Yöntem makalesi

Silah kalıntılarının varsayımsal tespiti için yeni bir bakteriyel biyosensörün hazırlanması ve uygulanması

DOI:

10.3791/59471

⸱

9 Mayıs 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological and Environmental Sciences, Longwood University, 2Department of Chemistry and Physics, Longwood University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir protokol, silah kalıntıları analizi için bir dizi bakteriyel biyosensör sentezlemek ve floresan spektroskopisi kullanılarak amaçlanan kullanım için cihazların çalışmasını sınamak için sentetik biyoloji teknikleri kullanılarak sunulmuştur.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microbocop adli Kimya benzersiz bir uygulama için tasarlanmış bir biyosensör olduğunu. MicRoboCop, birlikte kullanıldığında, üç anahtar analitinin (antimon, Lead ve organik bileşenleri) varlığında floresan sinyali üreterek silah kalıntılarının (GSR) varlığını belirtebilmekte olan üç cihazdan oluşan bir sistemdir. Protokol, Escherichia coli (E. coli) kullanarak biyosensörlerin sentezini ve sensörlerin seçicilik ve hassasiyetini değerlendirmek için kullanılan analitik kimya yöntemlerini açıklar. Sistemin işleyişi, harcanan bir kartuş muhafazanın içinden toplanan GSR kullanılarak gösterilmiştir. Hazırlanmış bir kez, biyosensörler gerekli kadar depolanabilir ve bu anahtar analitler için bir test olarak kullanılabilir. Üç analitlerden olumlu bir yanıt, GSR için bir tahmin pozitif test sağlar, her bir cihaz diğer örneklerde analitler (örneğin, içme suyunda kurşun kontaminasyonu için bir dedektör) tespit etmek için uygulamalar vardır. Sistemin ana sınırlaması pozitif bir sinyal için gereken zamandır; gelecekteki çalışmalar, yanıt süresini optimize etmek için farklı organizmaların incelenmesi gerektirebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir biyosensör, bir kimyasal maddenin veya analitin tespiti için kullanılabilecek bir yanıt üreten biyolojik bileşenleri (proteinler, nüklemik asitler veya bütün organizmalar gibi) kullanan herhangi bir analitik cihazdır. Örnek olarak, kömür madencilik endüstrisi, zehirli maden gazlarının varlığını algılamak için 20. yüzyılın çoğunu bir biyosensör kullandı: kömür madeninde kanarya1. Biyoloji organizmanın (Kanarya 's) bir kimyasal analizine (karbon monoksit) yanıt (ölüm veya sıkıntı) işçiler korumak için madenciler tarafından gözlendi. Daha modern ve sofistike bir örnekte, bakterilerin bir floresan proteinin ifadesi gibi belirli bir yanıtı sergileme yoluyla belirli bir kimyasal analitin varlığına yanıt vermek için sentetik biyoloji teknikleri kullanılarak değiştirilebilir.

Sentetik biyoloji, doğal olarak mevcut olmayan biyolojik cihazların ve sistemlerin inşası veya belirli bir amaç için mevcut biyolojik sistemlerin yeniden tasarımı anlamına gelen geniş bir terimdir2. Sentetik biyoloji, standart bir metodoloji ve cihazlar ve sistemlersentezlemek için kullanılabilecek standartlaştırılmış parçaların (Standart Sentetik Biyoloji Genetik elemanları) varlığı ile genetik mühendisliğinden ayrılır. Bir cihazıngenomuna, bir bakteri gibi bir organizmaya, fonksiyonun bir göstergesi olarak hizmet edecek belirli bir özelliği ifade etmek için bir parça tanıtılmaktadır. Örneğin, birçok sentetik cihazlarda, bir floresan proteinin ifadesi bir muhabir protein olarak tek bir hücreli organizmaya tanıtıldı. Birden çok aygıt bir sistemebirleştirilebilir. Bakteriler gibi mikroorganizmaların genomlar bu şekilde manipüle etmek kolaydır. Literatürde son on yıl içinde çok çeşitli kimyasal analitlere özgü biyosensörlerin çok sayıda örneği bildirilmiştir3,4.

