Yöntem makalesi

Endotel hücrelerinden RNA yalıtım için Ribosome affinity arıtma (TRAP) çevirisi In vivo

DOI:

10.3791/59624

⸱

25 Mayıs 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Blood Research Institute, Blood Center of Wisconsin, 2Department of Medicine, Medical College of Wisconsin, 3Department of Surgery, The University of Alabama at Birmingham, 4Department of Biomedical Engineering, The University of Alabama at Birmingham, 5GBS Program, Graduate School, The University of Alabama at Birmingham

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eğer RNA arıtma ile birlikte ribozomlarda içinde gelişmiş yeşil floresan proteinin (EGFP) EC özgü genetik etiketi ile doğrudan fare beyin, akciğer ve kalp dokularda vasküler endotel hücrelerden (ECS) ribosome bağlı mRNA arındırmak için bir yaklaşım sunuyoruz .

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birçok çalışma, in vitro hücresel kullanım ve tüm dokularda veya qPCR ve RNA sıralamaları ile transkriptom ve Gen ifadesinin in vitro analizi için hayvanlardan belirli hücre türlerinin yalıtılması ile sınırlıdır. Kompleks dokularda ve organlardaki spesifik hücre türlerinin kapsamlı transkriptom ve gen ifadesi analizi, genlerin düzenlendiği ve doku homeostaz ve organ ile ilişkisini gösteren hücresel ve moleküler mekanizmaları anlamak için önemli olacaktır. Işlev. Bu yazıda, bir örnek olarak hayvan akciğerleri vasküler endotelinde doğrudan içinde vivo ribosome bağlı RNA yalıtım metodolojisi göstermektedir. Doku işleme ve RNA arıtma için özel malzeme ve yordamlar, RNA kalite ve verim yanı sıra gerçek zamanlı qPCR arteriogenic geni için değerlendirilmesi de dahil olmak üzere tarif edilecektir. Ribozom yakınlık arıtma (Trap) tekniği tercüme olarak bilinen bu yaklaşım, karmaşık dokularda herhangi bir belirli tip doğrudan in vivo gen ifade ve transkriptom analiz belirli hücre türlerinin karakterizasyonu için kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Meme beyni, kalp ve akciğer gibi kompleks dokularda, yüksek seviyede hücresel heterojenlik, tüm doku örneklerinden elde edilen gen ifade verilerinin analizini zorlaştırmaya çalışmaktadır. Belirli bir hücre türü içinde vivo gen ifade profillerini gözlemlemek için, yeni bir metodoloji son zamanlarda, hangi tüm tercüme mRNA herhangi bir genetik olarak tanımlanan hücre türünün tamamlayıcı sorgulama sağlar geliştirilmiştir. Bu metodoloji tercüme ribozom benzeşimi arıtma (Trap) tekniği1,2olarak bilinir. Genetiği değiştirilmiş diğer anjiyogenesis ile birlikte zaman endotel hücre biyoloji ve anjiyojenezi incelemek için yararlı bir araçtır hayvanlar.

Anjiyojenik PKD-1 sinyalizasyon ve anjiyojenik gen CD36 transkripsiyonu endotel hücre (EC) farklılaşma ve fonksiyonel anjiyogenez3,4,5,6için kritik olduğunu göstermiştir. Gen transkripsiyonu ve EC transfarklılaşmasında anjiyojenik ve metabolik sinyalizasyon moleküler mekanizmalarını belirlemek için, TRAP tekniği temelinde özellikle silinmiş anjiyojenik genler ile genetik olarak tasarlanan TRAP fareler oluşturduk1 , 2. dahası, bizim Trap hayvanlar, sadece onlar PKD-1 veya cd36 gen eksikliği vasküler endotelinde veya cd36 geni küresel silme, ancak gelişmiş bir yeşil floresan protein (EGFP) aynı zamanda genetik üzerine Etiketlenmiş AK 's tercüme ribosomes. TRAP, doğrudan ribosome bağlı mRNA 'nın, hedeflenen dokuların vasküler endothelinden, Gen ifadesinin analizine ve EC farklılaşması ile ilişkili yeni transcriptomlerin tanımlanmasına imkan tanır. doğrudan in vivo koşullarda anjiyogenez. Genetik olarak tasarlanan bu hayvanlarda endotelinde 'dan ribosome bağlı RNA 'yı başarıyla izole ettik. Arıtılmış RNA, ak farklılaşma ve fonksiyonların düzenlenmesinde anjiyojenik veya arteriojen genlerin daha fazla karakterize edilmesi için kullanılabilir. Bu protokol, doğrudan in vivo ECs içinde mRNA yalıtımı için TRAP yaklaşımı uygulamak için adım adım bir kılavuz sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan deneyleri için burada açıklanan tüm yöntemler Wisconsin tıp Koleji kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. reaktifler hazırlayın

