Drosophila doku homojenlerinde bozulmamış mitokondriyal kütlenin nicelleştirilmesi için sitrat sintaz aktivitesinin kolorimetrik testi için bir protokol sönmesin.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Drosophila Melanogaster'de Sitrat Synthase Aktivitesinin Kolorimetrik Tsöplini
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Mitokondri oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP üreterek ve çeşitli fizyolojik süreçleri düzenleyerek hücresel metabolizmada en önemli rolleri oynar. Mitokondriyal disfonksiyon metabolik ve nörodejeneratif hastalıkların bir dizi birincil nedenidir. Bozulmamış mitokondri onların düzgün çalışması için kritik öneme sahiptir. Enzim sitrat sintaz mitokondriyal matriks lokalize ve böylece bozulmamış mitokondriyal kitlenin bir nicel enzim belirteci olarak kullanılabilir. Mitokondri önemli işlevleri olan birçok molekül ve yollar son derece insanlar ve Drosophilaarasında korunmuş olduğu göz önüne alındığında , ve güçlü genetik araçlar bir dizi Drosophilamevcuttur , Drosophila mitokondriyal fonksiyonu incelemek için iyi bir model sistemi olarak hizmet vermektedir. Burada, mitokondriyi izole etmeden yetişkin sineklerinden homojen dokudaki sitrat sintaz aktivitesinin hızlı ve basit ölçümü için bir protokol sıyoruz. Bu protokol aynı zamanda larvalar, kültürlü hücreler ve memeli dokularında sitrat synthase aktivitesini ölçmek için de uygundur.
Giriş
Mitokondri en iyi enerji para birimi, ATP, trikarboksilik asit döngüsü (yani, Krebs döngüsü) ve oksidatif fosforilasyon yoluyla üretmek çoğu ökaryotik organizmalar, güç üreten organeller olarak bilinir. Mitokondri de apoptoz1düzenlenmesi gibi diğer fizyolojik süreçlerin bir çok önemli rol oynadığı bulunmuştur, Ca2 + homeostazı2,3, reaktif oksidasyon türleri (ROS) nesil4, ve endoplazmik retikulum (ER)-stres yanıtı5. Mitokondriyal disfonksiyon herhangi bir yaşta vücutta herhangi bir organı etkileyebilir ve metabolik birincil nedenidir, yaşlanma ile ilgili6, ve nörodejeneratif hastalıklar7. Bozulmamış mitokondri mekanistik mitokondriyal fonksiyon ile ilgilidir. Bu nedenle, bozulmamış mitokondriyal kütlenin doğru nicelleştirilmesi mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesi için çok önemlidir8. Sitrat synthase, trikarboksilik asit döngüsünün ilk adımda bir oran sınırlayıcı enzim9, ökaryotik hücreler içinde mitokondriyal matris lokalize, ve böylece bozulmamış mitokondriyal kitle nin varlığı için bir nicel belirteç olarak kullanılabilir9,10. Sitrat sintaz aktivitesi de bozulmamış mitokondriyal proteinler için bir normalleşme faktörü olarak kullanılabilir11,12.
Meyve sinek, Drosophila melanogaster, mitokondriyal fonksiyon eğitimi için mükemmel bir model sistemidir, mitokondri de önemli roller oynayan birçok molekül ve yollar evrimsel olarak Insanlara Drosophila korunur13,14,15. Burada, Drosophila dokusunda kolorimetrik bir test ile sitrat synthase aktivitesinin ölçülmesi için hızlı ve basit bir yöntem için bir protokol savuruyoruz16 iyi plaka biçiminde homojen. Sitrat synthase aktivite sintaz, Drosophila doku homojenate sitrat synthase asetil koenzim A ile oksaloasetat reaksiyonu katalizler (asetil CoA) sitrat CoA-SH ve H+oluşturmak için . CoA-SH daha sonra 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoik asit) (DTNB) ile reaksiyona girarak 412 nm'de spektrofotometrik olarak kolayca ölçülebilen renkli bir ürün olan 2-nitro-5-tiobenzoat (TNB) üretir. Sitrat synthase aktivitesi renk üretim hızı ile yansıtılabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. D. melanogasteriçin Kolorimetrik Sitrat Synthase Aktivite Teşbesi16
- Her örnek için on yetişkin sinek toplayın. Her genotip için en az üçe trilikat örnekleri toplayın.
