Bu protokolün amacı, embriyo ödün vermeden gastrasyon sırasında deniz anemone nematostella vectensis genotip etmektir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Erken gelişim sırasında deniz anemon Genotipleme
Bu makalede
Özet
Özet
Burada açıklanan, hayvan hayatından ödün vermeden anthozoan Genus nematostella vectensis gastrula sahne embriyo genotip için PCR tabanlı bir protokoldür. İn vitro fertilizasyon ve de-jellying takipte, zygotların erken-orta gastrula aşamasına ulaşmak için oda sıcaklığında 24 saat gelişmesine izin verilir. Gastrula embriyoları daha sonra deniz suyu içeren bir petri çanak agaroz jel yatağa yerleştirilir. Diseksiyon mikroskop altında, bir tungsten iğne cerrahi olarak her embriyonun bir aboral doku parçası ayırmak için kullanılır. Cerrahi sonrası embriyolar daha sonra iyileşmeye ve gelişmeye devam etmesine izin verilir. Genomik DNA izole doku parçasından çıkarılır ve Locus özel PCR için bir şablon olarak kullanılır. Genotip, PCR ürünlerinin boyutuna göre veya ALLELE özel PCR ürünlerinin varlığı/yokluğunda tespit edilebilir. Cerrahi sonrası embriyolar daha sonra genottipe göre sıralanır. Tüm Genotipleme sürecinin süresi, taramalı embriyo sayısına bağlıdır, ancak minimal 4 – 5 h gerektirir. Bu yöntem embriyoların genetik olarak heterojen bir nüfusundan nakavt mutantları tanımlamak için kullanılabilir ve gelişim sırasında fenotiplerin analizlerini sağlar.
Giriş
Cnidarians denizanası, mercanlar ve deniz anemonlar içeren hayvanların çeşitli bir grup temsil eder. Bunlar, ekstrasellüler matris (mesoglea) ile ayrılan ektoderm ve endoderm 'den oluşan diploblastlar. Cnidaria, Drosophila ve mus gibi geleneksel hayvan modellerinin1' e ait olduğu Bilateria için bir kardeş grubudur. Ayrıca, Cnidaria-Bilateria sapma pre-Cambrian döneminde oluştuğu düşünülmektedir2. Bu nedenle, cnidarians ve bilatyalılar karşılaştırmalı çalışmalar en son ortak atalarının biyoloji içine anlayış kazanmak için önemlidir. Son zamanlarda, karşılaştırmalı genomikler, cnidarians ve bilatozların <....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. yumurtlama indüksiyon, in vitro fertilizasyon, ve de-jellying
- 16 °C ' de karanlığın içinde bin başına 12 parça (PPT) tuzluluk ile deniz suyunda Nematostella vectensis koruyun, günlük Artemia besleme.
- Yumurtlama İndüksiyon öncesi gün, bir sıcaklık ve ışık kontrollü kuluçla hayvan yerleştirin. Böylece hayvanların 25 °C ' de 8 h ışığa maruz kalabilmesi için kuluçk programını programlamak. Opsiyonel: yumurtlama geliştirmek için küçük bir parça (< 1 mm3) istiridye, bireysel hayvanlar için kuluçtar içine yerleştirmeden önce beslemek.
- Hayvanlarını, 16 °C ' de 1 saat boyunca kuluçsa bırakın.
- Hayv....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Nematostella genomunun, Nörofobide glwamıde için bir preürot proteini kodlayan tek bir Locası vardır. Bu Locus 'ta üç Knockout mutant alelleri (GLW-a, GLW-bve GLW-c) daha önce5bildirildi. Glwamide Locus (Genotype: +/GLW-c) ile vahşi tip allel (+) ve nakavt allel GLW-ctaşıyan dört heterozigot erkek, vahşi tip allel ve farklı nakavt taşıyan bir heterozigot dişi ile geç.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada tanımlanan bir PCR tabanlı protokol genotip tek bir deniz anemone embriyo hayvan ödün vermeden. Yumurtlama ve de-jellying takiben, döllenmiş yumurtaların gastrulae içine gelişmesine izin verilir. Her gastrula embriyo aboral bölge cerrahi olarak kaldırılır ve izole aboral doku sonraki genomik DNA ekstraksiyon için kullanılır, kalan cerrahi sonrası embriyolar iyileşmek ve gelişmeye devam ederken. GDNA ekstraları daha sonra her embriyonun genotipini belirlemek için bir PCR tahlil için kullanılır. Bu yöntem,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarın ifşa etmesi gereken bir şey yok.
Teşekkürler
Yazının önceki versiyonunda anonim yorumcular için teşekkür ederiz, bu da taslağı geliştirdi. Bu çalışma Arkansas Üniversitesi 'nden fon tarafından destekleniyordu.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Drosophila Peltier Soğutmalı Kuluçka | Makinesi Shellab | SRI6PF | Yumurtlama indüksiyonu için kullanılır |
| Anında okyanus deniz tuzu | Anında okyanus | 138510 | |
| Salamura karides kistleri | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| L-Sistein Hidroklorür | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Standart Orbital Çalkalayıcı, Model 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl, 1M, pH8.0 | KALİTE BİYOLOJİK | 351-007-01 | |
| Potasyum klorür | VWR | BDH9258 | |
| EDTA, 0.5M pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 İkame | ABD Biyolojik | N3500 | |
| Proteinaz K çözeltisi (20 mg / mL), RNA sınıfı | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agaroz | VWR | 710 | |
| Mikro Diseksiyon iğnesi tutucusu | Roboz | RS-6060 | |
| Tungsten diseksiyon iğnesi | Roboz | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler Termal Döngüleyiciler | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion Yüksek Sadakatli DNA polimeraz | New England BioLabs | M0530L | |
| dNTP karışımı | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamid üniversal ileri astar | 5'- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3' | ||
| glw-a | 5'-CCAGATGCCTGGTGATAC-3'e | ||
| glw-c | 5'- CGGCCGGCGCATATATAG-3'e |
Kaynaklar
- Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).
- Erwin, D. H., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
