için, onlar radikalli matris ya da diğer arasında hareket onların yolunu çekmek için önemli güçler oluştururken bu fiziksel engelleri sıkmak için şekillerini değiştirmek gerekir Hücre. Bu kuvvetler odak yapışma etkileşimleri ile substrat aktarılır^2,3, ve TFM kullanılarak nicelik olabilir. Kanser biyokimyasal olarak son derece çeşitlidir, bilinen mutasyonlar ve protein değişimleri genişleyen repertuarı ile, bazı yaygın fiziksel değişiklikler gözlenmiştir; kanser çeşitli, meme, prostat ve akciğer kanserleri de dahil olmak üzere, metastatik hücreler 2-3 kez olmayan metastatik hücrelerin çekiş kuvvetleri^6,7,8uygulamak gösterildi. Bu sonuçlar, metastatik progresyon ve hücreler tarafından uygulanan çekiş kuvvetleri arasında güçlü bir korelasyon olabilir; Ancak, kontrazlık ayrıntılı zaman bağımlı değişiklikler incelemek zordur.

Epitelyal-mesenkimal geçiş (EMT), hücreler, daha fazla göç ve invazif hale gelen, bağlı ve sıkı kavşak aracılı hücre hücresi yapışma azaltmak bir süreçtir. Yara iyileşmesi ve gelişimsel süreçler içeren fizyolojik fonksiyonlara ek olarak, EMT aynı zamanda metastani sırasında sömürülen bir süreçtir ve bu işlem için yararlı bir model sistemi haline gelmiştir. TGF-β kullanarak, bu dönüşüm sırasında fiziksel değişiklikleri doğrudan ölçmek için murine meme epitelyal hücrelerde (nmumg)⁹ ' da EMT 'i teşvik edebilir ve TGF-β ' n i n EMT ve hücre kontraktifinde zaman ve doza bağımlı etkilerini karakterize edersiniz. Bu yazıda, indüklenen EMT sırasında kontrazlık değişikliklerini ölçerek bu yaklaşımın yardımcı programını gösteriyoruz.

Protocol

Not: aşağıdaki protokol imalat ve Şekil 1' de gösterilen Multi-Well TFM çanak kullanarak araştırmacılar rehberlik edecektir.