Bu çalışmayla microbocop sistemi, adli ve çevresel kimyanın yeni uygulamaları ile sentetik biyoloji teknikleri kullanılarak tasarlanan bir biyosensör örneği olarak sunulmuştur. MicRoboCop üç ayrı cihazların bir sistemdir, kombine, Escherichia coli kırmızı floresan protein (RFP) bir kişinin elleriyle veya bir yüzey toplanan silah kalıntı (GSR) varlığında ifade izin verecektir. Üç cihazın her biri, GSR5' in bir bileşeni olarak bilinen belirli bir kimyasal analit yanıt verir. Sistemin yanıt verdiği üç analitik, I. 2, 4, 6-Trinitrotoluen (TNT) ve ilgili bileşikler, II. (kurşun iyonlarının şeklinde) ve III. antimon (Ayrıca iyonlarının şeklinde).

GSR birçok farklı kimyasal madde içerir, ancak üç genellikle GSR olarak bir kalıntı tanımlamak için kullanılan Baryum, kurşun, ve antimon5. GSR tanımlaması için standart kanıt testi, enerji Dispersif X-ışını floresans (EDX)5ile Tarama elektron MIKROSKOBU (SEM) kullanmaktır. SEM-EDX, analistlerin benzersiz morfolojisi ve GSR 'nin Elemental bileşenlerini tanımlamasına olanak tanır. Şu anda, mevcut birkaç yaygın kullanılan ikili varsayımsal testler vardır. Son zamanlarda yayımlanan bir varsayım testi birçok Labs6mevcut olmayabilir özel ekipman iyon-mobilite spektroskopisi (IMS) kullanır. Genellikle mesafe belirlenmesi için veya mermi delikleri ve yaralar5GSR kimlik için kullanılan olsa da, kullanılabilecek bir kaç renk "Spot" testler vardır. Ayrıca, bu potansiyel alan taşınabilir olma avantajı vardır voltammetrik analiz, istihdam GSR için elektrokimyasal testler için literatürde bazı sınırlı dikkat olmuştur, ya da anodik sıyırma voltammetry, hangi bir son derece Metalik elemanlar için hassas Yöntem7. Diğer adli uygulamalar için bazı biyosensörler8yayınlandı olsa da, GSR tespit amacıyla özel olarak tasarlanmış biyosensörler literatürde çok az söz vardır.

MicRoboCop sistemindeki her cihaz için biyolojik unsurlar ve Plasmid inşaatı Şekil 1' de gösterilmiştir. Şekil 1B 'deki kavisli ok, analitin varlığını etkinleştiren Organizatör bölgesini temsil eder, oval, muhabir proteininin çevirisine izin veren ribozomal bağlayıcı sitedir, RFP etiketli gri kutu kırmızı ifade eden geni Floresan protein ve kırmızı sekizgen transkripsiyon sonlandırma sitesidir. Her üç cihaz, GSR algılamak için bir sistem olarak birlikte kullanılacaktır. Belirli bir promotör (SbRFP, PbRFP ve TNT-RFP) olan her cihaz, test edilen örnek ile inkübe edilecektir ve RFP floresans ölçülecektir. RFP sadece uygun kimyasal analitik mevcutsa ve organizatör bölgeyi aktive ederse ifade edilecektir. GSR 'de bulunan bazı kimyasal maddelere yanıt veren üç cihaz tasarlanmıştır ve bu çalışmanın içinde sunulmaktadır.

