Kas hastalığının yapısal temelini Incelemek için bir araç olarak bozulmamış Murine Iskelet kasının X-ışını kırması

Özet

Biz bozulmamış fare iskelet kasları kullanarak küçük açılı X-ışını dikeslenme denemeleri gerçekleştirmek için ayrıntılı protokoller sunuyoruz. İnsan hastalıkları için transgenik fare modellerinin geniş kullanılabilirlik ile, bu deneysel platform genetik kas hastalıklarının yapısal temeli aydınlatılmasına için yararlı bir test yatağı oluşturabilir

Özet

Transjenik fare modelleri, iskelet kası da dahil olmak üzere insan hastalıkları için genotip fenotip ilişkisini incelemek için önemli araçlar olmuştur. Fare iskelet kası, üçüncü nesil senkrotron beaylines üzerinde yüksek kaliteli X-ışını dikesasyon desenleri üretmek için bir fırsat belirlenmesi tarafından sağlık ve hastalığın fonksiyonel fenotipleri genotip düzeyinde değişiklikleri bağlamak için gösterilmiştir Genetik değişikliklerin yapısal sonuçları. Numunelerin hazırlanması, X-Ray desenlerini toplamak ve bu tür denemeleri kendileri için yapmak isteyen deney elemanlarına yardımcı olabilecek X-Ray desenlerinden ilgili yapısal parametreleri ayıklamak için ayrıntılı protokoller sunuyoruz.

Giriş

Synchrotron küçük açılı X-ışını kırınması, fizyolojik koşullarda kas preparatlarının aktif olarak taahhüt edilmesi için Nm-ölçek yapısını incelemek için tercih edilen yöntemdir. Daha da önemlisi, yaşam veya tenli kas preparatlarının yapısal bilgileri, kas kuvveti ve uzunluk değişiklikleri gibi fizyolojik verilerle senkron olarak elde edilebilir. Sarkomerik proteinlerde nokta mutasyonları temelinde kalıtsal kas hastalıklarının yapısal temelini incelemek için bu tekniği uygulayarak ilgi artmaktadır. Kas Biyofizik topluluk yapısal çalışmalar için ideal test yatakları sağlayabilir bu insan hastalığı koşulları için transgenik fare modelleri üreten çok aktif olmuştur. Bizim grup^1,2,3 ve diğerleri^4,5 gelen son yayınlar, fare ekstansiyon Digitorum longus (EDL) ve soleus kasları X-Ray desenleri tüm sağlayabilir belirtti gibi kurbağa ve tavşan psoas iskelet kas gibi daha geleneksel model organizmaların kullanılabilir dikesasyon bilgileri. Fare iskelet kas hazırlama avantajı diseksiyon kolaylığı ve temel membran-bozulmamış, tüm kas fizyolojik deneyler gerçekleştirme. Disseke kas boyutları çok kısa x-ışını pozlama süreleri (kare başına ~ milisaniyelik) son derece ayrıntılı kas desenleri vermek için yeterli kütle var üçüncü nesil X-Ray beaylines.

Kas X-ışını kırıcılık desenleri ekvatoryal yansımalar, merasonal yansımaları yanı sıra katman çizgi yansımaları oluşur. Ekvator yoğunluğu oranı (1, 1 ve 1, 0 Ekvator yansımaları yoğunluğunun oranı, ben₁₁/i₁₀), yakından bağlı çapraz köprüler sayısına korelasyon, hangi kuvvet fare iskelet kas oluşturulan orantılı olan ². kalın ve ince filamat içinde rapor periodicities Meridional yansımaları filament genişletilebilirlik^1,3,6,7tahmin etmek için kullanılabilir. Meridyen ve Ekvator üzerinde olmayan parçalanma özellikleri, kalın filament omurgası yüzeyinde yaklaşık helisel sipariş miyosin kafaları yanı sıra yaklaşık helisel sipariş ince filaminler ortaya katman hatları denir. Miyosin tabaka çizgilerinin yoğunluğu, çeşitli koşullar altında miyozin kafaları sipariş derecesi ile yakından ilişkilidir^2,8. Tüm bu bilgiler, sağlık ve hastalık içinde situ içinde sarcomerik proteinlerin davranışları çalışma kullanılabilir.