1. PDMS silikon substratlar hazırlanması

1. İki ticari kitin kompozit karışımı dayalı PDMS silikon kauçuk karışımı hazırlanması.
   1. A Bölümü Ekle ve PDMS kiti Part B (örneğin, GEL-8100, malzeme tablosunabakın) bir 1:1 ağırlık oranı Içinde 50 ml tüp.
      Not: karışımı tam karıştırma sağlamak için devrim sırasında ileri ve geri akış için yeterince yavaş bir hız Rotator üzerinde karıştırılır.
   2. Substrat istenilen modüus için kür Ajan gerekli miktarda ekleyin.
      Not: karışıma eklenecek kür maddesi miktarı, substratın istenilen modüline bağlıdır ve genellikle% 0,1 ile% 1,8 arasında değişebilir. Bkz. Tablo 1 ve Şekil 3 belirli crosslinker konsantrasyonları ve sonuç modülü için bir kılavuz için.
   3. 30-45 dakika Rotator üzerinde formülasyonu karıştırın; tam karıştırma için dönme yeterli yavaş olduğundan emin olun.
2. Alt tabaka: cam slayt üzerinde kaplama PDMS substratlar
   1. Şekil 2 ' de gösterilen özel yerleşik aynası spin-coater üzerine yerleştirin. Cam etanol veya isopropanol ile temizleyin ve tüy bırakmayan bir silme ile kuru. Cam slaytı ayna içine yerleştirin ve slaytı yerinde tutmak için vakumu açın.
   2. Kenarlardan yaklaşık 1 cm ve merkeze doğru çalışabileceğiniz bir PDMS uygulayın. Tüm yüzeyin kapalı olmasını sağlamak için yeterli (3-4 mL) PDMS uygulayın.
      Not: PDMS 'nin cam yüzeyine eşit şekilde yayıldığından emin olmak Için, bir pipet ucu PDMS karışımını merkezden kenarlara yaymak için yararlı olabilir.
   3. Aşağıdaki protokol ile bir spin-coater üzerinde PDMS karışımı ile cam spin.
      1. Slayt üzerinde sertleşmemiş resinin PDMS yaymak için, 50 RPM/s 0 ila 200 rpm hızlandırmak; 200 rpm 'de 1 dakika tutun.
      2. 100 μm kalınlığında PDMS tabakası elde etmek için, 50 RPM/s ile 300 rpm 'de hızlandırın ve 300 rpm 'de 1 dakika tutun. 100 μm dışındaki farklı istenilen kalınlıklarda belirli hız değerleri gerekecektir.
      3. Kaldırmak için 50 RPM/s 'ye 0 RPM 'ye kadar yavaşlama yapın. Vakum devre dışı bırakın ve kaplı yüzeye dokunmak için değil dikkat alarak, kaplı slayt çıkarın.
         Not: pürüzsüz bir sürekli yüzey sağlamak için ivme ve yavaşlama adımlarını eklemek önemlidir.
         DIKKAT: numunenin ayna üzerinden uçmadığından emin olmak Için, özel yapılmış tutucu slaytı tutmak için kullanılmalıdır ve sadece Vakum ve mevcut Yassı ayna üzerine güvenmez. Bu sahibinin detayları ve özellikleri Şekil 2' de verilmiştir.
   4. Spin kaplamalı numuneyi, 2 saat boyunca üretici tarafından önerilen sıcaklıkta (100 °C) fırında yerleştirin.
      Not: numunenin yerleştirildiği fırın yüzeyi, numunenin eşit Isıtma ve kalınlığını sağlamak için katı (yani, bir tel raf değil) ve seviye yüzeyi olmalıdır. Seramik veya çelik plaka ideal bir yüzey sağlar.
3. Üst boncuk tabakası
   1. Kalan PDMS karışımlarına uygun oranda boncuk çözeltisi ekleyin.
      Not: Bu oran, stok boncuk çözeltisi konsantrasyonuna ve numunenin istenilen boncuk yoğunluğuna bağlıdır. Tipik final değerleri 9,2 x 10¹¹ boncuk/ml ve 0.05-0.2 boncuk/μm²' dir ve boncuk fazlaları genellikle yetersiz bir miktara tercih edilir.
   2. Boncuk çözeltisi ile birlikte olmayan PDMS ile karıştırın. Bu yaklaşık 30 dakika için bir rotator üzerinde tüp yerleştirerek yapılabilir, 1-2 dk için vortekslenir, veya sonication için 30 dakika. Bu yöntemler birleştirilebilir.
      Not: bizim uygulamada, biz sonication boncuk toplar kırma etkili olduğunu bulmak, ve dönme karıştırma etkilidir. Sentezlenmiş Mütevelli boncuklar depolamada toplu olabilir. Önce kullanım, onlar hekzan ve sonicated resuspended olabilir. Önemli büyük toplamları varsa, bir 5 μm şırınga filtresi ile boncuk süspansiyon süzebilirsiniz. Bu filtrasyon adım isteğe bağlıdır; Bu monodispersed boncuklar ile örnek kat yardımcı olur, ama boncuk önemli bir kısmı filtrede kaybolabilir.
   3. Fırından slayt dışarı atın, oda sıcaklığına soğutmak için izin ve spin-coater üzerine yerleştirin.
   4. Kaplama numunenin yüzeyine 3-4 ml boncuk ve sertleşmemiş resinin PDMS karışımı ekleyin.
      Not: eklenen boncuk ile karışım hekzan nedeniyle daha az viskoz. Zaten kaplamalı PDMS substrat zarar verebilir gibi substrat yüzeyine dokunmayın emin olun. Ayrıca, boncuk karışımı başlangıçta yüzey ıslak olmayabilir; karışımı hemen tedavi PDMS yüzeyi kapalı akmaz dikkat çekin.
   5. Aşağıdaki protokol ile örnek döndür.
      1. Boncuk ve olmayan PDMS karışımı yaymak için, 100 RPM/s 0 ila 500 rpm hızlandırmak; 500 rpm 'de 1 dakika tutun.
      2. Boncuk gömülü PDMS (~ 1 μm) ince bir tabaka elde etmek için, 500 ila 5000 rpm 200 rpm/s hızlandırmak; 10 s için 5000 rpm 'de tutun.
      3. Kaldırmak için 100 RPM/s 'ye 0 RPM 'ye kadar yavaşlama yapın. Vakum devre dışı bırakın ve kaplı yüzeye dokunmak için değil bakım alarak, kaplı slayt kaldırın.
   6. Spin kaplamalı numuneyi 1 saat için 100 °C ' de fırında yerleştirin.
      Not: 100 °C ' nin üzerindeki sıcaklıklar veya 1 h 'den uzun süreler boncuk floresans azaltabilir. Fırın sıcaklığının 100 °C ' ye ayarlı olduğundan ve daha yüksek olmadığından emin olun.
   7. Protokol burada duraklatılmış olabilir. Numune saklamak için, toz ve ışık pozlama önlemek için yüzeyi kapak. Hiçbir şeyin yüzeye dokunduğundan emin olun. Örnek oda sıcaklığında raf-istikrarlı sonsuza kadar.
4. Plaka montajı
   1. 50 mL tüpüne 10:1 ağırlık oranındaki bir PDMS elastomer kiti ile a (baz) ve Part B (kür ajanı, örneğin, Sylgard) ekleyin.
   2. 30-45 dakika Rotator karışımı karıştırın.
      Not: bir plaka Için, 0,5 mL kür ajanı ile 5 mL taban karıştırın. Karışım viskozitesini azaltmak için 1 mL 'ye kadar hekzan eklenebilir.
   3. Bölücü alt karışımı uygulayın ve karışımı yayılır.
      Not: bölücü ters yerleştirilmelidir.
   4. Substrat bölücü ters üzerine Lay.
   5. Numuneyi 2 saat için 65 °C ' de fırında baş aşağı yerleştirin.
   6. Fırın örnekleri dışarı alın ve herhangi bir PDMS kalıntı kaldırmak için 70% etanol veya izopropanol ile cam alt temizleyin.
      Not: protokol burada duraklatılmış olabilir. Numuneyi saklamak için, substrat üzerine bir kapak yerleştirin ve ışığa maruz kalmamak için cihazı alüminyum folyo içine sarın. Örnek oda sıcaklığında raf-istikrarlı sonsuza kadar. Bu yöntemle kullanılan bölücü 96-Well formatında; Ancak, araştırmacılar diğer formatları (384-iyi, 2-iyi, 4-iyi, 8-iyi, vb) istenilen deney kurulumları ve bölme yapıların kullanılabilirliği bağlı olarak istihdam edebilir. Bazı daha fazla optimizasyon gerekebilir.