Üç mikrobocop cihazlarda kullanılan organizatör bir arsenik ve antimon duyarlı promotör, sbrfp9,10, bir kurşun duyarlı promotör, pbrfp11,12 ve bir TNT duyarlı promotör, TNT-RFP 13. çünkü literatürde bir arama Barium yanıt için tasarlanmış hiçbir Organizatör ortaya, TNT Organizatör bunun yerine seçildi bu Organizatör yapısal olarak ilgili bileşiklerin bir dizi duyarlı olduğundan (özellikle, 2, 4-dinitrotoluene ve dinitrobenzen), GSR 'de geride kalan organik bileşiklerin bir parçası olduğu bilinmektedir. Bu Organizatör, gömülü arazi madenlerinde13dakıka miktarları TNT ve 2, 4-Dinitrotoluen (2, 4-DNT) özellikle algılamak için başarıyla kullanılmıştır. Üç cihazı bir sistem olarak birlikte kullanarak, GSR için olumlu bir test, üç cihazda da floresan üretecek. Sadece bir veya iki cihazda floresans sinyali, analitin (s) başka bir çevresel kaynağını veya TNT promotör durumunda, GSR 'de kalan organik bir bileşik olmayan bir bileşik tarafından aktivasyonunu gösterecektir. Her üç cihazı birlikte kullanarak, çevresel kaynaklar nedeniyle yanlış olumlu sonuçlar olasılığı minimize edilir. Popülerlik kazanıyor kurşun-ücretsiz mühimmat, hala ABD 'de mühimmat satışları sadece yaklaşık% 5 temsil eder; Bu nedenle, kurşun yokluğunda nedeniyle yanlış olumsuz sonuçlar bir olasılık olabilir ama GSR14için bir marker olarak kurşun kullanan bir sensör hala yarar vardır. Bu özel adli uygulamaya ek olarak, her cihaz çevresel kontaminantların tespit edilmesi amacıyla ayrı olarak kullanılabilir.

Sunulan protokoller, cihazların fonksiyonunu kontrol etmek ve elde edilen floresan sinyalleri analiz etmek için cihazları (sensör bakterileri) ve analitik teknikleri oluşturmak için kullanılan sentetik biyoloji tekniklerini içerir. Protokol Ayrıca, bir şüphelinin elinden GSR toplamak veya bir yüzeyden GSR toplamak için sürüntü el silme şeklinde adli kanıtlar koleksiyonunu içerir. Kurşun sensör cihazının sonuçları, harcanan kartuş muhafazasını kullanarak GSR için olumlu bir testin gösterilmesi ile birlikte örnek sonuçlar olarak sunulur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: RFP 'yi ifade eden E. coli sentezi sunulmuştur.

1. E. coli 'den PLASMID DNA 'sı hazırlanması

  1. Bir RFP geni ve ampisilin direnç geni ile bir Plasmid içeren ve e. coli 'yi, 37 °c ' de 24 saat boyunca 100 μg/ml ampisilin Içeren Luria broth (lb) agar tabakaları ile çözülür. Örneğin, sentetik biyoloji için kullanılan standart biyolojik parçaların kayıt defterinden J10060 Plasmid kullanın (bkz. malzeme tablosu). J10060 Plasmid, pbad Organizatör bölgesinin ve ampikilin direnç geni kontrolü altında RFP (kırmızı floresan protein) için bir gen içerir. Alternatif olarak, E. coli Dönüştür (adım 3,2 BAKıN) lb agar plakaları üzerinde büyüme önce Plasmid ile.
  2. J10060 Plasmid içeren bir E. coli kültürünün 1 ml 'den DNA 'yı izole etmek için standart bir Sage protokolünü izleyin ( malzeme tablosunabakın). Aşağıdaki protokol amacı pbad Organizatör kaldırmak ve cihaz için istenen organizatör ile değiştirin etmektir.
  3. Plasmid Miniprep takipte, sindirim için hazır olana kadar dondurucuda DNA saklayın.

2. kısıtlama enzim sindirim

  1. EcoRI ve NheI sindirim için bir mikrosantrifüj tüpte aşağıdaki reaksiyonu ayarlayın: 10 μL J10060 plazmid DNA (1. adımda izole), 8 μL su ve 1 μL her bir EcoRI ve NheI enzimleri 1 μL tampon ile önceden karıştırılır (bkz. malzeme tablosu).
  2. Organizör DNA 'sı için, ecori ve nhei sindirim için bir mikrosantrifüj tüpünde aşağıdaki reaksiyonu ayarlayın: 10 μL tavlanmış Organizatör DNA dizileri (8 μL su ve 1 μL her bir ecori ve nhei enzimleri 1 μL tampon ile önceden karıştırılır.
    1. SB-, PB-, veya TNT-RFP için (bkz. malzeme tablosu), arabellekte oligonükleotidler çözülür (30 mm HEPES, pH 7,5; 100 mm potasyum asetat), eşit molar konsantrasyonlarda inküye, ısı Için 94 °c 2 dakika, ve yavaş rahat oda sıcaklığında serin).
  3. Numuneleri, 10 μL 'ye ayarlanmış pipet ile yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme yaparak karıştırın.
  4. 37 °C ' de 30 dak.
  5. Isı 80 °C ' de enzimleri 5 dakika boyunca inaktive ederler.
  6. Bir sonraki adıma hazır olana kadar dondurucuda sindirilmiş DNA 'Yı saklayın.