Kas Synchrotron X-ışını kırılabilirlik tarihsel olarak son derece uzmanlaşmış uzmanlar ekipleri tarafından yapılan ama teknoloji gelişmeler ve yeni veri azaltma araçları mevcudiyeti bu gerek her zaman durumda olmadığını gösterir. Gelişmiş foton kaynak BioCAT Beayline 18ID, Argonne Ulusal Laboratuvarı bu teknikleri kullanarak başlamak alana yeni gelenler yardımcı olabilir kas X-ışını dikeslenme deneyler gerçekleştirmek için personel ve destek tesisleri adamıştır. Birçok kullanıcı resmi olarak BioCAT personeli ile işbirliği yapmayı tercih, ancak artan sayıda kullanıcı onlar deneyleri yapabilir ve kendilerini Beam hattı personeli üzerindeki yükü azaltarak analiz bulabilirsiniz. Bu makalenin birincil amacı, BioCAT beayline ya da etrafında diğer yüksek Flux beaylines ya da fare iskelet kas sistemi üzerinde deneyler planlamak ve yürütmek için gereken bilgileri ile potansiyel deneyler sağlayan eğitim sağlamaktır Bu deneylerin mümkün olacağını dünya.

Protokol

Tüm hayvan deneyler protokolleri Illinois Institute of Technology kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (protokol 2015-001, onay tarihi: 3 Kasım 2015) tarafından onaylanmış ve NıH izledi "bakım ve laboratuar hayvanların kullanımı için Kılavuzu"⁹ .

1. ön deney hazırlığı

1. Hazırlamak 500 mL ringer çözeltisi (içerir: 145 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,0 mM MgSO₄, 1,0 mm CAcl₂, 10,0 mm HEPES, 11 mm glikoz, pH 7,4) taze her gün için deneme.
2. 200 mL 'Lik bir sprey şişesinde Ringer çözümünü doldurun ve 4 °C ' de buzdolabında saklayın. Bir petri tabağı (10 cm çapında) ile ringer çözeltisi ve serpmek ile 100% oksijen bir akvaryum hava taşı bir oksijen silindirden tüp bağlayarak. Petri yemekleri ("diseksiyon yemekleri") daha önce diseksiyon sırasında iğne takmasını sağlamak için bir elastomer bileşiği ile kaplanmıştır.
3. Metal montaj kancaları hazırlayın. İki adet paslanmaz çelik tel kesme, 0,5 mm çapında, uygun uzunluğa kadar ve her iki ucunda da tel bükülür. Tüm diseksiyon araçları, makas, dikiş bağlama forseps, mikro-makas kullanım için kullanışlı düzenleyin.
   Not: Kanca parçası yaklaşık 3 mm uzunluğunda olmalıdır. Uzun tel (bir kanca biten) yaklaşık 5 cm uzunluğunda olmalıdır, ve kısa tel (aynı zamanda bir kanca sona erdirmek) yaklaşık 1 cm uzunluğunda olmalıdır özel odalar biocat kullanılan sığacak şekilde ve dönüştürücü kolu için hareket yeterli bir dizi için izin.
4. Tüm donanımları bağlayın ve açın. Bu bir kombine motor/kuvvet Dönüştürücüsü, motor/kuvvet dönüştürücü denetleyici yüksek güçlü bi-fazik akım stimülatör ve bir bilgisayar kontrollü veri edinme/kontrol sistemi içerir.
   1. Veri alma sistemini açın ve deneme¹⁰' a başlamadan önce kalibre edin. Kısaca, bir dizi bilinen ağırlık ekleyerek kuvvet kalibre, doğrusal bir ilerlemenin kuvvet dönüştürücü tarafından ölçülen maksimum kuvvet% 50 kadar kaplayan, kuvvet dönüştürücü üzerinde ve çıkış voltajı değişiklikleri kayıt. Kol koluna bilinen bir çıkış voltajı kümesi uygulayarak ve kolun uzunluk değişiksini ölçerek uzunluğu kalibre edin.
   2. Hortumları, numune tutucusunun termal bloğundan soğutulmuş bir sirkülasyon banyosuna bağlayın ve sıcaklığı 10 °C ile 40 °C arasında yer alan istenilen sıcaklığı korumak için ayarlayın. Bu ampirik bir sıcaklık aralığı için dolaşım banyosu ayarlayarak ve bir termokupla odasında sıcaklık ölçümü öncesinde önceden belirleyin.

