Yöntem makalesi

Yakınlık ligasyon assay kullanarak ınsan pankreatik Beta hücrelerinde situ Içinde endojen Mitophagy kompleksleri görselleştirme

DOI:

10.3791/59398

⸱

2 Mayıs 2019

 , 
1Department of Internal Medicine, Division of Metabolism, Endocrinology and Diabetes, University of Michigan, Ann Arbor, 2VA Ann Arbor Healthcare System

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, özellikle primer insan Islet örneklerinden Beta hücrelerinde mitofagoy protein kompleksi oluşumunun nicel analizi için bir yöntem özetliyor. Bu teknik, değerli insan pankreatik beta hücre örneklerinde önemli olan sınırlı biyolojik materyalden mitophaginin analizini sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitofajit, glukoz stimüle edilen insülin salınımı için pankreas Islet Beta hücresi Biyoenerji için önemli olan temel bir mitokondriyal kalite kontrol yoludur. Mitophagy değerlendirilmesi zordur ve genellikle genetik gazetecilere veya primer insan pankreatik izletleri gibi doku örneklerinde kolayca kullanılabilen çoklu tamamlayıcı teknikler gerektirir. Burada, primer insan pankreatik izletlerinde anahtar endojen mitophagy kompleksleri görselleştirilmesi ve ölçülmesine yönelik güçlü bir yaklaşım gösteriyoruz. Hassas yakınlık ligasyon assay tekniği kullanarak mitophagy regülatörleri NRDP1 ve USP8 etkileşimi algılamak için, özellikle situ içinde temel mitofajit kompleksleri oluşumunu ölçmek edebiliyoruz. PDX1 transkripsiyon faktörü için bu yaklaşımı kullanarak, biz mitophagy kompleksleri ve özellikle Beta hücreleri içinde mitophagy zarar verebilir faktörleri ölçmek olabilir. Tarif ettiğimiz metodoloji, immünopresipitasyon (IP) veya kütle spektrometresi gibi diğer protein-protein etkileşimi çalışmaları için gerekli olan büyük miktarlarda hücresel ekstraktlara ihtiyacı üstesinden gelir ve genellikle değerli insan Islet örnekleri için idealdir Bu yaklaşımlar için yeterli miktarlarda kullanılabilir. Ayrıca, Bu metodoloji akış ayıklama teknikleri, aşağı protein uygulamaları için heterojen bir Islet nüfusu beta hücrelerini arındırmak için ihtiyaç ortadan kaldırır. Böylece, heterojen ve sınırlı hücre nüfuslarında kullanmak için son derece uyumlu mitofajit görselleştirme için değerli bir protokol açıklanmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pankreas Beta hücreleri normal glikoz homeostaz korumak için gerekli insülin üretmek, ve diyabet her türlü gelişiminde onların başarısızlık sonuçları. Beta hücreleri insülin salınımı ile çift glikoz metabolizması için gerekli enerjiyi üretmek için sağlam bir mitokondriyal kapasiteyi korur. Son zamanlarda, fonksiyonel mitokondriyal kütle Bakımı optimum beta hücre fonksiyonu1,2,3için önemli öneme sahip olduğu belirgin hale gelmiştir. Fonksiyonel mitokondriyal kütlesini sürdürmek için, Beta hücreleri disfonksiyonel, hasarlı veya yaşlanma mitokondri4kaldırmak için kalite kontrol mekanizmaları güveniyor. Biz ve diğerleri daha önce beta hücrelerinin mitokondriyal cirosunun özel bir formu, mitokondriyal otophagy (veya mitophagy) denilen, hem kemirgen ve insan adacıklar1 mitokondriyal kalite kontrolünü korumak için güvenmektedir göstermiştir 2,5. Ne yazık ki, ancak, mitophagy tespit etmek için basit bir yöntem yoktu, ya da Endogenously mitophagy bileşenleri ifade, insan pankreas Beta hücrelerinde.