3. ligasyon ve dönüşüm

  1. Ligasyon
    1. 2. adımda ecori ve nhei ile iki kez sindirilmiş olan Plasmid ve organizatör DNA 'yı kullanarak, buz üzerinde bir mikrosantrifüjlü tüpte Tablo 1 ' de gösterilen reaksiyon karışımı ayarlayın; T4 DNA ligaz son ekleyin.
      Not: Tablo 1 belirtilen DNA boyutları için eklemek için 1:3 vektörü bir molar oranı kullanarak bir ligasyon gösterir.
    2. Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme ve mikrosantrifüjden kısaca reaksiyonu karıştırın.
    3. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe.
    4. 65 ° c 'de ısı devre dışı 10 dk.
  2. Dönüştürme
    1. Son buz kristalleri ortadan kalkıncaya kadar bir tüpü 20 μL DH5-Alpha yetkili E. coli hücresi ile çözün.
    2. Hücre karışımına 5 μL plazmid DNA 'Sı ekleyin. Dikkatle hücreleri ve DNA karıştırmak için tüp 4-5 kez fiske.
    3. 2 dakika boyunca buzun üzerine karışımı yerleştirin.
    4. Tam olarak 30 s için tam 42 °C Isı şok. Karıştırma.
    5. 2 dakika buz üzerine yerleştirin. Karıştırma.
    6. Pipet 380 μL oda sıcaklığında SOC karışımı içine. Hemen ampisilin (100 μg/mL) içeren LB agar plakasına yayılmış ve gece 37 °C ' de inküytir.
    7. Büyüme için 24 saat içinde plakaları kontrol edin.
    8. Conta filmi ile plakaları mühürleyin ve bir sonraki adıma hazır olana kadar buzdolabında saklayın.

4. koloni PCR

  1. Tablo 2' de gösterilen reaksiyon karışımlarının (4 reaksiyon tüpü kurmak) BIR PCR tüpüne ekleyin.
  2. Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme ile reaksiyonları karıştırın.
  3. Sarı bir pipet ucu kullanarak, dönüştürülmüş e. coli'nin bir kolonisini (veya çok küçük bir bölgeyi) kazımak. Bu E. coli 'nin bir kaydırmayı, kesilmiş olan yenı bir lb/ampicillin/agar plakasına aktarın ve Pipet ucunu PCR tüpüne takın. E. coli 'yi PCR karışımı ile karıştırmak için Pipet ucunu sallayın. Ek koloniler için üç kez daha tekrarlayın. PCR tüplerini bir PCR makinesine aktarın ve Tablo 3' te gösterilen programı kullanarak termobisiklet başlayın.
  4. Hangi kolonilerin Plasmid içine en iyi ligasyon olduğunu ve yeni bir plaka üzerinde bu kolonileri büyümek belirlemek için Tae% 2 agaroz jel kullanarak jel elektroforezi çalıştırın.
  5. Test için hazır olana kadar tabakları buzdolabında saklayın. Kimyasal testler için eklenen 100 μg/mL ampisilin ile Luria suyu içinde sıvı kültürü hazırlayın.

5. DNA sıralaması

  1. Her örnek için, 5 μL plazmid, 4 μL sıralı astar ve 3 μL deiyonize su ekleyin.
  2. Bu karışımı bir tüp içine yerleştirin ve DNA sıralaması için gönderin (bkz. malzeme tablosu).
  3. DNA dizisi verilerini analiz ederek, mutasyon olmadığından ve genlerin doğru şekilde yerleştirildiğinden emin olmak için DNA dizisi analiz yazılımını kullanarak beklenen ve gözlenen DNA dizisini karşılaştırın.
    Not: bir kimyasal sensör olarak E. coli kullanımı aşağıda sunulmuştur.

