Bu iletişim kuralı bir fare extrahepatic safra kanalını 3 boyutlu organoid sistemi üretimi açıklar. Bu safra organoids cholangiocyte Biyoloji çalışma kültüründe korunabilir. Safra organoids işaretleri hem yaratıcı hem de safra hücreleri hızlı ve polarize epitel hücrelerinin oluşmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Organoids fare Extrahepatic safra kanalları üzerinden nesil
Bu makalede
Özet
Özet
Cholangiopathies, extrahepatic safra kanalları (EHBDs) etkileyen, safra atrezi, Birincil sklerozan kolanjit ve cholangiocarcinoma içerir. Onlar etkili tedavi seçeneği var. EHBD eğitim araçları çok sınırlıdır. Bizim amacımız kolayca vahşi türü ve genetik fareler üretilen bir organ özgü, çok yönlü, Yetişkin kök hücre kaynaklı, preklinik cholangiocyte modeli geliştirmekti. Böylece, biz yetişkin fare EHBDs bir EHBD organoid (EHBDO) kültür sisteminden geliştirme roman tekniği rapor. Modelin maliyet-etkin, kolayca çözümlenmesi mümkün olduğunu ve birden çok akış yönündeki uygulama alanı vardır. Özellikle, fare EHBD yalıtım ve tek hücre ayrılma, organoid kültür başlatılması, yayma ve uzun vadeli bakım ve depolama yöntemi açıklanmaktadır. Bu makale ayrıca immünhistokimya, floresan mikroskopi ve mRNA bereket Nefelometri için gerçek zamanlı nicel ters transkripsiyon Polimeraz zincir tepkimesi (PCR qRT) tarafından işleme EHBDO açıklar. Bu iletişim kuralının EHBD özgü organoids üreten ek olarak önemli avantajlar vardır. L-UYR hücrelerden şartına bir orta kullanımı önemli ölçüde bu model maliyetini azaltır. Fare EHBDs kullanımı insan dokusu aksine kültür üretimi için neredeyse sınırsız doku sağlar. Oluşturulan fare EHBDOs endodermal progenitör işaretleri saf nüfusuyla epitel hücresi içeren ve safra hücreleri ayrıştırılan. Kültürlü organoids birden çok pasajlar ile homojen Morfoloji korumak ve bir uzun vadeli depolama süresi sıvı azot sonra elde edilebilir. Model safra progenitör hücre çoğalması için çalışma sağlar, farmakolojik manipüle edilebilir ve genetik fareler oluşturulabilir. Gelecekteki çalışmalar Kültür koşulları kaplama verimliliği artırmak, işlevsel hücre olgunluk ve doğrudan hücre farklılaşması değerlendirmek için en iyi duruma getirmek için ihtiyaç vardır. Ortak kültür modeller ve daha biyolojik olarak tarafsız bir hücre dışı matriks geliştirilmesi de arzu vardır.
Giriş
Cholangiopathies içi - ve extrahepatic safra kanalları (EHBDs)1bulunan safra hücrelerini etkiler tedavi edilemez kronik ilerici bozuklukları vardır. Birincil sklerozan kolanjit, cholangiocarcinoma, safra atrezi ve choledochal kistleri, gibi bazı cholangiopathies ağırlıklı olarak EHBDs etkiler. Cholangiopathies için tedavilerin geliştirilmesi Preklinik modellerin sınırlı kullanılabilirliğe tarafından sınırlandırılmıştır. Buna ek olarak, önceki çalışmalarda birlikte gruplandırılmış cholangiopathies üzerinde duruldu: karaciğer, içi- ve EHBDs. Ancak, içi - ve EHBDs ayrı bir embriyonik kökenli ve, böylece, farklı moleküler patolojiler düşünülmelidir....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), The University of Michigan tarafından onaylanmıştır.
1. hazırlanması fare EHBD yalıtım için malzeme ve tesisatlar
- Tohumlama orta ve çamaşır arabellek (Tablo reçetesi) 50 mL konik tüpler hazırlamak ve kadar kullanmak 4 ° C'de veya buz üzerinde tutun.
- Bir cerrahi masa (şekil 1B) kurun. Steril cerrahi aletler (şekil 1 c) hazırlayın.
- Steril bir 24-şey plaka önceden ısıtmak için 37 ° C doku kültürü kuluçka makinesine koyun.
- Bir aliquot Bodrum matris B....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bizim protokolünü doku özgü ve yetişkin kök hücre kaynaklı fare EHBD organoids nesil açıklar. Sonra organoids kültürlü, Kistik yapısı oluşumu 1 gün sonra EHBD yalıtım olarak erken görülebilir. Fibroblastlar ile kirlenme genellikle kültür oluşturma sırasında gözlenen değil. EHBDO verimliliği kaplama olduğunu yaklaşık %2 ne zaman yenidoğan veya yetişkin üzerinden (2 aydan daha eski) izole fare (şekil 2B). EHBD organoids verimliliğini kaplama yetişkin fareler ge.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu eser fare EHBD cholangiocytes bir organotypic 3 boyutlu model nesil açıklar. EHBDO kültür üretimi önemli adımlardan dahil pankreas hücresi kirlenmesini, bakteriyel ve mantar kirlenme ve sonra Santrifüjü önlemek için dikkatli işleme önlemek için steril koşulları bakımından önlemek için çok titiz EHBD diseksiyon hücresel malzeme kaybı. Açıklanan sıcaklık koşullarında yakın bir bağlılık gereklidir. Teknik bazı sınırlamalar vardır. EHBDs yetişkin fareler küçük (yaklaşık 1 mm çapı; Şekil 1E), .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar onlar rakip hiçbir ilgi alanlarına sahip bildirin.