2. Kas hazırlama

1. Fare ötenize
   1. Servikal dislocation takip karbon dioksit inhalasyon tarafından fare ötenize.
   2. Soğuk ringer çözeltisi ile arka ekstremite üzerinde cilt sprey hazırlık içine üfleme saç önlemek için. İnce Diseksiyon makas kullanarak uyluk etrafında kesme ve hızlı bir şekilde kasları açığa çıkarmak için #5 forseps kullanarak cilt aşağı çekerek cilt çıkarın.
   3. Arka ekstremite amputate ve oxygenized Ringer çözümü ile dolu olan bir diseksiyon çanak aktarmak ve sonra bir dürbün diseksiyon mikroskop altında yer.
2. Bir soleus kas hazırlanması
   1. Gasronemius kas yukarı bakan ile diseksiyon çanak aşağı arka ekstremite pin. Gastrorocnemius/soleus kas grubunun distal tendon kes ve ince makas kullanarak Gastroknemius kas her iki tarafında fasya kesip yavaşça ve yavaşça kasları kaldırın. Soleus kasının proksimal tendon serbest sonra ekstremite gelen gastrocnemius/soleus kas grubunu izole.
   2. Gasronemius kas ve distal tendon içeren kas grubu diseksiyon çanak aşağı pin. Proksimal tendon yoluyla yavaşça soleus kas kaldırın ve mümkün olduğunca soleus distal tendon kadar bırakarak Gastroknemius kas ayrı.
3. Bir ekstansiyon digitorium longus (EDL) kas hazırlanması
   1. Tibialis anterior kas yukarı bakan ile diseksiyon çanak aşağı arka ekstremite pin. Tibialis anterior (TA) kas boyunca fasya kes ve forseps kullanarak net çekin. TA kasının distal tendonu belirleyin ve keser. TA kas kaldırın ve EDL kas çekmeden dikkatle kesip.
   2. Diz lateral tarafı açık Cut ve iki tendon açığa. Kesme proksimal tendon, mümkün olduğunca tendon kadar hala kas bağlı bırakarak, ve EDL kas Lift (medial kas) yavaşça tendon çekerek. Maruz kaldığında distal tendonu kes.
4. Kas montajı
   1. Tendonlar üzerinden kas pin, ve mümkün olduğunca uzakta tüm ekstra yağ, fasya ve tendon Trim. Önceden bağlanmış bir düğüme bir tendon takın ve sütür bağlama forseps ile sıkıca kravat. Metal kanca etrafında ikinci düğüm bağlayın.
   2. Tendon diğer ucunda uzun kanca ile aynı prosedürü tekrarlayın. Kasların gövdesinin hiçbirinin dikişler ile temasa geçdiğinden emin olun. Bu hazırlık zarar verecektir.
   3. Kısa kancayı deneysel odanın altına ve uzun kancaya Çift mod kuvvet dönüştürücü/motora takın. 100% oksijen ile deneysel odasında kabarcık çözüm.
5. Stimülasyon protokolleri ve kas uzunluğunu optimize etme
   1. En iyi uyarıcı parametreleri bulmadan önce 15 ila 20 MN arasında bir temel gerginlik oluşturmak için dönüştürücü/motora bağlı Mikromanipülatör ayarlayarak kas Stretch. Stimülasyon voltajını 40 V 'ye ayarlayın. Uyarma akımı, Twitch kuvvetinde ek bir artış olmadığında sistematik olarak artar. En yüksek akım% 50 oranında artırıldı.
   2. En uygun uzunluğu bulmak, L₀, kas uzunluğu artırarak ve aktif kuvvet (tepe kuvvet eksi temel kuvvet) kadar tek bir Twitch ile kas aktive ederek, maksimum Twitch kuvvet vermek olarak tanımlanan ısı artan durur.
   3. Montajı test etmek için kısa bir tetanik kasılma (1 s aktivasyon) gerçekleştirin ve gerekirse kasını optimum temel kuvvete geri uzat. Bir Dijital kaliper ile mm olarak kas uzunluğunu kaydedin.