2. yüzey functionalization

1. 40 ml, 0,1 M HEPES tampon (pH 7-9) içinde bir sulfo-sanpah kısım 80 μL çözülür.
   Not: 2 ml steril dimetil sulfoxid (DMSO) içinde 100 mg sulfo-sanpah tozu çözünerek sulfo-sanpah plakaya hazırlayın. 0,1 M HEPES tamponu, 450 mL steril deiyonize suda ve 0,22 μm gözenek filtresiyle filtreye 50 mL HEPES seyreltilerek hazırlayın.
2. 96-kuyu plakasının her bir kuyusu için seyreltilmiş sulfo-SANPAH çözeltisi 200 μL ekleyin.
3. Uygun mesafe ve süre içinde UV (300-460nm) ışık plaka maruz.
   Not: UV maruz kaldıktan sonra, çözümün rengi daha koyu olmalıdır. UV pozlama mesafesi ve süresi UV lamba gücüne bağlıdır. Bizim uygulamada, biz 5 cm mesafede 10-15 dk için açığa.
4. Sulfo-SANPAH solüsyonu kuyulardan çıkarın ve her bir kuyu için 5 μg/mL fibronektin çözeltisi 200 μL ekleyin.
   Not: araştırma-belirtilen protein yüzey kaplama için kullanılabilir. Bazı sık kullanılan proteinler kollajen, fibronektin, ve laminin vardır. Biz bulduk sulfo-SANPAH en etkili yöntem olarak, ve plazma temizleme bazen PDMS istihdam ederken bir silikon dioksit tabakası oluşturur ve gözle görülür zarar yüzey olarak önerilmez.
5. Bir gecede 4 °C ' de plakayı kulbe etme.
   Not: kaplama için kullanılan proteine bağlı olarak farklı kuluçta yöntemleri uygulanabilir.
6. Fibronektin çözümünü çıkarın ve her iyi fosfat-tamponlu tuz (PBS) ile iki kez yıkayın.
7. Örnek üzerine bir kapak yerleştirin.
8. Her iyi için 200 μL PBS ekleyin.
   Not: protokol burada duraklatılmış olabilir. Fibronektin kaplı numuneler 2 haftaya kadar 4 °C ' de depolanabilir.

