Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Dev veziküller Içinde tek hücreli seviyede bakteriyel hücre kültürü

6.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/59555

⸱

30 Nisan 2019

 ,  ,  , 
1Biomedical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 2Department of Life Science and Medical Bioscience, Waseda University

Bu makalede

Özet

Biz dev veziküller (GVs) içinde bakteri tek hücreli kültürü göstermektedir. Bakteriyel hücreler içeren GVs damlacık transfer yöntemi ile hazırlanmıştır ve bakteriyel büyüme doğrudan gözlem için bir cam substrat üzerinde desteklenen bir membran immobilize edildi. Bu yaklaşım, diğer hücrelere de uyarlanabilir.

Özet

Biz dev veziküller (GVs) içinde tek hücreli düzeyde bakteriyel hücreler kültür için bir yöntem geliştirdik. Bakteriyel hücre kültürü, doğal ortamda bakteriyel hücrelerin fonksiyonunu anlamak için önemlidir. Teknolojik gelişmeler nedeniyle, çeşitli bakteriyel hücre fonksiyonları sınırlı bir alan içinde tek hücreli düzeyde ortaya olabilir. GVs, amphiphilik lipid moleküllerinden oluşan küresel mikro boyutlu bölmeler ve hücreler de dahil olmak üzere çeşitli malzemeler tutabilir. Bu çalışmada, tek bir bakteriyel hücre, damlacık transfer yöntemi ile 10 – 30 μm GVs içine kapsüllenmiş ve bakteriyel hücreler içeren GVs cam substrat üzerinde desteklenen bir membran üzerinde immobilize edildi. Bizim yöntemi GVs içinde tek bakterilerin gerçek zamanlı büyüme gözlem için yararlıdır. Biz GVs içinde bir model olarak Escherichia coli (E. coli) hücreleri kültürlü, ama bu yöntem diğer hücre türlerine adapte edilebilir. Bizim yöntemi Mikrobiyoloji, biyoloji, biyoteknoloji ve sentetik biyoloji bilim ve sanayi alanlarında kullanılabilir.

Giriş

Tek hücreli düzeyde bakteriyel hücrelerin kültürü artan ilgi aldı. Sınırlı bir alan içinde tek hücreli düzeyde bakteriyel hücreleri kültür fenotip değişkenlik1,2,3,4, hücre davranışı5gibi bakteriyel fonksiyonları aydınlatmak olabilir, 6 , 7 , 8 , 9ve antibiyotik direnci10,11. Kültür tekniklerindeki son gelişmeler nedeniyle, tek bakterilerin kültürü, bir iyi çip4,7,8, jel damlacık12,13 gibi kapalı bir alanda elde edilebilir ve yağ içinde su (W/O) damlacık5,11. Tek bakteriyel hücrelerin anlayış veya kullanımını teşvik etmek için, yetiştirme tekniklerinin daha fazla teknik gelişimi gereklidir.

Biyolojik hücre membranı taklit eden veziküller, amphiphilik moleküllerden oluşan küresel bölmeler olup çeşitli materyalleri tutabilir. Veziküller boyutuna göre sınıflandırılır ve küçük veziküller (SVs, çapı < 100 Nm), büyük veziküller (LVs, < 1 μm) ve dev veziküller (GVs, > 1 μm) içerir. SVs veya LVs yaygın olarak biyolojik hücre membranı14için kendi yakınlık nedeniyle uyuşturucu taşıyıcıları olarak kullanılır. GVS Ayrıca belirleyebiliyorlar15 veya suni hücreler16inşası için bir reaktör sistemi olarak kullanılmıştır. Biyolojik hücrelerin GVS içine kapsülleme,17,18bildirilmiştir ve böylece reaktör sistemi ile kombine edildiğinde bir hücre kültürü sistemi olarak potansiyel GVS göstermek.

Burada, deneysel prosedürler bir video ile birlikte, biz nasıl GVs yeni hücre kültürü gemiler olarak kullanılabilir tarif19. Bakteriler içeren GVs damlacık transfer yöntemi20 tarafından yapılmıştır ve daha sonra bir kapak camında desteklenen bir membran üzerinde immobilize edildi. Bu sistemi, gerçek zamanlı olarak GVs içindeki tek hücreli seviyede bakteriyel büyümesini gözlemlemek için kullandık.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. droplet transfer yöntemi ile bakteriyel hücreler Içeren GVs hazırlanması

