Yöntem makalesi

Sağlam dokulara ve standart nicel Western Blot kullanarak geliştirme boyunca Protein düzeylerinin karşılaştırılması

DOI:

10.3791/59438

⸱

9 Nisan 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Discovery Brain Sciences, University of Edinburgh, 2Euan MacDonald Centre for Motor Neurone Disease Research, University of Edinburgh

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntem protein düzeyleri farklı dokular ve standartlaştırılmış bir nicel Batı blotting yaklaşım kullanarak farklı gelişim timepoints karşılaştırılması için sağlam ve tekrarlanabilir bir yaklaşım açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Western Blot algılamak ve protein ifade ölçmek için kullanılan bir tekniktir. Yıllar içinde bu teknik temel ve klinik araştırmalarda birçok gelişmeler yol açmıştır. Ancak, birçok benzer deneysel teknikleri olduğu gibi Western blot analizleri sonucu kolayca tasarım ve deney yürütülmesi açısından yapılan seçimler etkilenmiştir. Belirli temizlik proteinler protein düzeyleri için miktar normalleştirmek için geleneksel olarak kullanılmıştır, ancak, bu sınırlamalar bir dizi var ve bu nedenle giderek son birkaç yıl içinde eleştirdi. Burada, biz bize farklı doku, fare modelleri (Hastalık modelleri de dahil olmak üzere) ve gelişimsel timepoints arasında protein ifade varyasyon karmaşık karşılaştırmalar üstlenmek izin vermek için hazırladığımız detaylı bir iletişim kuralı tanımlamak. Bir floresan toplam protein leke kullanarak ve bir iç yükleme standart kullanımı tanıtımı, deneyler içinde karşılaştırılabilir ve sistematik olarak protein düzeyleri arasında karşılaştırma örnekleri sayısı, varolan kısıtlamaları üstesinden gelmek mümkündür bir deneysel koşullar dizi. Bu yaklaşım böylece araştırmacılar protein ifade farklı doku ve örnekleri arasında daha iyi keşfetmek izin veren geleneksel Batı leke tekniklerin kullanılması genişletir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Western Blot algılamak ve doku homogenates veya özleri içeren protein ifadeler ölçmek için kullanılan bir tekniktir. Yıllar içinde bu teknik temel ve klinik araştırmalarda birçok gelişmeler bu bir tanı aracı hastalık1,2varlığı tanımlamak için kullanıldığı yerler yol açmıştır. Western Blot ilk 1979 yılında proteinler polyacrylamide jeller nitroselüloz sayfalara aktarmak ve daha sonra proteinler radioactively etiketli ya da floresein için Birleşik ikincil antikorlar kullanarak görselleştirmek için bir yöntem olarak tanımlanmıştır veya peroksidaz3. Piyasada kitleri ve ekipman geliştirilmes....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yordam için doku Edinburgh Üniversitesi, iç Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve uyum ile kurumsal ve İngiltere İçişleri Bakanlığı yönetmeliklerine yetkisi altında ilgili gerçekleştirilen hayvan çalışmaları elde Kişisel ve proje lisansları.

Not: Bu protokol tekrarlanabilirlik artırmak için standart, piyasada kitleri ve reaktifler kullanarak optimize edilmiştir ( Tablo malzemelerigörmek).

