Yöntem makalesi

İndüklenebilir, hücre türüne özgü ifade Arabidopsis thaliana aracılığıyla LhGR-aracılı Trans-harekete geçirmek

DOI:

10.3791/59394

⸱

19 Nisan 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Developmental Physiology, Centre for Organismal Studies (COS) Heidelberg, 2Department of Cell Biology, Centre for Organismal Studies (COS) Heidelberg, 3Department of Stem Cell Biology, Centre for Organismal Studies (COS) Heidelberg

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, biz üretimi tarif ve transgenik Arabidopsis thaliana bir dizi uygulama etkinleştirme indüklenebilir, doku özel ifade üç ana sürgen, sürgün apikal meristem, kök apikal meristem ve cambium satırları.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İndüklenebilir, doku özel ifade genetik pertürbasyon spatio-zamansal dinamiği eğitim için önemli ve güçlü bir araçtır. (Burada GR-LhG4 denir) kanıtlanmış ve eşdeğerlik LhGR sistem indüklenebilir mesaj sistemiyle klonlama esnek ve verimli GreenGate bir araya getiren bir efektör ifade sürebilirim transgenik Arabidopsis satırlar üretilip üç ana bitki sürgen türlerinde belirli hücre aralığındaki kaset. Bu amaçla, biz chimeric transkripsiyon faktörü ve geniş bir ifade düzeyleri üzerinde sıkı kontrol sağlanması bir soydaş pOp-türü organizatörü göre daha önce gelişmiş GR-LhG4 sistemi seçti. Ayrıca, sentetik transkripsiyon faktörü etkin olduğu ifade etki alanı görmek için pOp4 veya pOp6 düzenleyicinin kontrolü altında bir ER lokalize mTurquoise2 floresan muhabir sürücü satırları içinde kodlanır. Burada, bir sürücü veya efektör satırı oluşturmak ve nasıl hücre türü belirli ifade indüklenen olabilir ve sürgün apikal meristem, kök apikal meristem ve Arabidopsiscambium göstermek için gereken adımları açıklar. Kullanarak birkaç veya tüm sürücü satırları, bir ifade bağlam belirli etkisi veya Multipl faktörler (effectors) sentetik pOp düzenleyicinin kontrolü altında hızla, örneğin bir efektör ve çoklu arasında bir haç F1 tesislerinde tespit edilebilir sürücü satırları. Bu yaklaşım ile VND7, NAC transkripsiyon faktörü bir hücre özerk şekilde Ektopik ikincil hücre duvar ifade ikna yeteneğine sahip Ektopik ifade örneklenir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyolojide önemli bir sınırlama postgenomic dönemde verilen faktörü veya genetik pertürbasyon bağlam belirli rolü deşifre etmektir. Kurucu genetik tedirginlikler işlev kaybı ve işlev kazanç yaklaşımlar gibi genellikle sadece ömür boyu uyum süreçleri, birincil ve ikincil etkileri arasında ayrım obfuscating son nokta analizi sağlar. Buna ek olarak, bağlam belirli işlevleri maskeli veya büyük ölçekli etkileri uzak dokularda veya diğer geliştirme aşamaları ile seyreltilmiş. Ayrıca, aşırı durumlarda, herhangi bir mekanik kavrama ölümcül engel. İdeal olarak, bu sorunları aşmak için bir akut genetik pertürbasyon belirli hücre türü gibi belirli bir bağlam içinde etkisini zaman çözülmüş bir şekilde analiz edebilirsiniz. Bunu başarmak için genetik indüklenebilir, hücre türüne özgü ifade için gerekli1araçlardır. Bir yanıt-e doğru belirli bir efektör kronolojik zamanmekansal dinamikleri hızlı değerlendirilmesi için bir kaynak sağlamak için biz-si olmak kombine tarafından GreenGate sistem2 GR-LhG4 sistemi3, kanıtlanmış etkinliği ile sağlanan klonlama kolaylığı 4,5,6. Biz-si olmak oluşturmak LhG4 ligand bağlayıcı etki iyi karakterize hücre türü belirli rehberleri8kontrol altında fare Kortikoid reseptör (GR)7 erimiş chimeric transkripsiyon faktörü ifade satırlar. GR etki alanı sitozolik HSP90 tarafından bağlı olarak koşulları dinlenme, transkripsiyon faktörü çekirdeği dışında kalır. Sentetik ligand deksametazon (Dex) eklenmesiyle, nükleer translocation indüklenen ve LhG4 transkripsiyon ifadesi kaset bir mTurquoise2 muhabir gibi bir soydaş sentetik pOp-türü düzenleyici denetimi altında arabuluculuk indüksiyon sonra ifade etki alanı görselleştirmek için sürücü satırları dahil.  Böylece, sürücü satırları teknik olarak da bir efektör kaset içerir. Sürücü satırları böylece bir efektör kaset ile örneğin, aynı pOp-türü düzenleyici denetimi altında ilgi bir gen taşıyan bir satırı ile bir dizi geçiş efektör ifade akut veya uzun vadeli sonuçları hızlı bir değerlendirme sağlar içinde çok çeşitli hücre tiplerinin.