3. X-ışını kırması

Not: Aşağıdaki açıklama, Gelişmiş foton kaynağında BioCAT beayline 18ID küçük açı X-ışını kırılama enstrüman kullanılarak yapılan X-ışını kırılama deneyler için, Argonne Ulusal Laboratuvarı ama benzer yöntemler diğer Beam hatları üzerinde istihdam edilebilir gibi ID 02 ESRF (Fransa) ve BL40XU at SPring8 (Japonya). Beayline 18ID, tam kiriş saniyede ~ 10¹³ fotonların bir olay akı Ile 12 keV (0,1033 nm dalga boyu) sabit bir X-ışını ışın enerjisi ile çalıştırılır.

1. Dedektör mesafesine (kamera uzunluğu) bir numune seçin. 2,8 Nm Meridional yansımaları gibi 2,7 Nm aktin ve yüksek sipariş miyozin yansımaları inceleyerek deneyler için 1,8 m kamera uzunluğu kullanın. Öncelikle meridyen ve katman hatları üzerinde ince ayrıntılarla ilgilenen diğer deneyler için 4-6 m kamera kullanın
2. Numunenin ışın içinde konumunu optimize etme
   1. X ışınlarına yanıt olarak karanlık bir nokta üreten X ışını hassas kağıt parçası kullanarak kiriş konumunu belirlemek ("bir yanık"). Sonra kağıt üzerinde yanık işareti ile hizalanmış bir çapraz saç oluşturmak için bir video çapraz saç jeneratör kullanın ya da sadece bir işaret kalemi ile video ekranında bir işareti yapmak.
   2. Kullanarak BioCAT sağlanan grafik kullanıcı arayüzü örnek Pozisyoner için kas kiriş konumuna ortalanmış olmak için hareket ettirin. Pozlama sırasında kas üzerinde X-ışını dozu yaymak için örnek aşaması hareket ettirerek ~ 10-20 mm/s örnek odası osilat. Bu fasya büyük bölgeler önlemek için hareket gibi örnek gözlemlemek (dikesleme desenleri kirletecek kollajen içerir) ve onun seyahat tüm yol boyunca aydınlatılmış kalmasını sağlamak için.
      Not: Bölüm 3,3 ve 3,4 gerekli ayarları ve eylemleri beayline tarafından sağlanan grafik kullanıcı arabirimini kullanarak yapmak için gerekli tam adımlar Beam hattı ve dedektör spesifik olacaktır. Bu işlemlerin nasıl gerçekleştirileceği konusunda Beam hattı personeline sorun.
3. Tanımlanan statik durumlardaki Kasdan (dinlenme veya izometrik kasılma sırasında) yüksek çözünürlüklü desenler için CCD (şarj bağlantılı cihaz) dedektörü ayarlama
   1. Pozlama süresini ve pozlama süresini grafik kullanıcı arabiriminde kontrol yazılımına ayarlayın. Pozlama almadan önce karanlık bir arka plan görüntüsü alın ve her 2 saat veya Dedektör okuma elektroniği herhangi bir drift düzeltmek için pozlama süresi değiştirdikten sonra bu prosedürü tekrarlayın.
   2. X-Ray ışını, pozlama için istenilen değere hafifletin. Sonra bir görüntü alın. Bu dedektör ile görüntü dizileri almak mümkün değildir. CCD dedektörü de tek bir görüntüyü okumak için birkaç saniye gerekir.
4. Zaman çözülen bir deneme için piksel dizi dedektörü ayarlama
   1. Grafik Kullanıcı arabiriminde görüntü sayısını, pozlama süresini, pozlama süresini ayarlayın. Burada kullanılan piksel dizi dedektörü, okuma için en az 1 MS gereklidir. Foton sayım dedektörü için maksimum kare frekansı 500 Hz 'dir. X-ışını deklanşöre kontrol etmek için foton sayım dedektörü çıkış sinyalini kullanın.
   2. Işını istenilen yoğunluğa karşı zayıflatın. Dedektör kolu ve veri edinme sisteminden tetikleyici bekleyin. Mekanik ve röntgen verilerini aynı anda tetikleyerek senkronize edin. X-ışını desenleri, 1 MS pozlama süresi ve 2 ms pozlama süresi ile protokol boyunca sürekli olarak toplanır.
      Not: Tam pozlama süresi ve maruz kalma süresi, istenilen bilgiler ve ışın içindeki numunenin gözlenen ömrü nedeniyle bir durumda belirlenmelidir. Seçilen pozlama döneminde analizlenebilir veriler sağlamak için gerekli olandan daha fazla X-Ray ışını kullanmak için ışın zayıflatmak.