  1. Lizis arabelleği 10 mm HEPES, pH 7,4, 150 mm KCL, 5 mm MgCl2, 0,5 mm DTT, 100 mg/ml cycloheximide, proteaz inhibitörleri ve rekombinant RNase inhibitörleri konsantrasyonları aşağıda açıklandığı gibi hazırlayın.
    1. 500 mL RNase içermeyen deiyonize su için aşağıdaki reaktifler ekleyin: 1,19 g HEPES, 5,59 g KCl, 0,24 g MgCl2, 35 mg dtt, 0,5 ml cycloheximide, ve NaOH kadar gerektiğinde pH 7,4, EDTA-ücretsiz proteaz inhibitörleri (bir mini tablet başına 10 ml) ve RNase inhibitörü (1 0 μL/mL).
    2. 1 aya kadar 4 °C buzdolabında saklayın.
  2. 10 mM HEPES, pH 7,4, 350 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1% vol/Vol CA-630, 0,5 mm dtt ve 100 mg/ml cycloheximide konsantrasyonlarına yüksek tuz polysome yıkama tamponu hazırlayın.
    1. 500 mL RNase içermeyen deiyonize su: 1,19 g, KCl 'nin 13,05 g 0,24, MgCl2, 5 ml Noniyonik, non-denaturing deterjan, 5, 7,7 mg tüpler dtt ve 0,5 ml jıpheximide ve NaOH pH 7,4 kadar gerektiğinde aşağıdaki reaktifler ekleyin.
    2. 1 aya kadar 4 °C buzdolabında saklayın.
  3. Anti-GFP antikor protein G manyetik boncuk önce deney başlamadan bağlayın.
    1. 10 mg Anti-GFP antikor ekleyin 200 mL PBS protein G boncuk seyreltilmiş.
    2. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca son rotasyona son olarak inküye.
    3. Bir manyetik raf üzerinde boncuk yerleştirin ve supernatant çıkarın.
    4. 200 mL PBS 'de boncukları askıya alın ve 1 haftaya kadar 4 °C buzdolabında saklayın.
  4. 100 mg/mL cycloheximide ile buz soğuk PBS hazırlayın.
    1. 1 cilt sikloheksimit çözeltisi ekleyin (100 mg/ml) için 99 hacimleri buz-soğuk PBS.

2. istenilen dokularda izole ve Lyse

  1. Ketamin IP enjeksiyonu (500 mg/kg/vücut ağırlığı) ve xylazine (10 mg/kg/vücut ağırlığı) ve istenen dokulara (örn. kalp, akciğer) göre ötenize fareler. Hemen sonraki adıma geçin.
  2. 100 mg/mL cycloheximide ile 500 mL buz-soğuk PBS içine istenilen dokulara yerleştirin.
  3. Motor tahrik Homogenizer veya küçük bir boşluk cam Homogenizer ile bir hücre süspansiyonu içine Mince doku. Eğer motor odaklı bir Homogenizer kullanıyorsanız, homojenizasyonu, RNA denatürasyonunu önlemek için düşük frekansa (< 15000 Hz) 1 dakikadan az olarak sınırlandırın.
  4. 200 mL liziz tamponunun pipetleme ve tamponu birkaç kez yeniden çizerek hücre peleti askıya alın. Daha fazla hücre süspansiyon küçük bir boşluk cam Homogenizer 10 vuruş ile veya düşük frekanslı 15 saniye (< 15000 Hz) bir motor tahrik Homogenizer ile homojenize.
  5. Santrifüjler 10 dakika 2.000 x g 'de 4 °c ' de Pelet çekirdekleri ve büyük hücre enkaz ve supernatant tutmak için homojenatlar.
  6. % 1 vol/Vol ve DHPC 'ye 30 mM 'ye kadar Noniyonik, non-denaturing deterjan ekleyin. 5 dakika boyunca buzun üzerinde inkübe.
  7. Santrifüjü lysate 10 dk at 16.000 x g için Pelet çözünmez malzeme. Gelecekteki adımlara giriş olarak net lysate 'nin% 15 'ini aktarın ve saklayın.