Burada, sürücü ve efektör satırları oluşturmak ve nasıl hücre türü belirli ifade indüklenen olabilir ve sürgün apikal meristem, kök apikal meristem ve cambium, takip göstermek için gerekli prosedürleri açıklayan bir protokol sağlar Arabidopsis. Cesaret ve özgüllüğü bu yaklaşım göstermek için biz yararlanmak iyi bilinen transkripsiyon faktörü xylem gibi ikincil hücre duvar thickenings ectopically sürüş yeteneğine sahip olan VND79. PSCR10,11 sürücü çizgi ile pOp6:VND7 efektör çizgi arasında çapraz gelen F1 tedavi Ektopik xylem benzeri hücrelere kök hücre Arabidopsis nişasta kılıf oluşumunu yol açar.

Sürücü ve efektör ifade plazmidleri oluşturmak için gerekli büyük DNA derlemeleri nesil kolaylaştırmak için kullandığımız yöntem2klonlama hızlı ve verimli GreenGate. GreenGate klonlama dayalı tip II S enzimleri Eko31I veya onun isoschizomer Bsagibi ben2. Bu enzimler asimetrik tanıma sitelerinin temel kompozisyon değişen çıkıntılar üreten aşağı akım kesme. Eko31I birleşmeyle tarafından /Bsaben kısıtlama siteleri içinde oligonucleotides ve DNA öğeleri belirli çıkıntı serileri tahsis etme, modüler klonlama, büyük grupları oluşturmayı kolaylaştırmak elde edilir. GreenGate framework, DNA modülleri bağdaştırıcıları olarak hizmet ve bu sıraya göre monte edilir A-F çıkıntı sıralamasına dayanan kategori içine düşmek. Bu nedenle, istenen ürününüzü yükseltmek için tasarlanmış astar seçilen modül2 uygun olarak (şekil 1A) olmalıdır. Bir iç Eko31I / ı siteBsave sırası GreenGate giriş ve hedef modüller ile uyumlu değildir, mutagenizing olmadan, ama daha düşük verimlilik ile devam edebilirsiniz. Alternatif olarak, Eko31I kaldırmak için site yönettiği mutagenesis kullanın /Bsaben kısıtlama siteleri amino asitler gen ürünlerde değiştirmemeniz için dikkat çekici.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vektörel çizimler ve modülleri kar amacı gütmeyen depodan, Addgene (https://www.addgene.org) elde edilebilir.