4. Post-deney kas tedavisi

1. Kurtarma ve her mekanik ve röntgen deneyi sonra kas tartmak. Ölçülen kas uzunluğu ve kas kütlesini kullanarak kas kesit alanını hesaplayın¹¹ bir kas yoğunluğu varsayarak 1,06 g/ml¹².
2. Kas deneysel uzunlukta Stretch ve 10 dk için% 10 formalin içinde kas düzeltmek. sabit kas tüm kas çapraz bölüm³boyunca konumlardan seçilen fiber demetleri bir dizi içine ayırın.
3. Bir video sarkomer uzunluğu ölçüm sistemi kullanarak sarkomer uzunluğunu ölçün.

Sonuçlar

Izometrik tetanik kasılma. Her türlü klasik kas mekanik deney, izometrik veya izotonik kasılmalar gibi, X-Ray desenleri eşzamanlı edinimi ile yapılabilir. Şekil 1 A , mekanik ve X-Ray denemeleri için deneysel kurulum gösterir. Şekil 1B'de izometrik tetanik kasılma için örnek bir kuvvet izi gösterilir. Kas 1 s için aktive önce 0,5 s için istirahat yapıldı. Mekanik kayıt uyarıcı sonra 1 s durur. X-ışını desenleri, 500 Hz 'de 1 MS pozlama süresi içinde protokol boyunca sürekli olarak toplanır.

X-ışını kırması desenleri. Kas X-ışını dikesasyon deseni sarcomere içindeki yapılardan nanometre çözünürlüğü yapısal bilgi verebilir. Kas X-ışını kırıklar desenleri Ekvator ve meridyen tarafından bölünmüş dört eşdeğer dörtgen oluşur. Ekvator deseni lif eksenine dik sarkomer içinde myofilament ambalajından doğar, merasyal desenler kas ekseni boyunca myofilamler yapısal bilgileri rapor ederken. Ekvator veya Meridyen üzerinde kalan yansımalar katman hatları olarak adlandırılır. Katman hatları (örn. Şekil 2A'da MLL4 ve ALL6 etiketli Özellikler), kalın filaminler ve ince filamin içeren aktin içeren miyosin içindeki moleküler alt unsurların yaklaşık olarak helisel olarak düzenlenmesini ortaya çıkar. Miyosin bazlı katman hatları, dinlenme kasından (Şekil 2A) gelen desenlerle güçlü ve keskindir, ancak actin tabanlı katman hatları, kasların akından gelen desenlerle daha belirgindir (Şekil 2B). Dinlenme desenini taahhüt deseninden çıkararak elde edilen fark desenleri (Şekil 2C) sağlıklı ve hastalıklı kaslarda kuvvet gelişimi sırasında yapısal değişikliklere ışık tutabilir. Kas kasılma sırasında moleküler olayların milisaniyelik zaman ölçeğinde Bu yapısal değişiklikleri takiben, X-ışını dikesasyon desenleri önemli yapısal bilgileri ortaya çıkarabilir (Şekil 2D).

MuscleX kullanarak veri analizi. Burada MuscleX paketinde "Ekvator" rutini kullanarak Ekvatorik yansıma analizinin bir örneğidir (Şekil 3). MuscleX, BioCAT¹³' de geliştirilen açık kaynaklı bir analiz yazılım paketidir. Ekvatorik yoğunluk oranı (ı_{1, 1}/i_{1, 0}), miyozin 'in dinlenme kasındaki aktin yakınlık göstergesidir (Şekil 3A), ancak sözleşmeli bağlı çapraz köprüler sayısı ile yakından ilişkilidir ( Şekil 3B) murine iskelet kas². Yoğunluk oranı, ben_{1, 1}/ı_{1, 0,} yaklaşık 0,47 dinlenme kas ve yaklaşık 1,2 taahhüt kas. İki 1, 0 yansıma (2 * S_{1, 0}) arasındaki uzaklık inter-filament aralığı için ters ilişkilidir. MuscleX için ayrıntılı belgeler ve kılavuzlar online¹³mevcuttur.