Geçenlerde Beta hücrelerinde mitophagy upstream yönetmelik E3 Ligas CLEC16A ve NRDP1 ve deubiquitinase USP81oluşan bir protein kompleksi oluşumuna dayanır göstermiştir. NRDP1 ve USP8 bağımsız olarak mitophagy anahtar mitophagy Başlatıcı Parkin üzerinde eylem yoluyla etkilemek için gösterildi6,7. NRDP1 mitophagy kapalı kapatmak için mayası ve bozulma için Parkin hedefler6, ve USP8 özellikle mitokondri7için translokasyon tanıtmak için K6 bağlantılı Parkin deubiquitinates. Proximity ligasyon Assay (PLA) teknolojisi, protein etkileşimi biyoloji8alanında yeni bir avans olmuştur, tek hücrelerde situ içinde endojen protein etkileşimleri görselleştirme izin, ve az örnek malzeme ile sınırlı değildir. Bu metodoloji özellikle insan islet/Beta hücresi biyolojisi için, örnek mevcudiyeti, heterojen hücre türleri içinde fizyolojik olarak ilgili protein kompleksler anlamak için ihtiyaç ile birleştiğinde için cazip.

PLA yaklaşımı kullanarak, birincil insan pankreatik Beta hücrelerinde ve nöronal hücre hatlarında anahtar endojen mitophagy kompleksleri gözlemlemek edebiliyoruz, ve mitophagy yolu üzerinde bir diyabet hastalığı etkilerini göstermek1. Özetle, bu protokolün kapsamlı hedefi, bol miktarda malzeme bulunmayan dokulardaki belirli mitophagy protein kompleksini analiz etmektir veya konvansiyonel protein etkileşimi çalışmalarının mümkün olmadığı bir yerdir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) muafiyet ve Michigan Üniversitesi IRB politikası ile uyumlu olarak tanımlanabilen donör insan pankreatik adacıklar kullanımı ile. İnsan pankreatik adacıklar NIH/niddk destekli entegre Islet dağıtım programı (IIDP) tarafından sağlandı.

1. insan Islet numune hazırlama

  1. Tek hücreli ayrışma
    1. Kültür insan Islet örnekleri (4000 – 6000 Islet eşdeğerleri/10 ml medya) pankreas Islet medya (PIM (S)) medya 1 mm glutamin (PIM (G)) ile tamamlayıcı 37 °c en az 1 gün için, 100 birimler/ml Antimikotik-antibiyotik, 1 mm sodyum piruvat ve 10% fetal sığır Serum (FBS) veya insan AB serumu.
    2. Kültürden bireysel insan izletlerini saymak için 3x büyütmede diseksiyon ışık mikroskobu kullanın. Çekme 40 adacıklar tedavi başına/durum (örneğin glucolipotoxicity) içine 1,5 ml tüpler içine Islet medya.
    3. 400 x g , 10 °c ' de 1 dak için tortu ile Santrifüjü izlet.
    4. Yıkama örnekleri, oda sıcaklığında tüpler kısa inversiyon tarafından, iki kez 1 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) içeren 50 μM PR619 (bir deubiquitinase inhibitörü; Ubiquitin bağımlı protein etkileşimlerini korumak için), her yıkama arasında santrifüjleme 400 10 °C ' de 1 dakika için x g .
    5. 125 μL (50 μM PR619) içeren tek hücrelere 0,25, prewarmed tripsin (37 °c) ile 3 dakika boyunca Islet PELLETLER ile birlikte dissociate adacıklar. 200 μL pipet kullanılarak periyodik nazik pipetleme ile bu süre zarfında yavaşça dağılın.
    6. 50 μM PR619 içeren 1 ml ısıtılmış (37 °c) PIM (S) medyasını, ardından 1 dakika boyunca 400 x g 'de santrifükleme yaparak tortu hücrelerini yavaşlatın.
    7. 400 x g 'de 1 dakika boyunca santrifüjleme ile hücreleri iki kez, PBS + 50 μM PR619 ile yıkayın.
    8. Son olarak, 50 μM PR619 içeren 150 μL PBS hücrelerinde pelletini hücreleri.
  2. Tek hücreli yapışması ve sabitleme
    1. Resuspension sonra, 10 dakika için 28 x g bir sitosenterge kullanarak buzlu, şarj, mikroskop slaytlar üzerine hücre çözümünü döndürün.
    2. Cytocent, sonra bir hidrofobik kalem ile hücresel alan anahat (bkz: malzeme tablosu) Antibody/PLA çözüm hacimlerini en aza indirmek için gerekli. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBS 'de% 4 civarında formaldehite ile hücreleri düzeltin.
      DIKKAT: PFA tehlikelidir ve dikkatle ele alınmalıdır.
    3. En iyi sonuçları elde etmek için, hemen veya 24 saat içinde boyama/PLA gerçekleştirin. Gerekirse, 4 °C ' de PBS 'de numuneleri 48 h 'den fazla olmayan şekilde boyayın.

