Method Article

Tek-T hücreleri veya tek parçacık Immünolojik tek hücreli kuvvet spektroskopisi ile Atomic Force mikroskop Cantilevers functionalization

DOI:

10.3791/59609

⸱

July 10th, 2019

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences and School of Basic Medicine, Peking Union Medical College, 2Institute for Immunology, School of Medicine, Tsinghua University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz immunolojik çalışmalar için tek bir T hücresi ve boncuk parçacık ile Atomic Force mikroskop (AFM) konsol functionalize bir protokol sunuyoruz. AFM tarafından tek çifti T hücreli dendritik hücre bağlayıcılığı araştırması ve makrofajların gerçek zamanlı hücresel tepkisi ile AFM tarafından floresans görüntüleme ile tek bir katı parçacığın izlenmesi için prosedürler gösterilmektedir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Atomik kuvvet mikroskopisi bazlı tek hücreli kuvvet spektroskopisi (AFM-SCFS), yaşam hücrelerinin Biyofizik özelliklerini incelemek için güçlü bir araçtır. Bu teknik, hücreler, reseptör ve ligler arasında ve diğer birçok varyasyonların yanı sıra, canlı bir hücre membranında etkileşim kuvvetlerini ve dinamiklerini araştırarak sağlar. Ayrıca, belirli hücre aktivasyonu ve sonraki hücresel olayların canlı hücre ile kombine edildiğinde gerçek zamanlı olarak izlenmesi için izin, böylece bir spatiotemporally kontrollü bir şekilde tek hücrelerde fiziksel veya biyokimyasal uyarıcı teslim etmek için bir mekanizma olarak çalışır floresans görüntüleme. Bu AFM-SCFS ölçümlerinde anahtar adım AFM-Cantilever functionalization, ya da başka bir deyişle, konsol için ilgi bir konu iliştirmek. Burada, immünolojik çalışmalar için sırasıyla tek bir T hücresi ve tek bir polistiren boncuk ile AFM atölyeler değiştirmek için yöntemler sunuyoruz. Eski bir çözelti içinde düz bir konsol ucunu çiftler tek T hücreleri bir biyouyumlu tutkal içerir, ikincisi hava ortamında tek boncuk yapışma için bir epoksi tutkal dayanır iken. Her bir konsol modifikasyonu ile ilişkili iki immünolojik uygulama da sağlanır. Burada açıklanan yöntemler, farklı hücre türlerine ve katı parçacıklara kolayca adapte edilebilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Atomic Force microkopi (AFM), çok yönlü bir araç, hücre Biyoloji araştırma1,2,3,4,5birçok uygulama buldu. Yüksek çözünürlüklü görüntüleme özelliğinden farklı olarak, doğal kuvvet yoklama özelliği, yaşam hücrelerinin Biyofizik özelliklerinin, tek hücreli6,7' de doğrudan situ 'da araştırılmasını sağlar. Bunlar, alt hücreli yapıların sertlik ve hatta tüm hücreler8,9,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fare deney Protokolü Tsinghua Üniversitesi hayvan bakım kurallarını takip

1. tek T hücreleri ile konsol functionalization

  1. Fare dalak hücreleri hazırlama
    1. Karbon dioksit kullanarak fare (8-16 yaş (ya seks); Örneğin, C57BL/6 strain) feda, servikal dislocation izledi.
    2. 75% etanol ile fareyi temizleyin ve splenektomi takiben orta çizgi cilt kesi yapın.
    3. Cam kaydırakları kullanarak% 2 fetal sığır serumu (FBS) içeren 4 mL PBS 'de dalağı homojenize ederek, hücre süspansiyonunu 70 μm kafes naylon süzgecinden geçirerek toplar ve kalıntıları çıkarın.
    4. 5 dakika boyunca 500 x g 'de hücre süspansiy....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 4A , tek T hücresi Ile tek DC arasındaki bağlama etkileşiminden tipik kuvvet uzaklığı eğrilerini bir yaklaşım geri çekilme döngüsünde gösterir. Açık kırmızı eğrisi uzatma eğrisidir ve koyu kırmızı olan geri çekme eğrisidir. Uzantı eğrisi genellikle girintileme veya rijitlik analizi için kullanılındığı için, burada yalnızca geri çekme eğrisi hücre yapışma için ilgilidir. Eğrinin minimum değeri (yeşil daire) Maksimum yapışma gücünün bir ölçüsünü verir. Eğ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AFM tabanlı tek hücreli kuvvet spektroskopisi, yaşayan hücrelerin Biyofizik özelliklerini ele almak için güçlü bir araç olarak gelişti. Bu uygulamalar için, konsol ilgi hücrelerinde belirli etkileşimleri veya özellikleri araştırma için düzgün işlevselleştirilmiş olması gerekir. Burada, tek T hücresi ve tek mikron büyüklüğünde boncuk için ucu-Less konsol bağlama yöntemleri sırasıyla açıklanmıştır. Tek bir T hücresi eklemek için, hücre yapıştırıcı olarak biyouyumlu bir tutkal seçildi. Deniz musinden çıkarılan özel olarak f.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Ulusal Doğal Bilim Vakfı Çin genel programı (31370878), devlet anahtar programı (31630023) ve yenilikçi araştırma grubu programı (81621002) tarafından desteklenmektedir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