1. GreenGate kullanarak klonlama

  1. Tablo 1' de listelenen çıkıntılar kullanarak tasarım astar, aşağıda listelenen 'NNNN' modülü türüne özgü adaptör dizileri ile değiştirme: İleri: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) CA* + belirli sıra 3´, ters: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) + ters tamamlayıcı belirli sıra 3´. Okuma çerçevesi bakım sağlamak için altı çizili üsleri ekleyin.
    Modül çıkıntılar:
    Not: varsayılan GreenGate framework, altı modülleri,'a-F, bir bitki dönüşüm vektör omurga ile bir ifade plazmid (şekil 1 c) monte edilir. Genellikle, A modülü organizatörü dizileri, bir B-modül bir N-terminal etiketi veya "kukla" sıra6, bir C-modül bir CD, bir D-modül C-terminal etiketi veya aptal, bir E-modülü bir sonlandırıcı ve bir F-modülü bir direnç kaset transgenik yelpazesi için liman bitkiler. Bağdaştırıcı kavraması ile preassembled diğer birimler için F modül2yerine kullanılabilecek vardır.
  2. PCR güçlendirme
    1. Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) göre standart iletişim kuralları tarafından ilgi ile tasarlanmış astar dizisi yükseltmek.
    2. Bir özel jel PCR ürünü ayırın. Tüketim ve sütun arındırmak bir ticari kullanarak doğru parçası ( Tablo malzemelerigörmek) üreticinin talimatina kit.
  3. Giriş modülü oluşturma
    1. Ayrı ayrı modül vektör ve PCR parçası (Adım 1.2.) sindirmek (Şekil 1 A, B) ile Eko31I/Bsaben 100-500 ng DNA (vektör veya parça), sindirim arabellek x 3 µL 10 ve 5-10 U Eko31I bir tüp içinde kullanarak ve 30 µL GKD2O. ile ses getirmek
    2. Karışımı yavaşça yukarı ve aşağı pipetting ve spin aşağı 1.000 x gkısaca tarafından. Bir ısı blokta 15 dakika (veya satın alınan restriksiyon enzimi zaman tavsiyesi ardından) 37 ° C'de kuluçkaya.
    3. Sindirim sonra sütun arındırmak her örnek bir ticari ( Tablo malzemelerigörmek) kiti ve optik yoğunluğu 260 belirlenerek elde edilen DNA ölçmek kullanarak bir Spektrofotometre kullanarak nm (OD260).
    4. Karışımı 30-100 ng Ekle ve 10-50 ng sindirilmiş vektör yukarı ve aşağı birkaç kez pipetting tarafından sindirilmiş ve T4 ligaz (5 U/µL ve 1s (aşağıdaki öneri için oda sıcaklığında 30 µL toplam hacmi T4 ligasyonu arabellekte x 3 µL 10 ile 1 µL kuluçkaya T4 ligaz tedarikçi) ( Tablo malzemelerigörmek).
      Not: istediğiniz molar oranı giriş modülü: hedef vektör (örn., 3:1) bağlı olarak konsantrasyon ve giriş modülü ekler uzunluğuna ligasyonu hesaplamak.
    5. Dönüştürme verimliliğini artırmak için ısı devre dışı T4 ligaz tepki için 20 dk 65 ° C'de kuluçka tarafından.
    6. Standart laboratuvar protokolleri ve Ağar kaplamalar bakteri Ampisilin (100 µg/mL) ile desteklenmiş forma göre yetkili E. coli dönüştürmek için ligasyonu ürün hücreleri kullanma
    7. 37 ° C'de bakteri ile plaka gece için kuluçkaya.
    8. İstenen giriş modülü ile kolonilerin koloni astar 86A1 (5 '-GTTGTGTGGAATTGTGAGC-3) ve 86A2 (5 '-GTTTTCCCAGTCACGACG-3) ve standart PCR koşulları kullanarak PCR tarafından ekran.
      Not: astar giriş vektör omurgaya bağlamak gibi bu astar kombinasyon tüm giriş modülleri için geçerlidir.