- Her numune için 1,5 mL test tüpünde 20 mM HEPES (pH = 7,2), 1 mM EDTA ve %0,1 triton X-100 içeren 500 μL buz gibi ekstraksiyon tamponu hazırlayın.
- Anestezi pedüzerinde CO2 ile yetişkin sinekler anestezi ve istenilen dokuları izole. Yetişkin sinek toraksları izole etmek için, örneğin, forseps bir çift tarafından sinek toraks düzeltmek ve sonra bir makas kullanarak toraks ve karın sınırı boyunca keserek sinek karın izole. Kas sitrat synthase aktivite analizi için sinek toraks toplamak.
NOT: Sitrat synthase aktivitesini normalleştirmek için kullanıyorsanız, bu adımda dokunun taze ağırlığını belirleyin. - 10 yetişkin sinek tothoraxes 100 μL buz gibi ekstraksiyon tampon hemen ve buz üzerinde bir havaneli ile homojenize aktarın. Örnekleri buz gibi tutmak için, örnekleri buz üzerinde 5-10 s homojenize edin, sonra numuneleri 5 s buzüzerinde bekletin ve tüpteki tüm dokular tamamen homojenleşene kadar tekrarlayın.
NOT: Tüpü bantlayın, homojenlerde pıhtı olmadığından ve tüpteki dokuların tamamen homojenleştirilip homojenleştirilip kontrol edin. Tüm numune tedavileri buz üzerinde yapılmalıdır. - Protein içeriği ölçümü için yeni bir tüpte her homojen örnek10 μL alın. Protein ölçümü için numuneleri buzüzerinde saklayın.
NOT: Protein örnekleri daha sonra analiz için -80 °C'de dondurulabilir ve saklanabilir. Protein konsantrasyonları sitrat sintaz aktivitelerinin normalleştirilmesi için bir iç parametre görevi gösterir. - Toplam hacmi 500 μL yapmak için kalan her numuneye 400 μL buz gibi çıkarma tamponu ekleyin. Her reaksiyon için, taze hazırlanmış reaksiyon çözeltisinin 150 μL'sine (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.1 mM DTNB, 0.3 mM asetil CoA, 1 mM oksoasetik asit) seyreltilmiş hücre listatını ekleyin. Kabarcık oluşumunu önleyerek, hafifçe boru lama ile iyice ve hemen karıştırın. Emiciliği 25 °C'de 4 dk için her 10-30 s'de 412 nm'de, minimum 10 s aralıklarla 412 nm'de ölçüm yapabilen bir plaka okuyucu suvedi.
NOT: Farklı bir reaktifi pipetlemeden önce ucu değiştirin ve kuyularda kabarcıklar oluşmasını önleyebilirsiniz. Reaktiflerin eksik karıştırılması ölçümlerde farklılıklara neden olabilir. Sitrat synthase aktivitesi testi, numuneler toplandıktan hemen sonra oda sıcaklığında yapılmalıdır, çünkü bu test bozulmamış mitokondriyal kütleyi ölçmek için kullanılır. Reaksiyon arabelleği kullanımdan hemen önce hazırlanmalı ve depolanmamalıdır. - Verileri optik yoğunluk (OD) emicilik (abs) (Y ekseni) ile zaman (dakika içinde) (X ekseni) olarak çizin. Daha sonra eğrinin doğrusal kısmının eğimini hesaplayın, reaksiyon oranı
Sitrat synthase aktivitesini normalleştirmek için değeri örnek protein konsantrasyonuna bölün. Sitrat synthase etkinliği,
NOT: Örnek protein konsantrasyonu bir protein konsantrasyonu test kiti ile ölçülebilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 1, farklı genotiplerin Drosophila toraks dokusu homojenatlarını ölçmek için sitrat sintaz aktivitesi kolorimetrik töz kullanılarak elde edilen 412 nm'de OD absorbansı için kinetik eğrilerin bir örneğini sunar. PGC-1α'nın mitokondriyal biyogenezin ana düzenleyicisi olduğu bilinmektedir. PGC-1α, Drosophila ve insanlar arasında fonksiyonel olarak korunur. Drosophila RNF34 (dRNF34) Drosophila PGC-1α, dPGC-1 için bir E3 ub...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bir model olarak Drosophila kullanarak Metabolik çalışmalar dikkate genetik arka plan, diyet almak gerekir, ve sineklerin stok bakım18. Farklı genetik arka planların sitrat sintaz aktivitesinin ölçümü üzerindeki etkilerini önlemek için, Drosophila'nın farklı suşları 10 nesil boyunca kontrol etütlerine geri geçilmelidir. Deneylerimizde kullanılan tüm Drosophila suşlarının genetik arka planı w1118'dir,bu yüzden w1118'i kontrol olara...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar çıkar çatışması beyan etmezler.
