Fizyolojik açıdan, propil reseptörleri buharı aşamasında inhale propil moleküller tarafından etkinleştirilir. Ancak, en tüp bebek sistemleri sıvı faz propil stimülasyon yararlanmak. Burada, propil reseptör etkinleştirme propil stimülasyon buharı faz üzerine gerçek zamanlı tüp bebek izleme sağlayan bir yöntem mevcut.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Gerçek zamanlı olarak buharı aşamasında propil reseptör etkinleştirme bir propil tarafından in Vitro izlenmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Koku algı odorants etkileşim propil reseptörleri ile başlar (veya) koku duyusal sinir hücreleri tarafından (OSN) dile getirdi. Koku tanıma nerede bir OR odorants bir dizi ile etkinleştirilebilir ve bir propil ORs bir arada etkinleştirebilirsiniz bir birleşimsel kodlama düzeni izler. Böyle Kombinatorik kodlama aracılığıyla, organizmalar algılayabilir ve sayısız uçucu koku molekülleri arasında ayırımcılık. Böylece, belirli bir konsantrasyon, bir koku ORs, tarafından bir harekete geçirmek desen her koku için belirli olan tanımlanabilir. Bu anlamda, koku gerektirir anlayış propil algıladıkları için beyin kullandığı düzeneklerini çatlama-OR etkileşimleri. Bu yüzden koku alma toplum "Bu reseptörleri de-orphanize için" taahhüt eder. Propil tanımlamak için kullanılan geleneksel tüp bebek sistemleri- veya etkileşimler ORs ile etkileşim daha önce doğal algılama kokuları buharı odorants dağılması ile burun mukozası içine sorumluluk alanlarından olan hücre ortamla kuluçka propil, kullanılan. Burada, OR etkinleştirme buharı fazlı odorants üzerinden gerçek zamanlı izlenmesi için izin yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Bizim yöntem Glosensor tahlil kullanarak ışıldama tarafından kamp yayın ölçme üzerinde dayanır. İçinde vivo ve tüp bebek yaklaşımlar arasındaki geçerli boşlukları arasında köprü görevi gören ve bir biomimetic uçucu kimyasal duyumsal için bir temel sağlar.
Giriş
Koku alma duygusu karasal hayvanlar uçucu kimyasal çevreleri sürücü davranışları ve duyguları ile etkileşimine izin verir. Temelde, koku alma sistemi, propil reseptörleri (ORs)1düzeyinde ilk etkileşim propil moleküllerin koku Algılama işlemi başlar. Memelilerde, ORs tek tek koku epitel2' de yer alan koku duyusal nöronlar (OSNs) ifade edilir. Ait oldukları G-protein birleştiğinde reseptör (GPCR) ailesi ve daha doğrusu rhodopsin benzeri alt aile (sınıf A olarak da bilinir). ORs çift kimin harekete geçirmek ardından döngüsel nükleotit geçişli kanal açılması ve aksiyon potansiyelleri nesil kamp üretim yol açan uyarıcı G prot....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Hana3A kültür hücreleri
- M10 hazırlayın (en az önemli orta (MEM) artı % 10 v/v fetal sığır serum (FBS)) ve M10PSF (M10 artı 100 µg/mL penisilin-streptomisin ve 1,25 µg/mL Amfoterisin B).
- M10PSF 100 mm hücre kültür bulaşık kuluçka 37 ° C ve % 5 karbon dioksit (CO2) ayarla içinde içinde 10 mL hücrelerde kültür.
- 2 günde % 20 oranında Hücreleri Böl: % 100 izdiham hücre (yaklaşık 1.1 x 107 hücreleri) faz kontrast mikroskop altında gözlenen zaman medya aspire ve fosfat tamponlu tuz (PBS) 10 mL yavaşça hücrelerle yıkayın.
