Burada, primer fibroblastlar kullanarak in vitro çizik testve farelerde in vivo deri yara iyileşmesi test için bir protokol salıyoruz. Her iki tahliller in vitro ve in vivo yara iyileşmesini değerlendirmek için basit yöntemlerdir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
In Vitro ve In Vivo In Vivo Analizi Yara İyileşmesi için Scratch Migration Tahlil ve Dorsal Skinfold Odası
Bu makalede
Özet
Özet
Bozulmuş kutanöz yara iyileşmesi diyabet hastaları ve yaşlılar için önemli bir endişe kaynağıdır ve etkili bir tedaviye ihtiyaç vardır. Uygun in vitro ve in vivo yaklaşımlar cilt yara iyileşme sürecini iyileştirmek için ilaç tedavileri için yeni hedef moleküllerin belirlenmesi için gereklidir. Voltaj kapılı kalsiyum kanallarının β3 alt birimini (Cavβ3) iki bağımsız tahlilde yara iyileşmesini etkileyebilecek potansiyel bir hedef molekül olarak belirledik, yani in vitro çizik göçü tahlilleri ve in vivo dorsal skinfold oda modeli. Birincil fare embriyonik fibroblastlar (MEFs) akut yabani tip (WT) ve Cavβ3-eksik fareler (Cavβ3 KO) veya fibroblastlar akut WT fareler siRNA ile tedavi izole aşağı-Cacnb3 genin ekspresyonunu düzenlemek için izole , Cavβ3 kodlama, kullanılmıştır. Bir çizik bir confluent hücre monolayer üzerine uygulandı ve boşluk kapatma göç eden hücreler tarafından boşluğun tam yeniden popülasyonkadar tanımlanan zaman noktalarında mikroskobik görüntüler alarak izledi. Bu görüntüler analiz edildi ve her durum için hücre geçiş hızı belirlendi. İn vivo bir testte, WT ve Cavβ3 KO farelere bir sırt derisi kalıbı yerleştirdik, 2 mm çapında tanımlanmış dairesel bir yara uyguladık, yarayı enfeksiyonlardan ve kurutunmaya karşı korumak için cam bir kapak kaymasıyla kapladık ve makroskopik yara nın kapanmasını izledik. zaman içinde. Cacnb3-gen eksikliği olan farelerde yara kapanması önemli ölçüde daha hızlıydı. In vivo ve in vitro tahlilsonuçları iyi korelasyon nedeniyle, in vitro tahlil in vivo yara iyileşme modeli ile in vitro isabet doğrulamadan önce yüksek iş itme taraması için yararlı olabilir. Burada yabani tip ve Cavβ3-eksik fareler veya hücreler için gösterdikleri Cavβ3 dışındaki belirli moleküller için de uygulanabilir.
Giriş
Cildin bütünlüğünü geri getirmek ve organizmayı enfeksiyonlardan korumak için cilt yaralanmasından hemen sonra cilt yaraiyileşmesi başlar. Yara iyileşme süreci dört örtüşen aşamadan geçer; koagülasyon, inflamasyon, yeni doku oluşumu ve doku remodeling1. Hücre göçü bu evrelerde çok önemlidir. İnflamatuar hücreler, bağışıklık hücreleri, keratinositler, endotel hücreleri ve fibroblastlar farklı zaman noktalarında aktive edilir ve yara bölgesini istila eder2. İn vitro ve in vivo yara iyileşmesini araştırma yöntemleri sadece altta yatan mekanizmaları anlamak için değil, aynı zamanda yeni ilaçları test etmek ve cilt yara iyile....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm deneysel prosedürler etik düzenlemelere ve Saarland ve Saarland Üniversitesi hayvan refahı komitelerine uygun olarak onaylandı ve gerçekleştirildi.
1 Birincil hücre kültürü ve siRNA transfeksiyonu
NOT: Açıklanan yöntemde primer fibroblastlar kullanılır. Bu hücreler yara iyileşmesi ve doku remodeling önemli bir rol oynamaktadır11. Bu deneyde, yüksek gerilim kapılı kalsiyum kanalları12 Cavβ3 alt birimi kodlama Cacnb3 geni aşağı düzenlenmiş, böylece in vitro hücre göçü ve in vivo cilt yara onarım rolünü gösteren4.