6. E. coli kültürlerinin hazırlanması

  1. Sıvı kültürler için 100 μg/mL ampisilin ile LB hazırlayın.
  2. Sensör bakterilerinin sıvı kültürlerini, pozitif kontrol * bakterileri ve negatif kontrolü * * bakterileri hazırlayın.
    Not: * pozitif kontrol bakterileri: bir kurucu Organizatör kontrol altında RFP geni ile bir Plasmid içeren E. coli ; Plasmid E1010 sentetik biyoloji için kullanılan standart biyolojik parçaların kayıt defterinden (bkz. malzeme tablosu) Bu çalışma kullanılmıştır.
    * * Negatif kontrol bakterileri: pBad promotör (sentetik biyoloji için kullanılan standart biyolojik parçaların kayıt defterinden Plasmid J10060) gibi farklı bir promotör kontrolü altında RFP geni ile bir Plasmid içeren E. coli (bkz. tablo Malzeme)) veya RFP geni olmayan bir Plasmid.
  3. Kültürlerin 37 °C ' de bir sallayarak kuluçk içine yerleştirin ve 220 RPM en az 8 saat, en fazla 18 h. bulutlu suyu bakteriyel büyüme gösterir.

7. titreyme E. coli cihazın fonksiyonunu kontrol etmek

Not: sensörler fonksiyonu kontrol etmek için titoy edildikten sonra, bu adımın tekrarlanabilmesi gerekmez. Kurşun, antimon ve 2, 4-DNT veya 1, 3-dinitrobenzen (1, 3-DNB) ilavesi şeklinde olumlu bir kontrol, tam titrasyon gerek kalmadan her kullanım için cihazların fonksiyonunu kontrol edebilirsiniz.

  1. Su içinde 10 ppm konsantrasyonuyla ilgilendiğiniz analitin (s) hisse senedi çözümünü hazırlayın. Çözünürlük bir sorundur, bir 50/50 su/metanol karışımı kullanın.
  2. Bir kılavuz olarak Tablo 4 kullanarak, steril Kültür tüpleri uygun sayıda etiket ve yer 2 kültür suyu ml (protokol adım 6) her tüp içine.
    Not: genel bir analitik aralığı belirlemek için, sensör bakterileri ile en az üç farklı seviyede bir analit, negatif kontrol ile bir seviye ve pozitif kontrol ile bir seviye yapın. Ayrıca hiçbir eklenen metal (negatif kontrol başka bir tür) olan bakterilerin her biri bir tüp olmalıdır. Analitik aralığı ve algılama sınırlarını daha doğru şekilde belirlemek için daha geniş bir analitik konsantrasyonları yelpazesi kullanın.
  3. Tablo 4' te belirtildiği gibi 2 ml suyu içeren tüplere analit stok çözümü ekleyin, böylece gevşek (tüpün içine hava akışına izin vermek) ve kültür tüpünü yerleştirmek için kültür tüpüne ek kapakları yerleştirin.
  4. En az 24 saat boyunca 220 rpm ve 37 °C ' de sallama kuluçkasında yer alan, Kültür tüpleri üzerinde gevşek kapaklar bırakarak.
  5. Tüplerini kuluçta çıkarın, kapakları sıkı bir şekilde tüplere çekin ve flüoresan analizine hazır olana kadar tüpleri buzdolabında saklayın.