Şekil 1 : Mekanik ve X-ışını deneyi kurulumu ve protokolü. (A) kas deneysel oda içinde bir kanca bir ucuna ve diğer ucunda bir çift mod motor/kuvvet dönüştürücü monte edilir. X-ışınlarının geçmesine izin vermek için iki Kapton film pencereleri arasında tutulur. Oda, deneme boyunca% 100 oksijeni olan Ringer 'in çözeltisi ile doludur. (B) tetanik kasılma sırasında bir kas üzerinde X-ışını deneyleri için mekanik protokol. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 2 : EDL X-ışını kırması desenleri. EDL kas X-ışını dikesasyon deseni dinlenme (A) ve taahhüt (B) Kas. (C) dinlenme ve taahhüt deseni arasındaki fark deseni. Mavi bölge, dinlenme deseninde yüksek yoğunluğa sahip olmakla beraber, sarı bölge taahhüt deseninde yüksek yoğunluğu temsil eder. (D) EDL kas ile 1 MS pozlama X-ışını dikesasyon deseni. MLL1 = Ilk sipariş miyosin katman çizgisi; MLL4 = dördüncü sipariş miyosin katman çizgisi; ALL1 = Ilk sipariş akin katman çizgisi ALL6 = altıncı sipariş akin katman çizgisi; ALL7 = yedinci sipariş aktin katman çizgisi; TM = tropomyosin yansıması (beyaz kutuyla gösterilir); M3 = üçüncü sipariş Meridional yansıma; M6 = altıncı sipariş Meridional yansıma. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 3 : MuscleX kullanarak Ekvator desenleri veri analizi. Arka planda Ekvator yoğunluk oranı profili (alan) ve ilk beş sipariş (yeşil çizgiler) her zirvede yoğunluğunu hesaplamak için uygun idi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Tartışma

Bizim gruptan son yayınlar, fare iskelet kas X-ışını desenleri sağlık ve hastalık kas sarkomerik yapısal bilgi ışık tutmak için kullanılabilir gösterdi^1,2,3 özellikle çeşitli miyopatiler için genetik modifiye fare modellerinin artan kullanılabilirliği. Tek liflerde yüksek çözünürlüklü mekanik çalışmalar veya X-ışını kırması ile birlikte küçük paketler en iyi uzmanlar tarafından yapılır. Ancak, daha mütevazı mekanik bilgi amaçlarınız için yeterli olacaktır, tüm kas hazırlama basit bir hazırlık ayrıntılı X-Ray desenleri toplama sağlar.

Temiz bir diseksiyon başarılı bir kombine mekanik ve X-ışını deneyi için anahtarıdır. Bu kas parçaları gözyaşı ve düşük kuvvet yol olabilir beri diseksiyon sırasında soleus veya EDL kaslar ile ilgili hedef kas yanı sıra diğer kaslar çekmek için çok önemlidir. Ayrıca X-ışını desenlerini düşürebilecek hasarlı iç yapıya yol açabilir. Her şey X-ışını ışınında dağılacaktır beri, herhangi bir ekstra yağ uzak temizlik önemlidir, fasya içinde kollajen yanı sıra herhangi bir saç veya doku gevşek bit aşağıdaki Protokolü yaparken. Kas hazırlama ek uyumluluğu azaltmak için, aynı zamanda güvenli bir şekilde kas vücuda mümkün olduğunca yakın, kanca için tendonları kravat önemlidir.