- PBS Aspire edin ve 3 mL % 0.05 tripsin-etilen diamin tetraacetic asit (EDTA, 0,48 mM) ekley....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Yanıt üç fare ORs, Olfr746, Olfr124 ve Olfr1093 ekranlı cinnamaldehyde buharı stimülasyon (şekil 3) kullanarak. Aynı anda, biz test ORs propil kaynaklı faaliyetlerinin belirli sağlamak için bir boş vektör kontrolü (Rho-PCI) kullanılan (şekil 3A). ORs buharı propil uyarıcı üzerine gerçek zamanlı etkinleştirme izlenen 20'den fazla ölçüm devir oldu. Her veri de ilk boş vektör kontrolü ortalama değerine her çevriminde (şekil 3
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Koku algı temelde ORs etkinleştirme üzerinde bağlıdır. Sonuç olarak, anlayış işlevleriyle beyin kullanın uçucu kimyasal çevresine algıladıkları için karmaşık mekanizmaları çatlamak için gereklidir. Ancak, bu işlem anlayış tarafından OR repertuar odorants tüp bebek. karşı işlevsellik için ekran için sağlam bir yöntem oluşturulmasında zorluklar engel Hücre ORs yüzey ve kapaklı ifade kısmen çözüldü etiketli reseptörleri13,19 oluşturulması ve keşif ve optimi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Y.F., H. K ve H.M. bir patent başvurusu 27 Ekim 2016 bu iş ile ilgili eğe.
Teşekkürler
Bu eser NIH (DC014423 ve DC016224) ve savunma ileri araştırma ajansı RealNose projesi hibe tarafından desteklenmiştir. YF JSP'ler Program stratejik Uluslararası ağlar, yetenekli araştırmacıların dolaşımı (R2801) hızlandırmak ilerlemek için mali desteği ile Duke Üniversitesi'nde kaldı. Sahar Kaleem yazması düzenleme için teşekkür ediyoruz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| % 0.05 tripsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | 0.05 Tripsin - EDTA (1x), fenol kırmızısı - 4 ° C'de saklayın; C |
| 100 mm hücre kültürü kabı | BD Falcon | 353003 | 100 mm x 20 mm hücre kültürü kabı |
| 15 mL tüp | BD Falcon | 352099 | 17 mm x 120 mm konik borular |
| 96 oyuklu plaka | Corning | 3843 | 96 kuyulu, LE kapaklı beyaz şeffaf dipli Poli-D-lizin kaplı Poli-D-lizin kaplı Polistiren |
| Amfoterisin | Gibco | 15290-018 | Amfoterisin B 250 ve mikro; g/mL - 4 &°C'de saklayın; C |
| santrifüj makinesi | Jouan | C312 | için sallanan kova rotorlu santrifüj makinesi |
| NUAIRE | NU-407-500 | hücre kültürü için davlumbaz | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | Fetal Sığır Serumu - -20 ° C'de saklayın; C |
| GloSensor cAMP Reaktifi | Promega | E1290 | GloSensor cAMP Reaktifi ışıldayan protein substratı - -20 ° C'de saklayın; C |
| Kuluçka Makinesi 37 & derece; C; % 5 CO2< / sub> | Fisher Scientific | 11-676-604 | Hücre kültürü için inkübatör |
| Lipofectamine 2000 reaktifi | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 Reaktif 1mg / ml transfeksiyon reaktifi - 4 ° C'de saklayın; C |
| Luminometre POLARstar OPTIMA | BMG LABTECH, | lüminesans için 96 kuyulu plaka okuyucuyu | durdurdu |
| Mineral yağ | Sigma | M8410 | Koku vericiler için çözücü - oda sıcaklığında saklayın |
| Minimum Temel Orta (MEM) | Corning cellgro | 10-010-CV | Minimum Esansiyel Orta Eagle with Earle' S Tuzları & L-glutamin - 4 ° C'de saklayın; C |
| Penisilin / Streptomisin | Sigma Aldrich | P4333 | 10.000 U penisilin ve 10 mg streptomisin ile stabilize edilmiş Penisilin-Streptomisin çözeltisi - -20 ° C'de saklayın; C |
| pGlosensor | Promega | E2301 | pGloSensor-22F cAMP ışıldayan protein plazmidi - 4 ° C'de saklayın; C |
| Fazı kontrast mikroskobu | Leica | 090-131.001 | x4, x10, x20 objektifli faz kontrast mikroskobu |
| RTP1S | H. Matsunami | lab-100 ng/&mikro; L plazmid - 4 derecede saklayın > Ç |
Kaynaklar
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Serizawa, S., Miyamichi, K., Sakano, H. One neuron-one receptor rule in the mouse olfactory system. Trends in Gene....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