2. immünhistokimya

  1. Engelleme
    1. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1x PBS ile hücreleri iki kez yıkayın.
    2. Blok hücre çözümü, arka plan boyama ortadan kaldırmak için,% 10 eşek serumu ile PBS% 0,3 deterjan içeren ( malzeme tablosunabakın) Oda sıcaklığında 1 saat.
  2. Boy -ama
    1. USP8 (1:250) ve NRDP1 (1:250) ' e karşı primer fare veya tavşan antikorları olan hücreleri sırasıyla ( malzeme tablosunabakın) deterjan ile fosfat tamponlu tuz ile seyreltilmiş (PBT, malzeme tablosunabakın), gece 4 °c ' de, PLA üzerinden mitophagy kompleks sinyalizasyon tespit.
    2. Bu yüzden PLA sinyaline müdahale değil fare veya tavşan yükseltilmiş değildi beta hücre tanımlaması için özel bir marker ile hücreleri kokulat. Bu durumda PBT Anti-keçi PDX1 (1:500) ile hücreleri inkübe. Evaporasyonu önlemek için çözümün üstünde plastik film kullanarak, 4 °C ' de bir gecede tüm primer antikorları kuluçat.

3. yakınlık ligasyon tahlil

  1. PLA prob ve karşı leke
    1. PLA prob çözümünü üreticinin talimatlarına göre hazırlayın, örneğin, PBT 'de hem Anti-fare hem de tavşan karşıtı prob çözeltisi 1:5 son konsantrasyonunu hazırlayarak örnek başına 20 μL prob çözeltisi yapın ve odada 20 dakika boyunca kulkayın Sıcaklık.
    2. Gece inkübasyon sonra, bir rocker üzerinde 5 dakika her biri için 1x PBS ile iki kez hücreleri yıkayın.
    3. Prob çözeltisi ile kuluçba hemen önce, 1:600 son konsantrasyonunda Anti-keçi Cy5 ikincil ekleyin (endojen PDX1 tespiti için) prob çözeltisine. Her hücre koşullarına 20 μL prob çözeltisi ekleyin, plastik film ile yavaşça kapın ve 37 °C ' de 1 saat boyunca inküye yapın.
  2. Ligasyon
    1. Hücreleri iki kez yıkayın, oda sıcaklığında, buffer A ile (tarifi için malzeme tablosuna bakın) 5 dk her, bir rocker üzerinde.
    2. Üreticinin talimatlarına göre ligasyon çözümünü hazırlayın (algılama reaktiflerinin bir parçası, malzeme tablosunugörün). Bunun için dietil pyrocarbonate (DEPC)-tedavi edilen suda seyreltilen ligasyon stokları (5x) 1:5. İnkübasyon hemen önce 0,025 U/mL ligaz ekleyin. Hücrelere 20 μL ligasyon çözümü ekleyin. Plastik film ile kapak ve 37 °C ' de 30 dakika boyunca inkübe.
  3. Amplifikasyon
    1. 2 dakika her biri için buffer A ile Oda sıcaklığında iki kez yıkama hücreleri.
    2. Üreticinin talimatlarına göre amplifikasyon çözümü (algılama reaktiflerinin bir parçası, malzeme tablosunu görmek) olun. DEPC-işlenmiş suda seyreltmeli amplifikasyon tamponu (5x) 1:5 ve kullanıma kadar karanlıkta tutun. Ekleme bir 1:80 polimeraz seyreltme (algılama reaktiflerinin bir parçası, bkz: malzeme tablosu) çözüme hemen önce hücrelere çözüm ekleme.
    3. Hücrelere 20 μL amplifikasyon çözümü ekleyin. Maksimum sinyal için 1 saat 40 dk ila 2 saat arasında 37 °C ' de karanlık plastik film ve yer ile kapak.
  4. Görüntüleme hazırlığı
    1. Tampon B ile iki kez yıkama hücreleri (tarifi için malzeme tablosuna bakın) Oda sıcaklığında 10 dakika için, bir rocker üzerinde.
    2. Son olarak, bir rocker üzerinde oda sıcaklığında 2 dakika için 0.01 x tampon B, bir kez hücreleri yıkayın.
    3. Mount örnekleri 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (dapi) içeren montaj ortamı bir damla ekleyerek ve dikkatle örnekleri üzerinde bir neşter bıçak kullanarak herhangi bir kabarcıklar oluşan dışarı basın için bir lamel magazini yerleştirerek. Kenarları şeffaf tırnak cilası kullanarak mühür kapak.