3. UV sterilizasyon

1. Numuneyi 30 dakika boyunca Biyolojik Güvenlik kabininde UV ışığı altında sterilize edin.
   Not: daha uzun UV pozlama süreleri boncuk floresans negatif etkileyebilir. Sonraki tüm adımlar Steril koşullar altında yapılmalıdır.

4. hücre kültürü

1. Her iyi PBS kaldırın ve 200 μL her iyi kültür medyasında askıya hücreler ekleyin.
   1. Hücreleri istenilen hücre yoğunluğunda plakalı olarak yapın. Hücre yoğunluğu istenilen denemeye bağlıdır. Tek hücreli çalışmalar için hücreler en az 50 μm ayrı olmalıdır ve görüntüleme penceresinin kenarlarının yakınındaki hücreler TFM ölçümüne dahil olmamalıdır. Tek tabakalı hücreler için, görüntüleme penceresinin bir hücre katmanıyla kaplı görüntüleme alanına sahip olması gerekir.
   2. % 5 FBS, 10 mm HEPES, 10 μg/ml insülin, 1% penisilin-streptomisin, 1 mm L-glutamin ve 0,5 μg/ml Amfoterisin B ile dmem takviyesi yaparak nmumg hücrelerinin tam büyüme kültürü ortamını hazırlayın.
   3. Asitlenmiş suda reconstituting ile insülin stoğu hazırlayın (2,5 mL deiyonize su 130 mL buzul asetik asit) 10 mg/mL konsantrasyonuna. Stok çözümünü 4 °C ' de saklayın. Çözelti açık olana kadar bekleyin ve 0,22 μm gözenek filtresine filtre uygulayın.
2. TGF-β ilavesi
   1. TGF-β stokunun hazırlanması için 100 μL 'de 10 mM sitrik asit (pH 3,0) ve 0,22 μm gözenekler ile filtre sterilize edilen 2 μg TGF-β çözülür. Tüp ve kısım istenilen hacimler içine Vortex. Plakaya-80 °c ' de saklayın.
   2. 3 ng/mL 'Lik son TGF-β konsantrasyonuna sahip hücre kültürü ortamını oluşturmak için tam hücre kültürü medyasını 10 mL 'ye kadar TGF-β stok çözeltisi 1,5 μL ekleyin.
      Not: 10 mM pH 3,0 sitrik asit yapmak Için, suda asit seyreltmek ve HCl ekleyerek 3,0 için pH ayarlayın.