- SiRNA'nı....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Çizik telbette, yabani tip ve β3-eksik MEF'lerin(Şekil 1c)etkili bir hücre monotabakasıüzerinde yapıldı. 200 μL'lik pipet ucu kullanılarak "çizik" yaptıktan sonra, her iki genotipten hücreler çizilme alanına göç eder ve boşluğu kapatır. Görüntüler 6, 10 ve 30 saat sonraalınmıştır(Şekil 1a ). Hücre geçişi yüzde (%) olarak ölçüldü çizik yaptıktan 6 saat sonra göç eden hücreler tarafından yeniden doldurulur çizik alanı. Göç eden Ca.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu yazıda in vitro ve in vivo yara iyileşmesi tahsinini açıklar ve elde edilen sonuçları ilişkilendiriz. In vitro tsay için, biz yara iyileşmesi ve doku remodeling önemli bir rol oynayan birincil fare fibroblastlar4,14,15 kullanılır11. Monolayers olarak büyüyen diğer yapışık hücre tipleri (örn. epitel hücreleri, endotel hücreleri, keratinositler) de kullanılabilir. Uygun ve sağlıklı hücrelerin aynı sayıda.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Dr. Petra Weissgerber'e ve Tıp Fakültesi'nin SPF hayvan tesisinin Transgen Birimi'ne (SFB 894'ün P2 projesi) ve Homburg'daki Saarland Üniversitesi Tıp Fakültesi Klinik ve Deneysel Cerrahi Enstitüsü'ndeki hayvan tesisine teşekkür ederiz. Dr. Andreas Beck'e el yazmasının eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, Proje A3 a.B. ve V.F. tarafından finanse edilmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| % 0.9 NaCl | |||
| 1 ml şırınga | BD Plastipak | 303172 | |
| 6 oyuklu plaka | Corning | 3516 | |
| Biyopsi yumruğu | Kai Industries | 48201 | 2 mm |
| Cacnb3 Fare siRNA Oligo Dubleks (Locus ID 12297) | Origene | SR415626 | |
| Epilasyon kremi | herhangi bir epilasyon krem | ||
| Dekspantenol% 5 (BEPANTHEN) | Bayer | 3400935940179.00 | (BEPANTHEN) |
| Dihidroksilidinotiyazin hidroklorür (Ksilazin) | Bayer Health Care | Rompun 2% | |
| Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) | Gibco yaşam teknolojileri tarafından | 41966-029 | |
| Fetal sığır serumu | Gibco yaşam teknolojileri tarafından | 10270-106 | |
| Altıgen tam somun | |||
| Ketamin hidroklorür | Zoetis | KETASET | |
| Işık mikroskobu | Keyence, Osaka, Japonya | BZ-8000 | Benzer mikroskoplar kullanılabilir |
| Lipofektamin RNAiMAX Transfeksiyon Reaktifi | Thermo Fisher Scientific | 13778075 | |
| Mikro forseps | |||
| Mikro Makas | |||
| Fare tutucu | Ev yapımı | ||
| Normal makas | |||
| Amaç | Nikon | plan apo 10x/0.45 | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 51985-026 | |
| Polipropilen sütürler | |||
| Kaplaması dezenfektan (octeniderm) | Schü lke & Mayr GmbH | 118212 | |
| Oluklu peynir başlı vida | |||
| Çıtçıtlı halka | |||
| Çıtçıtlı pense | |||
| Kameralı cerrahi mikroskop | Leica | Leica M651 | |
| Deri katlama odası için titanyum çerçeveler | IROLA | 160001 | Halteblech M |
| Tel kazık |
Kaynaklar
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Martin, P. Wound healing--aiming for perfect skin regeneration. Science. 276, 75-81 (1997).
- Gabbiani, G., Gabbiani, F., Heimark, R. L., Schwartz, S. M.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