    4. Lazer tarama Konfokal mikroskop veya ters çevrilmiş Floresan Mikroskobu gibi birden fazla odak düzlemini yakalama yeteneğine sahip bir mikroskop üzerinde görüntü örnekleri, en az 9 farklı odak düzlem görüntüleri alarak, deconvolution yetenekleri ile.
      1. Yaklaşık 0,45 mm z yığını yüksekliğiyle 100x büyütme oranındaki görüntüleri yakalayın. 550 nm uyarma, 570 nm Emisyon at yakala PLA; 650 nm uyarma, 670 nm Emisyon at karşı-leke; ve DAPı 405 nm uyarma, 450 nm Emisyon.
    5. Floresan görüntü arka plan sinyalleri ve sokak ışık sağlamak için aşağı aşağı Analizi PLA olayların (özellikle Widefield microscopes), işlem görüntüleri kullanarak iki boyutlu deconvolution (en yakın komşu) algoritması kullanılarak bir Standart görüntü işleme yazılımı tercih.
      Not: Olympus CellSens kullanmak Için, Nikon NIS-Elements kullanın, Leica kullanarak LAS X, Zeiss – ZEN, MetaMorph, MATLAB, Huygens yazılım, yanı sıra birkaç eklentileri Image-J aracılığıyla kullanılabilir. Analiz için, tüm z-yığınları üzerindeki etkileşimlerin toplam sayısı Image-J yazılımı kullanılarak analiz edilmelidir, yalnızca PDX-1 pozitif hücrelerin analiz edilmesini sağlar (Bölüm 3,5).
  5. PLA etkileşimlerini ölçmek
    1. Ücretsiz Image-J yazılım uygulamasını açın ve PLA görüntüsünü açın. İlk keskin odaklama PLA görüntüsünden başlayın.
    2. Resim sekmesini tıklatın ve Ayarla'yı, ardından eşik 'yi (Şekil 1a) seçin. Tüm spesifik olmayan PLA sinyalini kaldırmak için eşik ayarlayın, eşik ayarı not edin ve analiz boyunca tutarlı tutmaya çalışın.
    3. İşlem sekmesini tıklatın ve ikili'i seçin, sonra ikili olun (Şekil 1B). Parçacıkları ölçmek için ikili görüntüyü kullanın, "analizet" sekmesine tıklayıp parçacıkları analiz edin (Şekil 1C).
    4. Çözümleme için ayarların aşağıdaki gibi olduğundan emin olun: Boyut = 0 – Infinity, circularity = 0 – 1.0, göster = anahatlar, görüntüleme sonuçlarıIçin onay kutuları ve sonuçları temizle (Şekil 1D). Tamam'ı tıklatın. Örnek ve z-yığını konumu gösteren bir elektronik tabloda analiz edilen parçacıkların sayısını not alın.
    5. Örnek için tüm odak z-yığınları analiz edilinceye kadar 3.5.2 – 3.5.4 arasındaki adımları yineleyin. Toplam etkileşim sayısını ölçmek için elektronik tablodaki numunenin toplam parçacıklarının sayısını topla.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz MIN6 pankreas beta hücre hattı ve SH-SY5Y Nöroblastom hücre hattı SH-SY5Y, optimize etmek ve hem de antikorların özgüllüğü ve görselleştirilmiş protein etkileşimlerini onaylamak için ilk deneyler gerçekleştirdi. MIN6 hücreler/mL ve 48 h için sığmasını sol, SH-SY5Y hücreleri 30.000 ' de Cover, üzerinde kaplama vardı/mL ve 24 h için sığmasını sol 15.000 Cover, üzerine kaplama edildi. PLA Protokolü sonra yukarıdaki gibi, adım 1.2.3 başlayarak izledi. PLA sinyallerinin özgüllüğünü sağlama...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada kullanmak için basit ve verimli bir yaklaşım açıklamak NRDP1: USP8 PLA dokularda/ilgi hücreleri upstream mitophagy kompleksleri oluşumunu ölçmek için. Daha önce çeşitli metodolojiler tarafından pankreas Beta hücrelerinde CLEC16A-NRDP1-USP8 mitophagy kompleksi oluşumunu teyit, Co-immünoprecipitation deneyler de dahil olmak üzere, hücre-serbest etkileşim çalışmaları, ve in vitro yanı sıra hücre tabanlı mayası, ve nasıl bu kompleks sürücüler mitophagic Flux düzenlendiği gösterilmiştir1,