8. GSR için E. coli 'yi kimyasal sensör olarak kullanma

  1. Kurşun kaldırmak için tasarlanmış bir etanol tabanlı silme kullanarak ( malzeme tablosunabakın), parmakların arasında da dahil olmak üzere, ellerin tüm yüzeyleri silin. Her el için ayrı bir temizleme kullanın. Mendilleri, analizine kadar uygun şekilde etiketli mühürlenebilir bir poşet içinde saklayın.
  2. Test edilecek yüzeyler için: büyük yüzeyler için alkol bazlı bir silme veya küçük yüzeyler için etanol ile nemlendirilmiş bir pamuklu çubuk kullanın.
    Not: sensörlerin GSR 'e yanıtını göstermek Için, harcanmış bir. 40 kalibreli kartuş Kasası, etanol nemlendirilmiş pamuklu bir çubukla temizlenmiş.
  3. Temiz eldiven giyen ve alkol ile temizlenmiş makas kullanarak, silme merkezinin yaklaşık 1 cm2 bölümünü kesti.
  4. El silme veya pamuk çubukunun kesme parçasını, 2 mL sensör bakterisi içeren bir kültür tüpüne doğrudan yerleştirin, bu da suyunda batmasını sağlar.
  5. 7,4 – 7,5 adımda yukarıda açıklandığı gibi devam edin.

9. Portatif Spektrometre kullanılarak floresans Analizi (bkz. malzeme tablosu)

  1. Tüpleri sallamak için bir Vortex karıştırıcı kullanın.
  2. Spektrometre, 500 Nm 'lik bir uyarma dalga boyu ile RFP varyantınız için uygun dalga boyunda floresan emisyonunu toplamak için hazırlayın.
  3. Boş bir spektrum kaydetmek için Luria suyu kullanın.
  4. Dikkatle her süpernatant düşük hacimli küvet için transfer ve emisyon yoğunluğu toplamak.

10.96-Well plaka okuyucu kullanarak floresan Analizi (bkz. malzeme tablosu)

  1. Tüpleri sallamak için bir Vortex karıştırıcı kullanın.
  2. Transfer 200 mL suyu iyi tabak içinde bir kuyu için. Hangi numunelerin plakanın her bir kuyusu içine girmiş olduğunu kaydedin.
  3. RFP varyantı için uygun dalga boyunda emisyon yoğunluğunu toplamak için fluorimetreyi ayarlayın.

11. veri analizi

  1. Tüm negatif kontrollerden elde edilen sinyalin kullanılması (RFP negatif bakteri veya analiz eklenmeden sensör bakterileri), arka plan için Ortalama bir floresan sinyali hesaplayın.
  2. Sensör bakterileri için elde edilen her floresan sinyalinden, arka planda düzeltilmiş floresan yoğunluğu elde etmek için Ortalama arka plan sinyalini çıkarın.
  3. Arka planda düzeltilmiş floresan yoğunluğunu ortalama arka plan sinyaliyle bölerek sinyal-gürültü (S/N) oranını tahmin edin. S/N oranı 3 ' ten büyükse, test pozitif olur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışta kullanılan RFP varyantı için floresan spektrumları Şekil 2' de gösterilir. Bu veriler, iki analitik, 2, 4-DNT ve 1, 3-DNB yanıt olarak kurşun ve TNT-RFP cihaza yanıt olarak PbRFP cihazdan. Bu rakam bir negatif kontrol spektrumunu gösterir (hiçbir analit eklendi), ve analitik iki farklı düzeylerde spektrum ekledi. Kullanılan RFP varyantı için maksimum floresan sinyali 575 Nm (uyarma dalga boyu 500 Nm) olarak gözlenmiştir. Şekil 3 ' teki veriler,...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Değişiklikler ve sorun giderme