    9. Tek colonies plasmid izolasyon için seçin. Gecede bir 37 ° C shaker kuluçkaya ve 2 mL LB sıvı kültür Ampisilin (100 µg/mL) ile birlikte kullanın.
    10. İle bir mini hazırlık seti veya istenen çıkarma gecede sıvı kültüründen izole plazmid ( Tablo malzemelerigörmek) protokol.
    11. Plazmid doğru INSERT ile tanımlamak için restriksiyon enzimi, örneğin kesilmiş iki enzim benzersiz olarak, INSERT 200 seçili ng plazmid, sindirim arabellek, 5-10 U x 2 µL 10, enzimleri ve GKD2 karıştırarak seçerek çözümlemesi O 20 µL için.
    12. (Bkz. Adım 1.3.9.) astar 86A1 ve 86A2 kullanarak seçili plazmid sıra.
  4. Hedef modülü oluşturma:
    Not: hedef plazmid için istenen hedef modülü pGGZ001, pGGZ002 veya pGGZ0032 (şekil 1 c) kullanın.
    1. Bir tüp ve 50-150 ng boş hedef vektör karıştırın (pGGZ003, örneğin), her 50-300 ng dolu giriş modülü, 2 µL 10 x sindirim arabellek arabellek, 1,5 µL 10 mM ATP, 1 µL T4 ligaz (30 U/µL), 5-10 U µL Eko31I ve dH2O toplam hacmiyle 20 µl.
      Not: istediğiniz molar oranı giriş modülü: hedef vektör (örneğin 3:1) bağlı olarak konsantrasyon ve giriş modülü ekler uzunluğuna ligasyonu hesaplayın.
    2. Mix ve 30 kez 37 ° C 5 min için ve 2 dk, 5 dk 50 ° c ve 5 dk 80 ° C'de tek numaralı adımları takip için 16 ° C arasında değişen bir PCR thermocycler kullanarak GreenGate reaksiyon2 gerçekleştirmek
    3. Verimliliği artırmak eklemek 1 µL T4 ligaz (30 U/µL) ve 1.5 µL tepki için 10 mM ATP ve ısı-inactivation 20 dk 65 ° C'de T4 DNA ligaz, ardından oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.
    4. Tüp ligasyonu tepki yetkili E. coli dönüştürmek ve uygun seçmeli Ajan Spektinomisin (50 µg/mL) ile desteklenmiş Ağar kaplamalar bakteri yaymak için kullanın.
    5. 37 ° C'de tabakta dönüştürülmüş E. coli gece için kuluçkaya.
    6. Dönüştürme onaylamak için her tabak, sırasıyla içeren seçili tek kolonileri Spektinomisin (50 µg/mL) ve Ampisilin (100 µg/mL) yeniden çizgi. Sadece büyümek kolonileri Spektinomisin ama Ampisilin plakaları üzerinde kullanın.
    7. E.coli kolonileri gecede 37 ° C'de kuluçkaya
    8. Tek colonies plasmid izolasyon için seçin. Gecede bir 37 ° C shaker kuluçkaya ve 2 mL LB sıvı kültür Spektinomisin (50 µg/mL) ile birlikte kullanın.
    9. Bir mini hazırlık kiti ile ilgili plazmid izole ( Tablo malzemelerigörmek).
    10. Restriksiyon enzimi analizi ile kontrol edin (1.3.12 bkz.) ve sıra seçili olumlu yapıları astar 88C 3 (5 '-ACCTCTCGGGCTTCTGG-3 '), 88C 4 (5 '-CCTTTTTACGGTTCCTG-3 ') kullanarak. INSERT tam olarak bu astar ile sıralı değil, sıralama için iç astar tasarım.
      Not: (bkz: tartışma) pOp tekrar dizileri doğru sayıda ile içinde bind astar pOp6 (pOp6_F, 5 '-TGCATATGTCGAGCTCAAGAA-3 '; ve pOp6_R, 5 '-CTTATATAGAGGAAGGGTCTT-3 ') tanımlamak için klonlar kısa dizileri kanat PCR güçlendirme ve sonraki Jel Elektroforez için boyutuna göre ayrımcılık için kullanılabilir.
  5. Ara supermodule oluşturma
    1. Giriş modülleri, supermodules2, son ifade montaj önce adı GR-LhG4 sürücü içeren satırları entegre muhabir-efektör kaset, ilk yapı iki ara Plazmidler, üretmek için gerektiği gibi iki bağımsız kümelerini birleştirmek için Plazmid pGGZ001 veya pGGZ003.