  1. 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-gliserin-3-fosfokolin lipid stok çözümleri hazırlayın (POPC, 10 mM, 1 mL) ve 1, 2-distearoyl-sn-gliserol-3-fosfoetolin-N-[biotinyl (polileneglycol)-2000] (biotin-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 mL) kloroform/ Metanol çözeltisi (2/1, v/v) ve stokları-20 °C ' de saklayın.
  2. Lipid içeren yağ çözeltisi hazırlanması
    1. 20 μL POPC çözeltisi ve 4 μL biotin-PEG-DSPE solüsyonu bir cam tüpüne dökün (Şekil 1B (ı)).
    2. Bir lipid filmi oluşturmak ve organik çözücüyü tamamen Buharlaştırıcı 1 h için bir kurutucu içine film yerleştirmek için hava akışı ile organik çözücü Buharlık (Şekil 1B (ii)).
      Not: Bir duman kaputu içinde organik çözücü Buharlık gerekir.
    3. Cam şişeye 200 μL mineral yağı (0,84 g/mL, malzeme tablosu) ekleyin (Şekil 1B (iii)).
    4. Cam şişenin açılış parçasını film ile sarın ve ultrasonik banyoda (120 W) en az 1 h (Şekil 1B (iii)) olarak sonlayın. POPC ve biotin-PEG-DSPE son konsantrasyonları sırasıyla 1 mM ve 0,002 mM vardır.
  3. Bakteriyel hücrelerin öncesi kültür
    1. E. coli IÇINE 1x lb Orta (1 g maya ekstresi, 2 g Bacto Tripton, ve 2 g sodyum klorür 200 ml deiyonize su) bir lb plaka ve inkübe Içinde 37 °c için 12 – 14 h (gece).
    2. Kuluçk sonra, 20 μL kültür çözümü toplamak ve 1,98 mL taze 1x LB orta transfer ve kültür hücreleri 2 h için tekrar.
    3. 600 Nm (OD600) ön kültür çözeltisi (adım 1.3.2 ' de hazırlanmış) cinsinden optik yoğunluğu kontrol edin. OD600 = 1,0 – 1.5 öncesi kültür çözümü kullanılmalıdır.
  4. GVs 'nin dış ve iç sulu çözeltileri hazırlanması
    1. GVs bir dış sulu çözeltisi hazırlamak için 1x LB orta glikoz çözülür. 20 mL 'lik bir stok glikoz çözeltisi hazırlayın (500 mM).
    2. 200 mM (Tablo 1) 1x lb orta ile stok glikoz çözeltisi seyreltilebilir.
    3. GVs bir iç sulu çözeltisi hazırlamak için 1x LB orta sukroz çözülür. 20 mL 'lik bir stok sukroz çözeltisi hazırlayın (500 mM).
    4. Kültür öncesi çözümü (OD600 = 1.0 – 1.5), sakaroz çözeltisi (500 mm) ve 1x lb Orta (Tablo 1) karıştırın. Kültür çözümün son OD600 değeri 0.01 – 0.015 olmalıdır ve son sukroz konsantrasyonu 200 mm olmalıdır.
      Not: Osrotik basıncını önlemek için dikkat alın. İç ve dış sulu solüsyon arasındaki konsantrasyonu dengelemek gerekir.
  5. Bakteriyel hücreler içeren su içinde yağ (W/O) damlacıkları hazırlanması
    1. 0,6 mL 'Lik bir plastik tüpte (Şekil 1B (IV)), lipidler (popc ve BIOTIN-Peg-DSPE ile maden yağı) içeren yağ çözeltisi Ile 50 μL arasında (adım 1.4.4 ' de hazırlanmış) GVS 'nin iç sulu çözeltisi 2 μL ekleyin.
    2. Tüp elle dokunarak plastik tüpteki iki bileşeni emulsify (Şekil 1B (v)).
  6. Bakteriyel hücreler içeren GVs oluşumu
    1. 1,5 mL delikli plastik tüpte (adım 1.4.2 ' de hazırlanan) GVs 'nin dış sulu çözeltisi 50 μL ekleyin (Şekil 1B (VI)) ve lipidler (popc ve BIOTIN-Peg-DSPE ile mineral yağı) içeren yağ çözeltisi ile hafif bir şekilde katman 150 μL dış sulu (Şekil 1B (vii)). Bu numuneyi oda sıcaklığında (RT, 25 °C) 10 – 15 dk. yağ ve sulu solüsyonların arayüzünün düz olduğundan emin olmak için kontrol edin.
    2. Bir pipet kullanarak yağ ve sulu çözeltinin arayüzünde (1.5.2 adımda hazırlanmış) W/O damlacık çözeltisi 50 μL ekleyin (Şekil 1B (viii)).
    3. 1,5 mL 'Lik plastik tüpü (adım 1.6.2) bir masaüstü santrifüjünde RT 'de 1.600 x g 'de 10 dakika boyunca santrifüjle (Şekil 1B (ix)). Santrifüjden sonra, 1,5-ml kapaklı plastik tüpten yağ (üst tabaka) bir pipet kullanarak Aspire ve bakteriyel hücreler içeren GV 'leri toplar (Şekil 1B (x)).