3. ribosome/mRNA kompleksini izole etme

  1. Hücre-lysate süpernatant için antikor bağlı boncuk 50 ml ekleyin ve 30 dakika boyunca uçtan uca rotasyon ile 4 °c ' de inkübe karışımı. Burada anti-GFP antikorları GFP-Tagged ribosomes bağlamak olacak, bize daha fazla bu ribosomes RNA izole sağlar.
  2. Bir manyetik raf üzerinde boncuk toplamak ve yüksek tuz polysome yıkama tampon ile 5 kez yıkayın.
    1. Çizmek ve boncuk tüp tarafında toplanan bir kez sıvı atın. Sonra pipet ve 200 mL yüksek tuz polysome yıkama tampon birkaç kez kadar yeniden çizin. Bu adım 5 kez yineleyin ve son yineleme aşağıdaki tüm arabellek atın. Hemen sonraki adıma geçin.

4. mRNA 'yı izole et

  1. RLT arabelleğine boncuk yerleştirin. Aşağıdaki adımlar doğrudan RNeasy mini Kit protokolünden alınır ve herhangi bir şekilde genişletilmemiş.
    Dikkat: RLT tampon guanidin tuzları içerir; Çamaşır suyu ile karıştırmayın.
  2. 4 °C ' de tam hızda 13.000 rpm veya 16.000 g 'de 3 dakika santrifüj lysate. Dikkatle pipetleme tarafından 350 ml süpernatant kaldırmak ve yeni bir mikrofuge tüp aktarmak. Sonraki adımlarda yalnızca bu süpernatant (Lysate) kullanın.
  3. Mikrofuge tüpüne 70% etanol eşit hacim ekleyin.
  4. 2 mL 'Lik bir toplama tüpüne yerleştirilen bir spin sütununa oluşan herhangi bir çökelme de dahil olmak üzere örnek 700 mL 'ye kadar aktarın. Kapak hafifçe kapatın ve 15 s için santrifüjler ≥ 8.000 x g spin sütun membran yıkamak için. Akış yoluyla atın.
  5. 350 mL arabellek RW1 döndürme sütuna ekleyin. Kapak hafifçe kapatın ve 15 s için santrifüjler ≥ 8.000 x g spin sütun membran yıkamak için. Akış yoluyla atın ve sonraki adımda toplama tüpü yeniden kullanın.
    Dikkat: arabellek RW1 guanidin tuzları içerir; Çamaşır suyu ile karıştırmayın.
  6. 350 mL arabellek RW1 döndürme sütuna ekleyin. Kapağı hafifçe kapatın ve 15 sn için Santrifüjü ≥ 8.000 x g 'de çıkarın . Akış yoluyla atın.
  7. 500 mL arabellek RPE döndürme sütuna ekleyin. Kapak hafifçe kapatın ve 15 s için santrifüjler ≥ 8.000 x g spin sütun membran yıkamak için. Akış yoluyla atın.
  8. 500 mL arabellek RPE döndürme sütuna ekleyin. Hafifçe kapağını kapatın ve 2 dakika için Santrifüjü ≥ 8.000 x g 'de spin sütun membranı yıkayın. Sonra dikkatle döndürme sütunu koleksiyon tüpten kaldırmak, sütun akış ile temas etmez sağlamak.
  9. Spin sütununu yeni 2 mL 'Lik bir toplama tüpüne yerleştirin ve eski tüpü akış yoluyla atın. Kapağı yavaşça kapatın ve kalan tamponu kaldırmak için 1 dakika boyunca tam hızda santrifüjün.
  10. Spin sütununu yeni bir 1,5 mL toplama tüpüne yerleştirin. 30-50 mL RNase içermeyen suyu doğrudan spin sütun membrana ekleyin. Hafifçe kapağı kapatın ve 1 dk için santrifüjün ≥ 8.000 x g RNA elute için.
  11. Beklenen RNA verimi > 30 mg ise, adım 4,10 başka bir 30-50 mL RNase-Free su ile tekrarlayın veya adım 4,10 (yüksek [RNA] gerekiyorsa) elute kullanarak. Adım 4,10 ' dan toplama tüpünü yeniden kullanın.