    2. İlk supermodule ve H-bir adaptör olarak açıklanan2(Bu iki yapıları arasında bağlantı olarak hizmet) ikinci supermodule başında sonunda F-H adaptör eklediğinizden emin olun.
      Not: Sadece pGGN000 ara modülü direnç kaset taşır. İfade plazmid oluşturmak için hedef vektör ve pGGN000 ve pGGM000 ara supermodules ile GreenGate reaksiyonu gerçekleştirmek. Alternatif olarak, hedef vektör, pGGN000 ara supermodule ve GreenGate reaksiyon2gerçekleştirmek için kalan tek modülleri karıştırın. İkinci yöntem eski daha az verimlidir ama daha hızlı olabilir.
    3. PGGM000/pGGN000 supermodule oluşturmak için 1,5 µL (100-300 ng/µL) her giriş modülleri, mix 1 µL (30 ng/µL) boş ara vektör (pGGM000 veya pGGN000), 2 µL 10 x sindirim arabellek, 1,5 µL 10 mM ATP, 1 µL T4 ligaz (30 U/µL) ve 5-10 U Eko31I 20 µL toplam hacmi.
      Not: ligasyonu konsantrasyon ve giriş modülü ekler uzunluğu bağlı olarak istenilen molar oranı giriş modülü: hedef vektör (örn., 3:1) hesaplamak
    4. Mix ve GreenGate reaksiyon olduğu gibi adım 1.4.2 gerçekleştirmek
    5. Verimliliği artırmak eklemek 1 µL T4 ligaz ve 1,5 µL ATP (10 mM) ve ısı-inactivation 20 dk 65 ° C'de ardından oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.
    6. Tüp ligasyonu tepki 10 µL yetkili E. coli ve çizgi sefaloridin (50 µg/mL) içeren plakalar üzerinde dönüştürmek için kullanabilirsiniz.
    7. 37 ° C'de tabakta dönüştürülmüş E. coli gecede kuluçka gerçekleştirmek
    8. Her seçili tek kolonileri sefaloridin (50 µg/mL) ve Ampisilin (100 µg/mL) Kaplamalar, sırasıyla içeren yeniden çizgi.
    9. E.coli kolonileri gecede kuluçka 37 ° C'de plaka üzerinde gerçekleştirmek
    10. Sadece sefaloridin ancak Ampisilin plasmid izolasyon için büyümek tek kolonileri seçin. Gecede bir 37 ° C shaker kuluçkaya ve 2 mL LB sıvı kültür sefaloridin (50 µg/mL) ile birlikte kullanın.
    11. Kısa bir hazırlık kullanarak karşılık gelen plazmid Kiti ( Tablo malzemelerigörmek) izole etmek.
    12. Plazmid restriksiyon enzimi analiz tarafından kontrol (1.3.12 bkz.) ve astar 87E2 (5´-AGGCATCAAACTAAGCAGAAG-3´) ve 87E3 (5´-CGTTTCCCGTTGAATATGGC-3´) pGGM000/pGGN000 omurgaya tavlama kullanarak sıralama tarafından onaylayın. INSERT tam olarak bu astar ile sıralı değil, sıralama için iç astar tasarım.
      Not: pGGM000 ya da pGGN000 vektörler klonlama başarısız olursa, olası bir çözüm pGGM000 veya pGGN000 ile Eko31I sindirmek, bir jel üzerinde çalıştırmak ve jel pGGM000 veya pGGN000 omurga (yaklaşık 2000 bp) parçası olmadan arındırmak olduğunu ccdB kaset (yaklaşık 1400 bp). Sonra normalde ligasyonu tepki ile devam edin.
  6. Çoğaltma (ori A. tum.) hedef vektörel çizimler pSa kökeni gerektirir gibi yardımcı plazmid pSOUP12varlığı bir A. tumefaciens pSOUP+ zorlanma (örneğin ASE) dönüştürmek. Kloramfenikol (34 µg/mL), sefaloridin (50 µg/mL), spektinomisin (50 µg/mL) ve tetrasiklin (12,5 µg/mL) içeren LB plakaları gittiğin bakteriler dışarı. Dönüştürülmüş A. tumefaciens 28 ° C kuluçka plaka üzerinde 2-3 gün kuluçkaya.