2. GV gözlem sisteminin hazırlanması (bakteriyel hücre kültürü sistemi)

  1. Dolapları için küçük veziküller (SVS) hazırlanması ng a desteklenen fosfolipid membran
    1. 20 μL POPC çözeltisi ve 4 μL biotin-PEG-DSPE solüsyonu bir cam tüpüne dökün (1,1 adımda GV hazırlama için kullanılan aynı lipid bileşimi kullanılarak).
    2. Bir lipid filmi oluşturmak için hava akışı ile organik çözücüyü Buharlaştırıcı ve 1 h için bir kurutucu içinde bu örnek yer tamamen organik çözücü Buharlık.
    3. 200 mM glikoz 200 μL 1x LB Orta (GVs dış sulu solüsyon) cam şişeye ekleyin.
    4. Cam şişenin açılış parçasını film ile sarın ve ultrasonik banyoda (120 W) en az 1 saat boyunca sonlayın.
    5. 100 Nm gözenek boyutu ile mini Extruder ve polikarbonat membran kullanarak ekstrüzyon yöntemi21 Ile SVS hazırlayın.
  2. El yapımı bir odanın hazırlanması
    1. Çift yüzlü mühür (10 mm x 10 mm x 1 mm) üzerinde boş bir yumruk ile 7 mm delik matkap.
    2. Çift yüzlü mührü bir kapak camı üzerindeki delikle (30 mm x 40 mm, kalınlık 0,25 – 0.35 mm) yapıştırın.
  3. Odanın delikteki kapak camında desteklenen bir fosfolipid membranın hazırlanması
    1. Oda delikine (2,2 bölümünde hazırlanmış) SV çözeltisi 30 μL ekleyin ve 30 dakika boyunca RT 'de inküye yapın.
    2. 200 mM glikoz içeren 20 μL 1x LB orta ile deliği iki kez yavaşça yıkayın (GVs 'nin dış sulu çözeltisi) pipetleme ile.
  4. Üzerinde GVs Immobilizasyon odanın delikteki kapak camında desteklenen fosfolipid membran
    1. 10 μL neutravidin (1 mg/mL) deliğe GVs dış sulu çözeltisi ile tanıtmak ve RT 15 dakika boyunca inkübe.
    2. 200 mM glikoz içeren 20 μL 1x LB orta ile deliği iki kez yavaşça yıkayın (GVs 'nin dış sulu çözeltisi) pipetleme ile.
    3. GVs (adım 1.6.3) içeren tüm çözümleri, kapak camı (18 mm x 18 mm, kalınlık 0.13 – 0.17 mm) (Şekil 2B) ile odanın deliğe ve mührüne ekleyin.
  5. GVs içinde bakteriyel hücre büyümesini mikroskobik gözlem
    1. Uzun çalışma mesafesi (Şekil 2B) ile 40X/0.6 sayısal DIYAFRAM (na) objektif lens ile donatılmış ters mikroskop ile mikroskobik Isıtma aşaması sistemi ayarlayın.
    2. Odası mikroskobik Isıtma aşaması sistemine yerleştirin (Şekil 2B). 37 °C ' de 6 h için statik bir durumda odada bakteriyel hücreler içeren GV 'leri inkük etmek.
    3. Bir bilimsel tamamlayıcı metal oksit yarıiletken (sCMOS) kamera kullanarak her 30 dakika içinde GVs içinde bakteriyel hücre büyümesi mikroskop görüntüleri yakalama ve kayıt.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Damlacık Transfer yöntemini kullanarak tek bakteriyel hücreler içeren GVs oluşturmak için basit bir yöntem sunuyoruz (Şekil 1). Şekil 1a bakteri Içeren GVS yağışında bir şematik görüntü gösterir. Bakteri içeren W/O damlacıkları yağ-su (lipid monolayer) arayüzünde santrifüjleme ile GVs oluşturmak için aktarılır. Sakaroz (iç sulu solüsyon) ve glikoz (dış sulu solüsyon) arasındaki yoğunlukta fark, W/O damlacıkları yağ su arayüzünün ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, biz GVs içinde tek hücreli düzeyde bakteriyel hücreler kültür için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu basit yöntem, damlacık Transfer yöntemini kullanarak tek hücreli düzeyde bakteriyel hücreler içeren GVs oluşturma içerir. Bakteriyel hücreler içeren GVs almak için diğer yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında, bu yöntem iki avantajı vardır: (i) geliştirmek kolaydır, ve (ii) örnek çözümün küçük bir hacmi (2 μL) GVs hazırlamak için gereklidir. Bakteriyel hücreler içeren GVS hazırlamak için damlacık transfer yöntemi