Tablo 4 ' te açıklanan deney, tasarlanmış sensörlere uygun şekilde değiştirilebilir. Bir kimyasal sensörün en önemli yönü, duyarlılık ve özgüllüğü değerlendirmektir. Sensörün kullanışlı analitik aralığını belirlemek için çok çeşitli analitik konsantrasyonlarının analiz edildiğinden emin olmak yararlıdır. Aynı zamanda hücreler için en yüksek düzeyde analit belirlemekte değer. Bu çalışmada kullanılan analitler toksik metaller (PB v...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rekabet mali çıkarları veya ifşa ilgi diğer çatışmalar var.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Longwood Üniversitesi 'nde BıOL 324 (genetik) ve CHEM 403 (gelişmiş kimyasal laboratuar problemi çözme) öğrencileri, antimon ve kurşun biyosensörlerin ilk hazırlığı ve testinde yer alan öğrencileri kabul etmek ister. MicRoboCop için fikir GCAT SynBIO atölye (Yaz 2014), hangi NSF ve Howard Hughes Tıp Enstitüsü tarafından finanse edilir ve Maryland Üniversitesi Baltimore County tarafından barındırılan tasarlandı. Yazarlar ayrıca Longwood Üniversitesi Cook-Cole College of Arts and Sciences ve GCAT SynBio mezunlar hibe alınan fon kabul.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1,3-dinitrobenzen, %97AldrichD194255-25G
2,4-dinitrotoluen, %97Aldrich101397-5G
AgarFisher ScientificBP1423-500
AmpisilinFisher ScientificBP1760-5
Antimon, Referans Standart Çözelti (1000ppm ± % 1 / Sertifikalı)Fisher ScientificSA450-100Standardı seyreltik HNO3
Kesim Akıllı TamponNew England BioLabsB7204S
Çift Yönlü TamponEntegre DNA Teknolojileri11-01-03-00
EcoRI-HF Kısıtlama EnzimiNew England BioLabsR3101S
Etanol, HPLC sınıfı, denatüreAcros OrganicsAC611050040Solventlerin HPLC sınıfı olmasına gerek yoktur, ACS veya reaktif sınıfı çalışacaktır.
Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Dizileme KitleriEurofins GenomicsSimpleSeq Kiti Koloni için Standart
İleri astar PCREntegre DNA Teknolojileri5'- GCCGCTTGAATTCGTCATAT-3'
DNA dizilimi için ileri astarEntegre DNA Teknolojileri5'- GTAAAACGACGGCCAGTG-3'
IBI Bilim Yüksek Hızlı Plazmid Mini kitiIBI ScientificIB47101
LB Et Suyu, MillerFisher ScientificBP1426-500
Kurşun, Referans Standart Çözelti (1000ppm ve artı; %1/Sertifikalı)Fisher ScientificSL21-100Standardı seyreltik HNO3
LeadOff Tek Kullanımlık Temizleme ve Decon MendilHygenall45NRCNTeneke kutularda veya ayrı ayrı sarılmış olarak satılır, alkol bazlı herhangi bir mendil işe yarayacaktır.
Metanol, HPLC sınıfıFisher ScientificA452-4Solventlerin HPLC sınıfı olması gerekmez, ACS veya reaktif sınıfı işe yarayacaktır.
NEB 5-alfa Yetkin E. coli hücreleriNew England BioLabsC2987I
NheI-HF Kısıtlama EnzimiNew England BioLabsR3131S
Nükleaz içermeyen suNew England BioLabsB1500S
OneTaq Standart Tamponlu 2X Master MixNew England BioLabsM0482S
Sentetik biyoloji için kullanılan standart biyolojik parçaların kayıt defterinden plazmitlerStandart Biyolojik ParçalarınKayıt Defteri http://parts.igem.org/Main_Page
Promotör DizileriEntegre DNA TeknolojileriSb promotörü: 5'-GCATGAATTCA
GTCATATATGTTTTTGACTTATCC
GCTTCGAAGAGACACTACCT
GCAACAATCGCTAGCGCAT-3'
3'-CGTACTTAAGCTCACTATA
TACAAAAACTGAATAGGCGAAGC
TTCTCTCTCTGTGATGGACGTTG
TTAGCGATCGCGTA-5'
Pb destekleyici: 5'-GCATGAATTCG
TCTTGACTCTATAGTAACTAAGGG