2. nesil Arabidopsis transgenik bitkiler

  1. Arabidopsis thalianadönüşümü.
    Not: A. thaliana bitkiler göre Zhang ve ark., 200613dönüşümü.
  2. Transgenik satır seçimi.
    1. Dönüştürülmüş bitkileri seçmek için GABI-Kat14 , sülfadiazin15direnç için kullanılan seçim düzeni kullanın.
    2. Bir şekilde tek bütünleştirilmesi olay ile istikrarlı satırları seçmek için bu nesil T2, 3:1 segregasyon oranı direnç işaretleyicisinde gösteren seçin. Bu satırları T3 nesile yaymak ve direnç gen için homozigoz bitkiler seçin. Alternatif olarak, bir Southern Blot analizi veya tek ekleme satırları seçmek için bir standart nicel gerçek zamanlı PCR (SA-qPCR)16 gerçekleştirin.

3. indüksiyon trans-etkinleştirme Arabidopsis sürücü satırları '

  1. Kök
    1. Adım 1 ve 2, aşağıda açıklandığı gibi tohumlar sterilize aracılığıyla oluşturulan A. thaliana sürücü satırları muhabir ifade sınamak için.
      1. 0.5-1.0 eklemek mL + %70 etanol %0.01 non-iyonik deterjan 1,5 ml tepki tüp ve ters çevir'i tüp içinde yaklaşık 100 tohum (20 mg) için bir kaç kez. Spin aşağı 1000 x g 15 s ve Aspire edin süpernatant için de.
      2. 0.5-1.0 eklemek mutlak etanol mL. Tüp birkaç kez ters çevir, 1000 x g 15 s ve atma süpernatant için spin aşağı.
      3. 0.5-1.0 eklemek mL mutlak etanol ve tüp t bir kaç kez, sonra spin aşağı 1.000 x g 15 s ve atma süpernatant için de ters çevir.
      4. Başlık içinde Kuru tohumlar izin. Eğer tohum tüplerde tabakalı 3.1.1.6 adımla devam edin.
      5. 0.5-1.0 eklemek mL steril su ve ters çevir'i tüp bir kaç kez. Spin aşağı 1.000 x g 15 s ve atma süpernatant için de.
      6. 0.5-1.0 eklemek mL steril su ve ters tüp birkaç kez. Spin aşağı 1.000 x g 15 s ve atma süpernatant için de.
      7. 0.5-1.0 eklemek mL steril su.
    2. Yarı güçte Murashige ve Skoog orta, pH 5,8 hazırlamak ve % 0,9 bitki agar ve % 1 Sükroz ekleyin. Isıyla ekledikten sonra deksametazon (Dex), DMSO, 10-30 µM için indüksiyon plakaları ve DMSO eşit miktarda için kontrol levha, son bir konsantrasyon için sırasıyla dağıldı.
    3. Tohum kök görüntüleme için plakaları koymak ve onları tabakalaşmak 48 h için karanlık ve soğuk (4 ° C) içinde.
    4. Bir bitki kuluçka (uzun gün (16/8 h), 22 ° C, nem oranı, % 65) dikey konumda plakaları koymak ve beş gün boyunca onları büyümek.
    5. Beş gün sonra çimlenme (dag), confocal lazer mikroskobu tarama kullanma Fideler görüntü.
  2. Kök
    1. Tohum 2.1.1 içinde açıklandığı gibi sterilize. ve ½ MS, % 0,9 bitki agar ve % 1 Sükroz plakaları üzerinde tohum koymak. 48 h için karanlık ve soğuk (4 ° C) içinde tabakalaşmak.
    2. Altı-yedi gün sonra çimlenme, toprak için her bitki (uzun gün (16/8 h), 22 ° C, nem oranı, % 65) tek bir tencerede fidan aktarın.
    3. Trans-etkinleştirme kaynaklanıyor'Dex veya sahte çözüm ile sulama veya sırasıyla Dex veya sahte çözümler, tesislerinde daldırma neden.
    4. Sulama için 25 µM Dex çözümde 25 mM Dex etanol içinde çözünmüş stokunun hazırlanan su kullanın. Su her 2-3 gün indüksiyon istediğiniz zaman kadar.
    5. Daldırma için bir 1 L ölçek, 750 mL su Dex veya eşdeğer miktarda DMSO 25 µM ile %0,02 silwet L-77 Dex ve sahte tedavisi için sırasıyla içeren hazır olun. 30 tek bitki daldırma s indüksiyon veya sahte çözüm. 2-3 günde görüntüleme istediğiniz zaman kadar yineleyin.
      Not: daldırma takiben, bitkiler yüksek nem için bir saat sağlanmalıdır.
  3. Sürgün apikal Meristem (SAM)
    1. Tohum 2.1.1 içinde açıklandığı gibi sterilize. ½ MS, % 0,9 bitki agar ve % 1 Sükroz orta plakaları hazırlamak ve tohum plakaları koymak. Tabakları iki gün boyunca karanlık ve soğuk stratifikasyon için saklayın.
    2. Dikey konumu bir bitki kuluçka tabak koyun. Altı-yedi gün sonra çimlenme, fide toprak, her bitki tek bir tencerede (uzun gün (16/8 h), 22 ° C, nem oranı, % 65) aktarın.
    3. Kök yaklaşık 1 cm uzunluğunda (25-30 dag) olduğunda, SAM önümüzdeki 10-50 µM ile sprey Dex H20 bir yüz maskesi giyiyor. İndüksiyon ve daha sonraki gelişim aşamasında görüntüleme için daha uzun kaynaklanıyor veya yan sürgünler SAMs ikna etmek.
      Not: SAMs da olabilir sprey damlacıkları önlemek için Dex çözüm paintbrushing tarafından indüklenen. Dex püskürtülerek uygulandığında bir maske kullanın.
    4. 24-48 h indüksiyon sonra SAMs teşrih ve görüntüleme için devam edin (bkz: 4.3).
      Not: Gen damping olasılığını azaltmak için yayılma sadece un indüklenen bitkiler kullanılmıştır. T2/T3 bitkilerde görüntüleme için kullanılmıştır.

4. gazeteci ifade Arabidopsis sürücü satırları görüntüleme.