2

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
< güçlü > Malzeme< / güçlü >
10 & mu; l pipet ucuThermo Fisher104-Q
15 ml tüpCorning430791
6 cm çapında kültür kabıNALGENE nunc150462
6 oyuklu kültür plakasıJETTCP011006
AFM KonsolNanoWorldOk-TL1-50uçsuz konsol
ve beta;-MerkaptoetanolSigma7604
Biyouyumlu yapıştırıcıBD Cell-Tak354240
CD4 + T hücre izolasyonu KokteylSTEMCELL19852C.1
DC2.4 hücre hattıK. Rock'tan bir hediye (Massachusetts Üniversitesi Tıp Fakültesi, Worcester, MA)
Dekstran kaplı manyetik parçacıklarKÖK HÜCRESV30010
EDTAGENErayGeneray-E1101-500 ml
EpoksiERGO7100
Etanoltwbio00019
FBSEx Cell BioFSP500
FcR engelleyiciSTEMCELL18731
Cam lamelyerel satıcı (Hai Men Lian Sheng)HX-E3724mm çap, 0.17mm incelik
Cam kaydıraklarJinTong laboratuvar ve ekipman yönetimi bölümü, Haimen Yoközelleştirilmiş
H < alt > 2 < / alt > O < alt > 2 < / alt > (% 30)Çin eczanesi10011218
H < alt >2 < / alt > SO< alt > 4< / alt >Çin eczanesi80120892
HEPESSigma51558
MıknatısSTEMCELL18000
Mesh naylon süzgeçBD FalconREF 352350
Moesin-EGFPN/Alaboratuvarda klonlanmış
Fare CD25 Treg hücre pozitif izolasyon kitiSTEMCELL18782Bileşen: FcR Engelleyici, Düzenleyici T hücresi Pozitif Seçim Kokteyli, PE Seçim Kokteyli, Dextran RapidSpheres,
Fare CD4 + < / sup> Tcell izolasyon kitiSTEMCELL19852Bileşen: CD4 + T hücre izolasyon Kokteyli, Streptavidin RapidSpheres, Sıçan Serumu
NaOHLanyi kimyasal ürünler co., LTD? Pekin1310-73-2
PBSSolarbioP1022-500
PE seçim kokteyliSTEMCELL18151
Penisilin-StreptomisinHidroklonSV30010
PLCδ-PH-mCherryAddgene36075
Polistiren mikroküreler 6.0μ mPolysciences07312-5
polistiren yuvarlak alt tüpBD Falcon352054
Sıçan serumuSTEMCELL13551
RAW264.7  ATCC
Rekombinant İnsan İnterlökin-2PeprotechPeprotech, 200-02-1000
Kırmızı kan hücresi lizis tamponuBeyotimeC3702
Düzenleyici T hücresi pozitif seçim kokteyliSTEMCELL18782C
RPMI 1640YaşamC11875500BT
Numune odasıEv yapımı
Streptavidin kaplı manyetik parçacıklarSTEMCELL50001
Transfeksiyon kitiClontech631318
Tripsin% 0.25 EDTALife25200114
CımbızJDN/A
NameCompanyKatalog Numarası< strong>Comments
>Equipment
20x objektif NA 0.8Zeiss420650-9901Plan-Apochromat
Atomik kuvvet mikroskobuJPKcellHesion200
SantrifüjBeckman coulterAllegra X-12R
Floresan görüntülemeZeiss mikroskop standına dayalı ev yapımı objektif tipi toplam iç yansıma floresan mikroskobu
Nemlendirilmiş CO inkübatörü Thermo Fisher HERACELL 150i Ters ışık mikroskobu Zeiss Observer A1 kılavuzu

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Benoit, M., Gabriel, D., Gerisch, G., Gaub, H. E. Discrete interactions in cell adhesion measured by single-molecule force spectroscopy. Nature Cell Biology. 2 (6), 313-317 (2000).
  2. Chen, J., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Atomic Force MicroscopySingle Cell Force SpectroscopyAFM Cantilever FunctionalizationT Cell AdhesionPolystyrene Bead AttachmentBiocompatible Glue ApplicationEpoxy Glue MethodDendritic Cell InteractionImmune Synapse FormationForce Distance Curves

Related Articles