Farklı X-ışını pozlama süreleri aynı kas bilgi farklı türde sağlayabilir. 18ID üzerinde tam kiriş kullanarak, bir analiz edilebilir Ekvator deseni 1 MS pozlama elde edilebilir (bkz. Şekil 2D). Bir çözümlenebilir ilk miyozin katman çizgi yansıma için, 10 MS toplam pozlama süresi genellikle gereklidir. M15 gibi daha yüksek sipariş Meridional yansımaları toplamak için (2,8 Nm miyosin Meridional yansıma) ve 2,7 Nm aktin Meridional yansıma, genellikle en az 1 s toplam pozlama gereklidir ama daha fazla 2 s toplam pozlama yüksek doğruluk için tavsiye edilir Ölçüm.

Deney için optimal röntgen dedektörü seçimi önemlidir. En ayrıntılı X-ışını desenleri için bir özelleştirilmiş CCD dedektör, BioCAT olarak CA. 40 μm piksel ve ~ 65 μm nokta Spread fonksiyonları phosphor, yüksek dinamik aralığı ve iyi uzamsal çözünürlüğü ile desenler sağlayabilir ama sadece bir seferde bir çerçeve alabilir. Zaman çözülen deneyler için, BioCAT 'taki foton sayma piksel dizi dedektörü 500 Hz 'de X ışını desenleri toplayabilir. Ancak bu dedektör ile 172 μm piksel boyutu, meridyenin iç kısmının ayrıntılı çalışmaları için yeterli uzamsal çözünürlük sağlamaz, ancak diğer amaçlar için yeterlidir. Biocat, 9.000 Hz 'lik maksimum kare hızında 75 μm gerçek çözünürlük sağlayan yüksek çözünürlüklü foton sayım dedektörü satın aldı. bu türün benzer dedektörleri önümüzdeki birkaç yıl içinde kas çalışmaları için akım dedektörleri yerini bekleniyor.

Üçüncü nesil synchrotrons X-ışınları çok yüksek Cereyanlar ile, radyasyon hasarı ciddi bir sorundur. İstediğiniz kırınım özelliklerini gözlemlemek için gerekli olandan daha fazla kiriş teslim etmek için kiriş hafifletmek için her zaman iyi bir seçimdir. Aynı toplam X-ışını pozlama, pozlama süresini zayıflatılmış bir ışından uzatarak elde edilebilir. Foton sayma piksel dizi dedektörleri bir avantajı bireysel Çerçeveler birlikte hiçbir gürültü cezası ile toplanır olabilir. O zaman bile radyasyon hasarı mümkündür. Radyasyon hasarı belirtileri kasılma maksimum kuvvet damla içerir, katman çizgi yansımaları bulaşmış, kas rengi bile değiştirmek.

Bozulmamış fare iskelet kas hazırlama sınırlamalarından biri deneyler sırasında bozulmamış kas sarkomer uzunluğu elde zorluk. Kaslar, video mikroskobu ve lazer kırması için çok kalın. Gelecekteki gelişmelerle birlikte, sarkomer uzunluğunu doğrudan kırılacak desenler¹⁴' ten tahmin etmek mümkün olabilir, yakın dönemde tek seçenek, burada açıklandığı gibi deneyden sonra ölçmek.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
#5 forseps	WPI	500342
4/0 cerrahi sütür	Braintree Sci	SUT-S 108
Akvaryum hava taşı	uxcell		bir evcil hayvan dükkanından alınan normal bir hava taşı iyi olurdu
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670
CCD dedektörü	Rayonix Inc	MAR 165 CCD
Verileri edinme sistemi	Aurora Scientific Inc	610A
Elastomer bileşiği	Dow Corning	Sylgard 184
Glikoz	Sigma-Aldrich	G8270
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Yüksek çözünürlüklü foton sayma dedektörü	Dectris Inc	EIGER X 500K
Yüksek güçlü iki fazlı akım stimülatörü	Aurora Scientific Inc	701
İris Makas	WPI	501263-G
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506
Mikro makas	WPI	503365
Motor/kuvvet dönüştürücü	Aurora Scientific Inc	300C-LR
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
Petri kabı	Sigma-Aldrich	CLS430167
Foton sayma dedektörü	Dectris Inc	Pilatus 3 1M
Paslanmaz Çelik tel	McMaster-carr	8908K21
Sütür Bağlama Forseps	WPI	504498
Video sarkomer uzunluk ölçüm sistemi	Aurora Scientific Inc	900 milyar