  1. Kök
    1. Fidan plaka 10 µg/mL propidium iyodür (PI) çözüm aktarın ve onlara karşı 5 min için leke.
    2. Kökleri odası Imaging mikroskop yerleştirin (1-iyi doku kültürü II, cam üzerinde görün Malzemeler tablo) ve bir 63 su daldırma amaç x mikroskopla tarama confocal lazer kullanarak görüntü ( Tablo malzemelerigörmek).
    3. PI Floresans görselleştirmek için bir uyarma dalga boyu 488 nm ve toplamak emisyon 590 ve 660 nm arasında kullanın. MTurquoise2 floresan 458 nm uyarma kullanın ve emisyon 460 ile 615 nm arasında toplamak.
  2. Kök
    1. Yatay el bitki sapları bir tıraş bıçağı ile bölümlerini kesip gerçekleştirmek, bir kesimi, yaklaşık 3 cm. bilincin parmak kesmek için istediğiniz bölümün karşı tarafta kök düzeltin. Birkaç iyi kesim sırayla gerçekleştirir, ancak yalnızca kök benzer bir pozisyonda bölümlerden karşılaştırılması gereken unutmayın.
    2. Her kesim sonra musluk suyu içeren bir petri razorblade bırakın ve kök bölümler toplamak. Bu noktada bölümleri leke veya doğrudan mikroskop slaytlar üzerine monte edin.
    3. Boyama için hazırlamak 250 µg/mL PI lik küçük bir petri suda 1 mL ( Tablo malzemelerigörmek). Bölüm 5 min için bırakın ve onları suyla durulayın. Onları iyi Forseps ile mikroskop slaytlar veya ince boya fırçası aktarın. Coverslip örnekleriyle sıkmak değil için dikkat ediniz.
    4. Görüntü bir 25 Su daldırma objektif daldırma x mikroskopla tarama confocal lazer kullanarak örnekleri ( Tablo malzemelerigörmek). PI Floresans heyecanlandıracak ve 570 620 için toplamak için nm lazer ışık kullan 561 nm. Sürücü tarafından kodlanmış mTurquoise2 fluorophore efektör heyecanlandırmak için kullanım 405 nm satır yapıları ve toplamak emisyon düşük 425 475 için nm.
  3. Apikal Meristem ateş
    1. Kök sürgün ucu aşağıda 2 cm Forseps ile kesti. Kök bir elinde tutmak ve iyi forseps çiçek tomurcukları ve büyük primordia kaldırmak için kullanın. Genç primordia kaldırmak için %3 özel içeren bir petri içine dik konuma SAM saptamak. Bir dürbün ve forseps SAM yakın genç primordia kaldırmak için kullanın. Alternatif olarak, bir enjeksiyon kanül kullanın (Bu primordia kesmek için Malzemeler tablobkz:).
    2. 5-10 dakika çözüm hazır SAM üstüne boyama birkaç damla pipetting tarafından doğrudan boyama gerçekleştirmek için 250 µg/mL PI çözümünde disseke SAM leke veya örnek çözüm boyama ile dolu bir tüp aktarın. Tutun SAM tam olarak boyama işlemi sırasında sular altında.
    3. Lekeli SAM küçük bir petri kabına yerleştirin (bkz. Tablo reçetesi) %3 özel orta ve kapak SAM GKD2O.
    4. Görüntü disseke su daldırma objektif daldırma x 25 ile donatılmış mikroskobu tarama confocal lazer kullanarak SAMs ( Tablo malzemelerigörmek).
    5. PI Floresans heyecanlandıracak ve 570 620 için toplamak için nm lazer ışık kullan 561 nm. MTurquoise2 fluorophore ve toplamak emisyon 425 475 için heyecanlandırmak için kullanım 405 nm nm.
      Z-yönde adım boyutu 0.5 µm olarak 50 µm kapsayan görüntü yığınları kaydedin.
      Not: görüntüleme SAM burada açıklandığı gibi dik bir confocal lazer tarama uzun çalışma mesafesi ile mikroskop ve bir lens (burada, objektif daldırma bir su) gerektirir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GreenGate klonlama yoluyla sürücü ve efektör hatları nesil