Teşekkürler
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31401013 ve 31471010), Şangay Belediyesi Bilim ve Teknoloji Komisyonu, Şangay Pujiang Programı (14PJ1405900) ve Doğa Bilimleri Vakfı hibe tarafından desteklenmiştir Şangay (19ZR1446400).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 2- [4- (2-Hidroksietil) -1-piperazinil] etansülfonik asit (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-Amino-2- (hidroksimetil) -1,3-propandiol (TRIZMA Bazı) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| Asetil-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Ditio-bis-nitrobenzoik asit (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oksaloasetat | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Pelet havaneli | Sangon | F619072 | |
| Pelet havaneli motoru | Tiangen | OSE-Y10 | |
| Plaka okuyucu | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Test kiti | Beyotime | P0010S | |
| Makas | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
Kaynaklar
- Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans. Cell. 157 (4), 897-909 (2014).
- Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (4), 1453-1466 (2015).
- Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).
- Hekimi, S., Wang, Y., Noe, A. Mitochondrial ROS and the Effectors of the Intrinsic Apoptotic Pathway in Aging Cells: The Discerning Killers! Frontiers in Genetics. 7, 161(2016).
- Kim, H. E., et al. Lipid Biosynthesis Coordinates a Mitochondrial-to-Cytosolic Stress Response. Cell. 166 (6), 1539-1552 (2016).
- Wang, Y., Hekimi, S. Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot. Science. 350 (6265), 1204-1207 (2015).
- Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson's model. Cell Death & Disease. 5, e984(2014).
- Tronstad, K. J., et al. Regulation and quantification of cellular mitochondrial morphology and content. Current Pharmaceutical Design. 20 (35), 5634-5652 (2014).
- Wiegand, G., Remington, S. J. Citrate synthase: structure, control, and mechanism. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).
- Lopez-Lluch, G., et al. Calorie restriction induces mitochondrial biogenesis and bioenergetic efficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (6), 1768-1773 (2006).
- MacInnis, M. J., et al. Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work. Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).
- Gillen, J. B., et al. Twelve Weeks of Sprint Interval Training Improves Indices of Cardiometabolic Health Similar to Traditional Endurance Training despite a Five-Fold Lower Exercise Volume and Time Commitment. PLoS One. 11 (4), e0154075(2016).
- Mukherjee, S., Basar, M. A., Davis, C., Duttaroy, A. Emerging functional similarities and divergences between Drosophila Spargel/dPGC-1 and mammalian PGC-1 protein. Frontiers in Genetics. 5, 216(2014).
- Mukherjee, S., Duttaroy, A. Spargel/dPGC-1 is a new downstream effector in the insulin-TOR signaling pathway in Drosophila. Genetics. 195 (2), 433-441 (2013).
- Diop, S. B., et al. PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase. Cell Reports. 10 (9), 1572-1584 (2015).
- Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).
- Wei, P., et al. RNF34 modulates the mitochondrial biogenesis and exercise capacity in muscle and lipid metabolism through ubiquitination of PGC-1 in Drosophila. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50 (10), 1038-1046 (2018).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Bosco, G., et al. Effects of oxygen concentration and pressure on Drosophila melanogaster: oxidative stress, mitochondrial activity, and survivorship. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 88 (4), 222-234 (2015).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