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Japonya 'nın eğitim, kültür, spor, bilim ve teknoloji (MEXT) Bakanlığından mükemmel genç araştırmacılar (lıder, No. 16812285) için önde gelen bir girişim tarafından destekleniyordu (No. 18K18157, 16K21034) genç bilim adamı araştırmaları için hibe-in-Aid Japonya 'dan m. ' ye bilim (JSPS) tanıtımı için ve MEXT 'den K.K. 'ye (No. 17H06417, 17H06413) Grant-ın-Aid.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
BactotryptoneBD Biosciences211705
KloroformWako Saf Kimyasallar032-21921
Kapak camı (18 ve kez; 18 mm)Matsunami Cam Ind.C018181kalınlığı 0.13– 0,17 mm
Kapak camı (30 > 40 mm)Matsunami Cam Ind.Özel siparişkalınlığı 0.25– 0.35 mm
Masaüstü santrifüjHi-Tech Co.ATT101salıncak rotor tipi
Çift yüzlü conta (10 & kez; 10 & kez; 1 mm)NitomsT4613
Cam şişeBİR GİBİ6-306-01Durham fermantasyon tüpü
GlikozWako Saf Kimyasallar049-31165
Ters mikroskopOlympusIX-73
MetanolWako Saf Kimyasallar133-16771
Mikroskobik ısıtma kademesi sistemiTOKAI HITTP-110R-100
Mineral yağNacalai Tesque23334-85
Mini ekstrüderAvanti Polar Lipids610000
NeutravidinThermo Fisher Scientific31000
Objektif lensOlympusLUCPLFLN 40&kez;/0.6 NA
Polikarbonat membranlarAvanti Polar Lipidler610005gözenek boyutu 100 nm
sCMOS kameraAndorZyla 4.2 plus
Sodyum klorürWako Saf Kimyasallar191-01665
SükrozWako Saf Kimyasallar196-00015
Ultrasonik banyoAS ONEASU-3D
Maya özüBD Biosciences212750
0.6 mL kapaklı plastik tüpWatson130-806C
1.5 mL kapaklı plastik tüpSumitomo Bakalit Co.MS4265-M
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfokolinAvanti Polar Lipidler850457PPOPC
1,2-distearoil-snglycero-3-fosfoetanolamin-N-[biyotinil (polietilenglikol)-2000]Avanti Polar Lipidler880129PBiotin-PEG-DSPE

Kaynaklar

  1. Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
  2. Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. 307, 1962-1965 (2005).
  3. Eldar, A., Elowitz, M. B. Functional roles for noise in genetic circuits. Nature. 467, 167-173 (2010).
  4. Hashimoto, M., et al. Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).
  5. Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).
  6. Christopher, M., Waters, B. L. B. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
  7. Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. On-chip culture system for observation of isolated individual cells. Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).
  8. Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20, 1099-1103 (2010).
  9. Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. Cell shape dynamics in Escherichia coli. Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).
  10. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
  11. Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).
  12. Zengler, K., et al. Cultivating the uncultured. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15681-15686 (2002).
  13. Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).
  14. Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).
  15. Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L. Synthesizing life. Nature. 409, 387-390 (2001).
  16. Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).
  17. Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles. Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).
  18. Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique. ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).
  19. Morita, M., Katoh, K., Noda, N. Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures. ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).
  20. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  21. Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 812, 55-65 (1985).
  22. Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).
  23. Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles. Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).
  24. Weinberger, A., et al. Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).
  25. Kurokawa, C., et al. DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).
  26. Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).
  27. Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  28. Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors. Interface Focus. 8, 20180024(2018).
  29. Elani, Y., et al. Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules. Scientific Reports. 8, 4564(2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Escherichia coliDamlac k Transfer Y ntemiDestekli MembranMikroskobik G r nt lemeVezik l Olu umuH cre Kaps llemeGer ek Zamanl B y me
Dev veziküller Içinde tek hücreli seviyede bakteriyel hücre kültürü
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.