Sistem klonlama GreenGate GoldenGate klonlama ve kullanım türü IIS kısıtlama endonükleaz Bsadayanmaktadır ben ya da onun isoschizomer Eko31I. Enzim üreten çıkıntılar uzak asimetrik tanıma sitesinden, çıkıntılar temel kompozisyon serbestçe olabilir gibi temel seçilen sistemin modüler oluştururlar. Her PCR tarafından oluşturulan öğe, örneğin, bir organizatörü sıra, CD veya Sonlandırıcı, ilk eşleşen bir ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, çok yönlü ve kapsamlı araç seti indüklenebilir, hücre türü belirli transiçin görüntüsünü oluşturmak ve gerekli adımları açıklamak-harekete geçirmek. Efektör kaset sürücü satırları ile pOp düzenleyicinin kontrolü altında taşıma hatları geçiş yanlış ifade etkileri geniş bir hücre tiplerinin genetik pertürbasyon hızlı değerlendirilmesi etkinleştirme F1 nesil eğitim sağlar. Alternatif olarak, efektör yapıları sürücü satırları dönüştürmek için kullanılan veya klonlama strateji, sürücü ve efektör adap...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laboratuarlarımızda çalışmalarında Almanca Araştırma Vakfı (DFG) tarafından desteklenen hibe WO 1660/6-1 (S.W.) ve GR 2104/4-1 (TG) ve SFB1101 (için TG ve J.U.L) ve Avrupa Araştırma Konseyi tarafından consolidator vermek (PLANTSTEMS 647148) TG için  S.W. DFG Grant WO 1660/2 aracılığıyla Emmy Noether Kardeşliği aracılığıyla desteklenir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AmpisilinCarl Roth GmbH + Co. KGK029.1
ATPSigma-AldrichA9187
KloramfenikolSigma-AldrichC1919
Kolon saflaştırmaQiagenQIAquick PCR Saflaştırma Kiti (250)
Görüntüleme için kültür odasıSarstedt AG & Co. KG1 oyuklu doku kültürü odası, kapak camı üzerinde II
DeksametazonSigma-AldrichD4903
DMSOFisher Scientific, İngiltereD139-1
Eco31IThermo Fisher ScientificFD0294
enjeksiyon kanülü (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2)Sterican, Braun
KanamisinCarl Roth GmbH + Co. KGT832.2
Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda mavisi 63x suya daldırma objeivLeica, Wetzlar, Almanya
MS mediumDuchefa, Haarlem, HollandaM0221.0050
Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x  1.1 NA suya daldırma objektifiNikon, Minato, Tokyo, Japonya
Petri kabı 35/10 mmGreiner Bio-One GmbH, Almanya627102
Petri kabı 60/150 mmGreiner Bio-One GmbH, Almanya628102
Petri kabı 120/120/17Greiner Bio-One GmbH, Almanya688102
Bitki agarDuchefa, Haarlem, HollandaP1001
Plazmid ekstraksiyonuQiagenQIAprep Spin Miniprep Kiti
Propidyum iyodür (PI)Sigma-AldrichP4170
Tıraş BıçağıClassic, Wilkinson Sword GmbH7005115E
Reaksiyon tüpleriSarstedt AG & Co. KG72.690.001
Silwet L-77Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Almanya
SpectinomycinAppliChem GmbH3834.001
SpektrofotometreThermo Fisher ScientificNanoDrop 2000c
SucroseCarl Roth GmbH + Co. KG4621.1
SülfadiazinSigma-AldrichS6387
TetrasiklinAppliChem GmbH2228.0025
T4 Ligaz 5 U/&mikro; lThermo Fisher ScientificEL0011
T4 Ligaz 30 U/&mikro; lThermo Fisher BilimselEL0013

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. Transactivated and chemically inducible gene expression in plants. The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).
  2. Lampropoulos, A., et al. GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PLoS One. 8 (12), e83043(2013).
  3. Baroux, C., et al. Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).
  4. Craft, J., et al. New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis. The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).
  5. Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).
  6. Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco. The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).
  7. Picard, D. Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis. Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).
  8. Schurholz, A. K., et al. A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis. Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).
  9. Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).
  10. Di Laurenzio, L., et al. The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root. Cell. 86 (3), 423-433 (1996).
  11. Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot. Development. 127 (3), 595-603 (2000).
  12. Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).
  13. Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).
  14. Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database. Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).
  15. GABI KAT. Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine. , Available from: https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html (2018).
  16. Huang, Y., et al. Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation. PLoS One. 8 (1), e53489(2013).
  17. Wallner, E. S., et al. Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation. Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).
  18. Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems. Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).
  19. Watanabe, Y., et al. Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls. Science. 350 (6257), 198-203 (2015).
  20. Yamaguchi, M., et al. VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system. Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).
  21. Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis. BMC Plant Biology. 5, 9(2005).
  22. Aoyama, T., Chua, N. H. A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants. The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).
  23. Decaestecker, W., et al. CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis. bioRxiv. , (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

nd klenebilir EkspresyonLhGR SistemiGreenGate KlonlamaKonfokal MikroskopiDeksametazon nd ksiyonuS rg n Apikal MeristemiK k Apikal MeristemiKambiyum Analizi

İlgili makaleler