1. hazırlanması örnekleri

  1. Protein çıkarma
    1. Transfer ek donmuş hücre veya doku örnekleri-80 ° c kuru buz, çözülme buzda ve yıkama buz soğuk 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TPS ve dahili bir standart doku ve zaman puan arasında karşılaştırmalar protein düzeyleri kolaylaştırmak için kullanımı örnekleri içerir. Şekil 1 yenidoğan (doğum sonrası 5 gün) Yetişkin fareler (10 - haftalık) ile karşılaştırıldığında elde edilen dokular çıkarılan protein Western Blot sonuçları gösterir. TPS ve Smn immunoblot şekil 1A', Cgösterilir. TPS floresan yoğunluğu miktar floresan yoğunluğu her Lane'de di.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uygun deneysel tasarım, kontrol tedbirleri ve istatistiksel analizi ile western Blot protein ifade içinde ve biyolojik örnekleri çeşitli bir dizi arasında güvenilir kantitatif tahminler yapmak için kullanılabilir. Biz mevcut el yazması tarif Protokolü Floresans tabanlı bir birleşimini kullanarak daha büyük ve daha karmaşık örnekleri, gruplarında kantitatif analiz üstlenmeyi kurutma Western kullanmak isteyen araştırmacılar için bir kılavuz olarak hizmet amaçlamaktadır algılama yöntemleri, toplam protein yükleme normalleşt.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa etmek rakip hiçbir ilgi alanlarına sahip.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

E.J.N.G. Wellcome Trust (grant 106098/Z/14/Z) tarafından desteklenir. Diğer finansman SMA Trust (SMA İngiltere'de konsorsiyum; tarafından sağlanmıştır T.H.G. & Y-T. H.), SMA Avrupa (T.H.G, D.v.D.H. ve E.J.N.G.), University of Edinburgh DTP hassas Tıp (T.H.G., L.L. ve A.M.M.) ve Euan MacDonald Merkezi Motor nöron hastalığı Araştırma (T.H.G).

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
İnce Uçlu Jel Yükleme UçlarıAlpha LaboratoriesGL20057SNTL
Halt Proteaz İnhibitörü Kokteyli, EDTA içermeyen 100x 5mLThermoFisher Scientific78437
El Tipi Homojenizatör VWR Collection431-0100
iBlot 2 Jel Transfer CihazıThermoFisher ScientificIB21001
iBlot Transfer Yığını, PVDF, normal boyThermoFisher ScientificIB401031
Image Studio LiteLicorN/Aantikorlarından ücretsiz indirme
Likor-Primer antikorun konağına karşı spesifik olan uygun ikincil antikoru seçin.
Mikro BCA Protein Test KitiThermoFisher Scientific23235
Novex Sharp Önceden Boyanmış Protein StandardıThermoFisher ScientificLC5800
NuPAGE %4-12 Bis-Tris Protein Jelleri, 1.0 mm, 15 oyukluThermoFisher ScientificNP0323BOX
NuPAGE LDS Numune Tamponu (4X)ThermoFisher ScientificNP0007
NuPAGE MOPS SDS Koşu Tampon (20X)ThermoFisher ScientificNP0001
Odyssey Bloke Edici TamponLicor927-40000
Saflaştırılmış Fare anti-SMN (survival motor nöron) monoklonal antikoruBD Transdüksiyon Laboratuvarları610646SMN/SMA literatüründe yaygın olarak kullanılır ve lot numarasına bakılmaksızın tutarlı sonuçlar verir
REVERT Toplam Protein Boyası, 250 mL Licor926-11021 
REVERT Yıkama Solüsyonu Licor926-11012 
RIPA Lizis ve Ekstraksiyon TamponuThermoFisher Scientific89900
XCell  SureLock Mini HücreliThermoFisher ScientificEI0001
https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/ IRDye 800CW ikincil

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bertoni, T. A., Perenha-Viana, M. C., Patussi, E. V., Cardoso, R. F., Svidzinski, T. I. Western blotting is an efficient tool for differential diagnosis of paracoccidioidomycosis and pulmonary tuberculosis. Clinical and Vaccine Immunology. 19 (11), 1887-1888 (2012).
  2. Hutchinson, A. B., et al.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Protein Ekspresyon AnaliziFloresan Toplam Protein Boyamasnternal Y kleme StandardProtein NormalizasyonuDoku Proteini Kar la t rmasGeli imsel Zaman NoktalarProtein Konsantrasyon l mJel ElektroforeziWestern Blot Transferi

İlgili makaleler