5. veri edinme

1. Her pozisyon için, en az bir Mütevelli parçacıklar ve hücrelerin görüntü elde. Boncuk katmanına odaklan.
   Not: piksel boyutu, kullanılan Mütevelli parçacıklar ve görüntü işleme yönteminin boyutuna göre optimize edilmelidir. Bu uygulamada, yazarlar 10X 0,4 NA objektif kullanın ve görüntüler 1024 x 1024 çözünürlük ile elde edilir, ile 455 nm/pixel. Genel olarak, boncuk başına en az yaklaşık 1-5 piksel çözünürlüğünü korumak yararlıdır; burada, boncuk polydisperse ve 300-500 Nm bireysel boyutuna sahip. Bu floresan Mütevelli boncuklar TFM hesaplamaları için kullanılacak görüntüleri için odak olması önemlidir. Boncukların odak ve görüntüleme kalitesi, hücrelerin kendilerini görüntüleme üzerine önceliklenmiş olmalıdır. Farklı kanallar arasında çapraz konuşma olmamalıdır, özellikle boncukların görüntüleme spektrumunda görünen Mütevelli boncuklardan olmayan herhangi bir floresan.
2. Tüm ilgi pozisyonları kaydedildikten sonra, her bir iyi için dekolmanı çözüm eklemek Mütevelli partiküllerin kuvvet ücretsiz referans görüntüleri elde etmek.
   1. Hücre dekolmanı çözeltisi hazırlamak için,% 2 TritonX-100, 50 mM sodyum azid ve 500 mM potasyum hidroksit içeren sulu bir solüsyonu karıştırın.
      Not: Yukarıdaki etkili bir dekolmanı çözüm örneği olarak sağlanmıştır. Araştırmacıların takdirine göre farklı dekolman çözümleri, hücreleri substrat yüzeyinden ayırmak için kullanılabilir.

6. görüntü analizi

1. İstediğiniz şekilde uygun görüntü analizi gerçekleştirin.
   Not: analiz yazılımı evde geliştirilmiştir. Görüntü analizi, çevrimiçi olarak kullanılabilen özel yazılım veya yazılım ile yapılabilir.

7. boncuk sentezi

Not: aşağıdaki protokol, Klein ve al.¹⁰tarafından açıklanan sentez yöntemine dayanır.

1. Bir duman kaputu altında, bir su soğutmalı reflü kondansatör ile üç boyun Flask hazırlayın.
   DIKKAT: iyi havalandırılmış kimyasal duman kaputu içinde sentezini ayarlayın.
2. 0,5 mL PDMS sabitleyici ve fluorophore eklemek için Flask.
3. Bir boyun bir azot giriş iğne ve bir çıkış iğnesi ile kauçuk septum ile donatın ve bir şırınga ile reaktif eklemek için kauçuk septum ile diğer boyun donatmak.
4. Eklemek 100 mL susuz hekzan içinde 250 mL Flask ve küçük bir manyetik karıştırın Bar ekleyin.
5. 75 °C ' de maden yağı banyosuna koyun ve 1 saat boyunca nitrojen gazı ile temizleyin.
6. 25 mL yuvarlak alt Flask için metilmethacrylate 6 mL ekleyin.
7. 0,100 g 2, 2 '-azobisisobutyronitrile (AıBN) yuvarlak alt Flask ekleyin ve 1 h için azot gazı ile karışımı temizleyin.
   Not: kullanmadan önce inhibitörleri kaldırmak için önceden ambalajlanmış sütun üzerinden metillametakrilgeç Flush. Üç boyun Flask için metiklametakrilat ve AIBN karışımı ekleyin.
8. Çözüm başlangıçta bulutlu olur ve sütlü döner. Çözüm bulutlu olduktan sonra 3 saat boyunca reaksiyon çalışmasını sağlar.
9. 3 saat sonra, bir buz suyu banyosu içinde Flask yerleştirin.
10. Solüsyonu kaba filtre kağıdıyla vakum-filtreleyin.
11. Filtrat Santrifüjü ve hekzan parçacıkları yeniden askıya.
    Not: eklenecek hekzan hacmi, boncuk çözeltisi istenilen konsantrasyona bağlıdır. Sonication hekzan çözeltisi boncuk partiküllerin yeniden dağılımı kolaylaştırır. Yazarlar tarafından üretilen boncuklar yaklaşık 300-500nm polydisperse çapları var. Çapraz korelasyon desen izleme kullanımı nedeniyle yer ayırıntısını belirlemek için, Monodisperse boncuk gerekli değildir.