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar JDRF (CDA-2016-189 ve SRA-2018-539), diyabet ve sindirim ve böbrek hastalıkları Ulusal Enstitüsü, Sağlık Ulusal Enstitüleri (R01-DK-108921), Brehm aile ve Anthony aile finansman desteği kabul eder. S.A.S. yılında JDRF kariyer geliştirme Ödülü, Novo Nordisk Vakfı tarafından desteklenen Danimarka diyabet Akademisi tarafından kısmen desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.25 tripsin-EDTA 1XYaşam Teknolojileri25200-056
Antibiyotik-AntimikotikYaşam Teknolojileri15240-062
Blok çözeltiEv yapımıKullanım 1X PBS,% 10 eşek serumu ve% 0.3 Triton X-100 deterjan ekleyin.
Tampon AEv Yapımı1L yapmak için: 8.8g NaCl, 1.2g Tris bazı, 500ul Tween-20, 750mL ddH20 ile karıştırın. HCl ile pH 7.5'e kadar ve 1L'ye kadar doldurun. Çözeltiyi filtreleyin ve 4 ° C'de saklayın. Deneysel kullanımdan önce RT'ye getirin
Tampon BEv Yapımı1L yapmak için: 5.84g NaCl, 4.24g Tris bazı, 26g Tris-HCl'yi 500mL ddH20 ile karıştırın. pH 7.5'e kadar, ve 1L'ye kadar doldurun. Çözeltiyi filtreleyin ve bir 4C saklayın. Deneysel kullanımdan önce RT'ye getirin
Cy5 konjuge AffiniPure eşek anti-keçiJackson Labs705-175-147
Tespit Reaktifleri KırmızıSigma- AldrichDU092008-100RXNKiti şunları içerir: ligasyon çözeltisi stoğu (5X), ligaz, amplifikasyon çözeltisi stoğu (5X) ve polimeraz.
DuoLink PLA probu anti-fare EKSİSigma- AldrichDU092004-100RXN
DuoLink PLA probu anti-tavşan ARTISigma- AldrichDU092002-100RXN
Fetal sığır serumu
Keçi poliklonal anti-PDX1 (klon A17)Santa CruzSC-14664RRID: AB_2162373
HEPES (1M)Yaşam Teknolojileri15630-080
MIN6 pankreas hücre hattıD. Stoffers'tanHediye Fare insülinoma hücre hattı, hücre bazlı tahliller için kullanılır.
Fare monoklonal anti-USP8 antikoru (klon US872)Sigma- AldrichSAB200527
Pap-penAraştırma Ürünleri Uluslararası195505
ParafilmKüçük çözelti hacimleri kullanırken buharlaşmayı önlemek için hücrelerinizdeki antikor ve prob çözeltilerini kapatmak için kullanın.
PBT (tritonlu fosfat tamponlu salin)Ev yapımı50 mL yapmak için: 43.5mLddH2O, 5 mL 10X PBS, 0.5 mL 10X BSA (100mg / mL çözelti), ddH20'de 1 mL% 10 triton X-100 çözeltisi)
Penisilin-Streptomisin (100X)Yaşam Teknolojileri15140-122
Fosfat tamponlu salin, 10XFisher ScientificBP399-20
PIM (ABS) İnsan AB serumuProdo LabsPIM-ABS001GMP
PIM (G) (glutamin)Prodo LabsPIM-G001GMP
PIM (S) ortamıProdo LabsPIM-S001GMP
PR619Apex BioA812
Life Technologies (Moleküler Problar)ile Altın antifade reaktifini uzatınP36935
Tavşan poliklonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1)Bethyl LaboratoriesA300-049ARRID: AB_2181251
SH-SY5Y hücresiL. Saten'denİnsan nöroblastom hücre hattı, hücre bazlı tahliller için kullanılır.
Sodyum Piruvat (100X)Yaşam Teknolojileri11360-070
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
Tween-20Fisher ScientificBP337-100
RNA çalışması için su (DEPC suyu)Fisher ScientificBP361-1L
DAPI hediye