Teşekkürler
Bu eser çalışma karaciğer hastalıkları Pinnacle Ödülü (için N.R.) ve ulusal sağlık enstitüleri, diyabet Ulusal Enstitüsü ve sindirim için Amerikan Derneği ve böbrek hastalıkları (P30 DK34933 N.R., P01 DK062041 J.L.M. için Ödülleri) tarafından desteklenmiştir. Dr. Ramon Ocadiz-Ruiz (Michigan Üniversitesi) geliştirme Bu metodoloji ile onun yardım için teşekkür.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| L-WRN hücre kültürü ortamı< / güçlü > | |||
| Gelişmiş DMEM / F12 | Yaşam Teknolojileri | 12634-010 | |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | % 1 | Yaşam Teknolojileri | 10437-028 |
| Penisilin-Streptomisin | 100 U / mL | Yaşam Teknolojileri | 15140-122 |
| < güçlü > Yıkama tamponu< / güçlü> | |||
| Fosfat Tamponlu Salin (PBS) | 50 mL | Yaşam Teknolojileri | 10010-023 |
| Penisilin-Streptomisin | 125 U/mL | Yaşam Teknolojileri | 15140-122 |
| Amfoterisin B | 6.25 ve mikro; g/mL | Yaşam Teknolojileri | 15290-018 |
| Organoid kültür ortamı | |||
| L-WRN Şartlandırılmış ortam | 1:1 | ATCC | CRL-3276 |
| Gelişmiş DMEM/F12 | 1:1 | Yaşam Teknolojileri | 12634-010 |
| Penisilin-Streptomisin | 100 U/mL | Yaşam Teknolojileri | 15140-122 |
| N-Glutamin | 10 ve mikro; l/mL | Yaşam Teknolojileri | 35050-061 |
| N-2-hidroksietilpiperazin-N-2-etan sülfonik asit, HEPES | 10 mM | Yaşam Teknolojileri | 15630-080 |
| B27 | 10 & mikro; l / mL | Gibco | 17504-044 |
| N2 | 10 ve mikro; l/mL | Gibco | 17502-048 |
| Organoid tohumlama ortamı | |||
| Organoid kültür ortamı | |||
| Epidermal büyüme faktörü (EGF) | 50 ng/mL | İnvitrojen | PMG8041 |
| Fibroblast büyüme faktörü-10 (FGF10) | 100 ng/mL | PeproTech | 100-26 |
| Birincil antikorlar | |||
| Anti-Sitokeratin 19 (CK19) antikoru, Tavşan | 1:250 | Abcam | ab53119 |
| Cinsiyet Belirleyici Bölge Y-Box 9 (SOX9) antikoru, Tavşan | 1:200 | Santa Cruz | sc-20095 |
| Pankreatik Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antikoru, Tavşan | 1:2000 | DSRB | F109-D12 |
| E-kaderin antikoru, Keçi | 1:500 | Santa Cruz | sc-31020 |
| Asetillenmiş &alfa;-tubulin antikoru, Fare | 1:500 | Sigma-Aldrich | T6793 |
| İkincil antikorlar | |||
| 488 etiketli anti-tavşan, Eşek IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-21206 |
| 594 etiketli anti-keçi, Eşek IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-11058 |
| 568 etiketli anti-fare, Keçi IgG2b | 1:500 | Invitrogen | A-21144 |
| TopFlash Wnt muhabir tahlili | |||
| TopFlash HEK293 hücre hattı | ATCC | CRL-1573 | |
| Lusiferaz Test Kiti | Biotium | 30003-2 | |
| %0,05 Tripsin-EDTA | Yaşam Teknolojileri | 25300054 | |
| %0,4 Tripan Mavisi Çözeltisi | Yaşam Teknolojileri | 15250061 | |
| Ek malzemeler ve reaktifler | |||
| temel matris, fenol içermeyen Matrigel | CORNING | 356237 | |
| Dissosiyasyon tamponu, Accutase | Gibco | A1110501 | |
| Hücre kültürü dondurma ortamı, Geri Kazanım | Yaşam Teknolojileri | 12648010 | |
| Hücre süzgeci (70 & mikro; m, steril) | Fisherbrand | 22363548 | |
| Guanidinyum tiyosiyanat-fenol RNA ekstraksiyonu, TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
| Numune işleme jeli, HistoGel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Evrensel mikoplazma tespit kiti | ATCC | 30-1012K | |
| 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 24 kuyulu plaka | USA Scientific | CC7682-7524 | |
| 50 mL konik santrifüj tüpü | Fisher scientific | 14-432-22 | |
| Floresan mikroskobu | Nikon | Eclipse E800 | |
| Ters mikroskop | Biotium | 30003-2 | |
| Nekropsi tepsisi | Fisherbrand | 13-814-61 |
Kaynaklar
- Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. The Cholangiopathies. Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).
- Carpino, G., et al. Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration. Stem Cells International. 2016, 3658013(2016).
- DiPaola....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