TGTATAATCGGCAACGCG
AGCTAGCGCAT-3'
3'-CGTACTTAAGCAGAA
CTGAGATATCATTGATCTCCCACA
TCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGC
GTA-5'
TNT organizatörü: 5' GCATTCTAGAT
CAATTTATTTGAACAAGGCGGTCA
ATTCTCTTCGATTTTATCTCTCGT
AAAAAAACGTGATACTCATCACAT
CGACGAAACAACGTCACTTATACA
AAAATCACCTGCGAGAGATTAATT
GAATTCGCAT3'
3' CGTAAGATCTAGTTAA
ATAAACTTGTTCCGCCAGTTAAGA
GAAGCTAAAATAGAGAGCATTTTT
TTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGC
TTTGTTGCAGTGAATGTTTTTA
GTGGACGCTCTCTAATTAACTTAA
GCGTA5'
Koloni için ters primer PCREntegre DNA Teknolojileri5'- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3'
DNA dizilimi için ters astarEntegre DNA Teknolojileri5'- GGAAACAGCTATGACCATG-3'
T4 DNA LigazNew England BioLabsM0202S

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eschner, K. "The Story of the Real Canary in the Coal Mine.". The Smithsonian Magazine. , Smithsonian Institution. (2016).
  2. The Synthetic Biology Project. , Available from: http://www.synbioproject.org/ (2019).
  3. Roda, A., et al. Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review. Biosensors & Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).
  4. He, W., Yuan, S., Zhong, W. H., Siddikee, M. A., Dai, C. C. Application of genetically engineered microbial whole-cell biosensors for combined chemosensing. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1109-1119 (2016).
  5. Dalby, O., Butler, D., Birkett, J. W. Analysis of Gunshot Residue and Associated Materials-A Review. Journal of Forensic Sciences. 55 (4), 924-943 (2010).
  6. Bell, S., Seitzinger, L. From binary presumptive assays to probabilistic assessments: Differentiation of shooters from non-shooters using IMS, OGSR, neural networks, and likelihood ratios. Forensic Science International. 263, 176-185 (2016).
  7. O'Mahony, A. M., Wang, J. Electrochemical Detection of Gunshot Residue for Forensic Analysis: A Review. Electroanalysis. 25 (6), 1341-1358 (2013).
  8. Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. Recent Advances in Biosensor Technology for Potential Applications - An Overview. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 9(2016).
  9. Fernandez, M., Morel, B., Ramos, J. L., Krell, T. Paralogous Regulators ArsR1 and ArsR2 of Pseudomonas putida KT2440 as a Basis for Arsenic Biosensor Development. Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 4133-4144 (2016).
  10. Porter, S. E. G., Barber, A. E., Colella, O. K., Roach, T. D. Using Biological Organisms as Chemical Sensors: The MicRoboCop Project. Journal of Chemical Education. 95 (8), 1392-1397 (2018).
  11. Borremans, B., Hobman, J. L., Provoost, A., Brown, N. L., Van der Lelie, D. Cloning and functional analysis of the pbr lead resistance determinant of Ralstonia metallidurans CH34. Journal of Bacteriology. 183 (19), 5651-5658 (2001).
  12. Hobman, J. L., Julian, D. J., Brown, N. L. Cysteine coordination of Pb(II) is involved in the PbrR-dependent activation of the lead-resistance promoter, PpbrA, from Cupriavidus metallidurans CH34. Bmc Microbiology. 12, (2012).
  13. Yagur-Kroll, S., Amiel, E., Rosen, R., Belkin, S. Detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene by an Escherichia coli bioreporter: performance enhancement by directed evolution. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (17), 7177-7188 (2015).
  14. Gorman, M. "Guns in America: The Debate Over Lead Based Bullets.". Newsweek. , (2017).
  15. Yuksel, B., Ozler-Yigiter, A., Bora, T., Sen, N., Kayaalti, Z. GFAAS Determination of Antimony, Barium, and Lead Levels in Gunshot Residue Swabs: An Application in Forensic Chemistry. Atomic Spectroscopy. 37 (4), 164-169 (2016).
  16. Blakey, L. S., Sharples, G. P., Chana, K., Birkett, J. W. Fate and Behavior of Gunshot Residue-A Review. Journal of Forensic Sciences. 63 (1), 9-19 (2018).
  17. Yagur-Kroll, S., et al. Escherichia coli bioreporters for the detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (2), 885-895 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Ate li Silah At klar n n TespitiEscherichia coliSentetik BiyolojiFloresans SpektrometrisiPlazmit SindirimiKoloni TransformasyonuK lt r nk basyonuFloresans l mAnalitik Kimya

İlgili makaleler