8. Reoloji ölçüm Protokolü

Not: her araştırmacı veya deney için Reoloji gerekli değildir, ancak PDMS yeni formülasyonları için modüle ölçmek için gereklidir. Bu protokolde, PDMS numunelerinin modülünde crosslinker, frekans ve gerilme etkilerini ölçmek için bir kayma reometresi kullanıyoruz. Mevcut araçlara ve uzmanlığa bağlı olarak, modül diğer birçok mekanik analiz yaklaşımı kullanılarak da ölçülebilir. Ayrıca, bu protokolü kullanan araştırmacılar Tablo 1, Şekil 3 ve Şekil 4' te sunulan yayımlanan modüllerimizi kullanmayı seçebilir.

1. 25 mm çapında paralel plaka geometrisi ile bir Reometer kullanın. Diğer geometriler de kullanılabilir.
2. Sistemi başlatın ve cihazı ve ölçüm sistemini kalibre edin (Paralel plaka, d = 25 mm). Sıfır boşluğu ölçmeden sonra PDMS örneğini yüklemeye başlayın.
3. PDMS elastomer ve çapraz ajanı karıştırılmaz, karışımı Reometre alt plakasına pipet.
   1. PDMS örneğinin üst kısmına tamamen temas etmek için iğ aşağı doğru hareket ettirin.
   2. Yüklü numune fazlalığını alt plakaya dikkatlice kırpın.
4. Bir gerilme süpürme testinde, tüm kesme ölçümleri sırasında polimer yapısının doğrusal viskoelastik rejimde kalmasını sağlamak için farklı çapraz bağlama yoğunluğuna sahip her kompozisyon için artan suşları uygulayın.
   Not: hücre çalışmaları için ilgili gerinim değerleri genellikle 0.1-10% aralığında bulunmaktadır. Biz PDMS yaklaşık% 100 gerilme kadar doğrusal olacak bulduk.
5. 100 °C ' de% 0,5 ' lik 1 Hz ve osilasyon kesme sıklığına sahip bir zaman süpürme testinde PDMS ağının dinamik kesme depolama modülünü (G ') ve kayıp modülünü (G ′ ′) ölçün.
6. Son PDMS ağının viskoelastikiyetini ve zaman bağımlılığını belirlemek için 0.1-100 Hz arasında frekans tarama testi ve% 0,5 ' lik osilasyon kesme gerilimi uygulayın.

Results

TGF-β eklenmeden önce, hücrelerin bir confluent Tek tabakalı şekli gibi bir Arnavut kaldırımlı ve sıkıca paketlenmiştir. TGF-β tedavisi üzerine, hücreler daha fazla morfoloji, hücre alanını büyütmek ve daha mesenkimal fenotip elde uzatılmış hale gelir. Yumuşak PDMS elastomerlerle imal edilen çok iyi cihazı kullanarak, toplam 17 farklı koşullarda hücrelerin fiziksel özellikleri incelenmiştir. Hücreler dört farklı TGF-β konsantrasyonlarıyla (0,5, 1, 2 ve 4 ng/mL) ve dört farklı kuluçak süre...