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
  2. Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
  3. Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: Maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. (0), (2015).
  4. Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. Regulation by mitophagy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 53, 147-150 (2014).
  5. Soleimanpour, S. A., et al. Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells. Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).
  6. Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).
  7. Durcan, T. M., et al. USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin. The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).
  8. Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction. PLoS ONE. 10 (6), e0128701(2015).
  9. Silva Xavier, D. a, G, The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54(2018).
  10. Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
  11. Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334(2006).
  12. Brissova, M., et al. Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
  13. Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis. Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).
  14. Poitout, V., et al. Glucolipotoxicity of the pancreatic beta cell. Biochimica Biophysica Acta. 1801 (3), 289-298 (2010).
  15. Pearson, G., Soleimanpour, S. A. A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells. Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).
  16. Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
  17. DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
  18. Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type–specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
  19. Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of β cells. Nature Communications. 7, 11756(2016).
  20. Dorrell, C., et al. Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers. Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).
  21. Jayaraman, S. A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols. Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).
  22. Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human ß-Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
  23. Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
  24. Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -E. No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. , (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

NRDP1 USP8 Etkile imiPDX1 Kar BoyamaAdac k H cresi zolasyonuCytospin FiksasyonuImageJ Partik l AnaliziMitofaji KantifikasyonuDiyabet Ara t rmalar

İlgili makaleler