  12. RNA sıralaması veya gerçek zamanlı niceliksel PCR ya da 1 yıla kadar RNase-Free H2O at-80 °c ' de çözünen RNA gibi aşağı akış analizi için arıtılmış RNA kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Önceki çalışmalarımız4,7 , CD36, LPA/PKD-1 sinyalizasyon yolu ile arterioler farklılaşma ve kapiller arterializasyonu için bir anahtar olarak işlev gösterebilir. LPA/PKD-1-CD36 sinyalizasyon ekseninin aksı in vivo için gerekli olup olmadığını incelemek için, sadece küresel CD36 eksikliği veya endotel-spesifik-CD36-veya PKD-1 eksikliği olan roman tuzak hatları kurduk, aynı zamanda seçici izolasyon izin CRE işaretli hücre dizinden GFP tarafından ribosome bağlı RNA ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anjiyojenez, EC 'e özgü anjiyojenik Gen transkripsiyonu ve ifadesinin ak farklılaşma ve anjiyojenik reprogramlama3,4' te önemli bir rol oynadığı karmaşık bir çok adımlı süreçtir. Bir moleküler düzeyde memelili vasküler sistemin fonksiyonunu daha iyi anlamak için hücresel çeşitlilik ve mimari karmaşıklığı engelleri aşmak için, biz EC özgü TRAP fareler oluşturduk, EC özgü cd36 ile birlikte , EC özgü PKD-1 eksikliği veya küresel cd36 eksi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, hiç bir ilgi çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr Ren 'in çalışmaları Amerikan Kalp Derneği tarafından desteklenmektedir (13, 14800019; BR), Ann 'in umut Vakfı (FP00011709; BR), Amerikan Kanser Derneği (86-004-26; MCW Kanser Merkezi BR) ve Ulusal Sağlık Enstitüsü (HL136423; BR); Jordan Palmer 2018 MCW CTSı 500 yıldız staj programı tarafından desteklenmektedir; P. Moran, NHLBı 'dan (5T35 HL072483-34) kurumsal araştırma eğitim hibe tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2100 Nanoçipli ve Picochipli Elektroforez BiyoanalizörüAgilentG2939AA, 5067-1511 & 5067-1513
Hücre sıyırıcılarSarstedt83.1832
HomojenizatörlerFisher ScientificK8855100020
Mıknatıs (Dynamag-2)Invitrogen123-21DSaflaştırma ölçeğine bağlı olacaktır; 1.5 mL'lik tüplerdeki numuneler konsantre edilebilir a DynaMag-2
MinisantrifüjFisher Scientific05-090-100
NanoDrop 2000C spektrofotometreThermo Scientific ND-2000C
1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri için rotorlusantrifüjEppendorf5430R
RNaz içermeyen 1.5 mL mikrosantrifüj tüpleriUygulamalı Biyosistemler 
Rnaz içermeyen 50 mL konik tüplerUygulamalı Biyosistemler 
RNaz içermeyen 1000-μ l filtre uçlarıRaininRT-1000F
RNase içermeyen 200-μ l filtre uçlarıRainin RT-200F
RNaz içermeyen 20-μ l filtre uçlarıRainin RT-20F
Homojenizatörler için rotorYamato LT-400D
Tüp döndürücü, Labquake markaThermo Fisher13-687-12Q
soğutmalıAM12450AM12501

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).
  2. Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
  3. Best, B., Moran, P., Ren, B. VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan. Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).
  4. Ren, B., et al. LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming. Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).
  5. Ren, B. Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37(2016).
  6. Ren, B. FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis? Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).
  7. Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model. Nucleic Acids Research. 42, e14(2014).
  8. Dong, L., et al. Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling. Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).
  9. Ren, B., et al. ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).
  10. Skuli, N., et al. Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes. Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Endotelyal H cre RNA zolasyonun Vivo Transkriptom AnaliziTRAP Tekni iRibozoma Ba l RNA PurifikasyonuGFP Etiketli RibozomlarMotorlu Homojenizat rAnti GFP Antikor BoncuklarRNA Kalite De erlendirmesiReal Time qPCR

İlgili makaleler