Discussion

Bu yöntemin başarısı için, yaklaşık 100 μm sabit kalınlığına sahip homojen kaplanmış bir numune olması önemlidir. Modüle, ilgi biyolojik sisteminin fiziksel önemini incelemek için dikkatle seçilmelidir. Bir üst tabaka imal ettiğinde, fiducial floresan partiküllerinin konsantrasyonu, deplasman ve çekiş stresi doğru analizi için optimize edilmelidir. Yalıtılmış tek hücreleri analiz etmek, konfluent monolayerlerin ölçülmesine göre daha yoğun bir Mütevelli tabakası gerektirir. Ayrıca, Substratın yüzeyi, hücrelerin substrat y...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plaka< / güçlü >
GEL-8100	Nusil Teknolojisi	GEL-8100	Yüksek Saflıkta Dielektrik, Yumuşak Silikon Jel kiti
Dow Corning Sylgard 184 Silikon Kapsülleyici Şeffaf 0,5 kg Kit	Ellsworth Yapıştırıcılar	184 SIL ELAST KİTİ 0.5KG	kürleme maddesi
Özel Kesim Cam	Hausser Scientific Company		109,6 mm & artı; x 72,8 mm & plusmn; x 1mm kalınlık
Hedef 2TM Naylon Şırınga Filtresi	ThermoFisher Scientific	F2513-4
96 kuyulu Stripwell Yumurta Sandığı Şerit Tutucu	Corning	2572
Köşe Çentikli Polistiren Üniversal Mikroplaka Kapağı	Corning	3099
Etil alkol	Greenfield Global	P016EA95	0.95
2-Propanol	Sigma-Aldrich	190764	ACS reaktifi, ≥ %99,5
Yüzey Kaplama
Sulfo-SANPAH Çapraz Bağlayıcı	Proteochem	c1111-100mg
Fibronektin sığır plazması	Sigma-Aldrich	F1141-1MG	solüsyonu, steril filtreli, BioReagent, hücre kültürü için uygun
PBS, 1X	Wisent	319-005-CL	pH 7.4, kalsiyum ve magnezyum içermez
DMSO	Sigma-Aldrich	472301
Hücre Kültürü< / güçlü >
DMEM, 1X	Wisent	319-005-CL	4.5g / L glikoz, L-glutamin, sodyum piruvat ve fenol kırmızısı
FBS (Fetal Sığır Serumu)	Wisent	080-150	Premium Kalite,  Endotoksin < 1, Hemoglobin < 25
HEPES	Wisent	330-050-EL	1M, serbest asit
İnsan İnsülin Rekombinant	Wisent	511-016-CM	USP sınıfı
Penisilin-Streptomisin Çözeltisi	Wisent	450-201-EL	100 X, hücre kültürü için steril filtrelenmiş
L-Glutamin çözeltisi	Wisent	609-065-EL	200mM çözeltisi, hücre kültürü
için steril filtrelenmişAmfoterisin B	Wisent	450-105-QL	250μ g / ml, hücre kültürü için steril filtrelenmiş
Rekombinant İnsan TGF-β 1	Peprotech	100-21	HEK293 Türetilmiş
Asetik asit	Sigma-Aldrich	537020	Buzul, & ge; % 99,85
Sitrik asit	Sigma-Aldrich	251275	ACS reaktifi, > % 99,5
NMuMG	ATCC	CRL-1636	Fare Meme Bezi Hücre Hattı
Sodyum azid	Fisher Schientific	AC190385000	% 99, ekstra saf, ACROS Organics
Potasyum hidroksit	Sigma-Aldrich	221473	ACS reaktifi, & ge; % 85, peletler
TritonX-100	Sigma-Aldrich	X100	laboratuvar sınıfı
Boncuk Sentezi< / güçlü>
1,1 ve asal;-Dioktadesil-3,3,3 ve asal;, 3 & prim;-tetrametilindokarbosiyanin perklorat (DiI)	Sigma-Aldrich	468495-100MG	%97
Metil metakrilat	Sigma-Aldrich	M55909-500ML	şunları içerir: ≤ 30&nbşk; inhibitör olarak ppm MEHQ,% 99
İnhibitör Sökücü	Sigma-Aldrich & nbsp;	306312-1EA	Hidrokinon ve monometil eter hidrokinon
Metakriloksilpropil Sonlandırılmış Polidimetilsiloksan	Gelest	DMS-R31 (25.000g/mol)	Polidimetilsiloksan stabilizatörü, 25.000g/mol, 1.000 cSt
2,2′-Azobis(2-metilpropionitril) (AIBN)	Sigma-Aldrich	441090-25G	%98
Hekzan	Sigma-Aldrich	296090-2L	susuz, %95
Heksan, izomer karışımı	Sigma-Aldrich	227064-1L	susuz, ≥ %99
Whatman  kalitatif filtre kağıdı, Grade 1	Sigma-Aldrich	WHA1001055	daireler, çap 55  mm,
Ekipman< / güçlü >
Laurell WS-650Mz-23NPPB	Laurell Technologies
UVP El UV Lambası Modeli UVGL-58	VWR	21474-622
Reometre	Anton Paar	MCR 302 WESP