Yöntem makalesi

İnsan blastosist biyopsisi ve vitrifikasyon

DOI:

10.3791/59625

⸱

26 Temmuz 2019

 ,  ,  ,  , 
1G.EN.E.R.A. Centers for Reproductive Medicine, 2DAHFMO, Unit of Histology and Medical Embryology, Sapienza University of Rome

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Preimplantasyon Genetik testlerini verimli bir şekilde yürütmek için blastosist biyopsisi ve vitrifikasyon gereklidir. Zona pellucida ve 7-8 troectoderm hücrelerinin alma gün 5-7 Post-döllenme sıralı açılışı gerektiren bir yaklaşım, hem gerekli manipülasyonlar sayısını ve alt optimum çevresel koşullara embriyonun maruz kalma sınırlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Preimplantasyon genetik testleri ile ıVF döngüleri sırasında güvenilir bir genetik tanı elde etmek için blastosist biyopsisi gerçekleştirilir. Daha sonra, ideal iş akışı, teşhis tekniklerinin dönüş süresi nedeniyle ve seçilen embriyo (lar) ı aşağıdaki doğal döngüde fizyolojik endometriyum üzerine aktarmak için güvenli ve verimli bir vitrifikasyon Protokolü gerektirir. Zona pellucida 'nın sıralı açılmasını ve 5-10 troektoderm hücrelerinin (ideal 7-8) alınmasını kapsayan bir biyopsi yaklaşımı, hem gerekli manipülasyon sayısını hem de embriyonun alt-optimum çevresel koşullara maruz kalmasını sınırlar. Uygun eğitim sonra, teknik biyopsi zamanlaması açısından farklı operatörler arasında tekrarlanabilir oldu (~ 8 dakika, değişen 3-22 min embriyoların sayısına bağlı olarak biyopsi için tabak), kesin tanı elde (~ 97,5%) ve canlı Doğum oranları sonra vitrifiye-ısıtılmış euploid blastosist transfer (> 40%). Biyopsi sonrası hayatta kalma oranı, vitrifikasyon ve ısınma% 99,8 kadar yüksek oldu. Isınma 1,5 h yeniden genişleme oranı gibi yüksek oldu 97%, büyük ölçüde biyopsi ve vitrifikasyon arasındaki zamanlamaya bağlı (ideal ≤ 30 dk), blastosist morfolojik kalite ve biyopsi günü. Genel olarak, çökmüş bir blastokist vitrify daha iyidir; Bu nedenle, PGT olmayan döngüleri, lazerle destekli suni daralma embriyo çöküşü önce ağoprezervasyon için yapılabilir. En umut verici gelecek perspektif, blastosist kültürden sonra, embriyonik DNA 'nın bir kaynağı olarak ıVF kültür ortamının non-invaziv analizidir. Ancak, bu potansiyel Avant-garde hala soruşturma altında ve güvenilir bir protokol henüz tanımlanması ve doğrulanması gerekir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modern insan EMBRİYOLOJİSİ ana amacı, uyarı döngüsü başına sayı canlı doğumları maksimize etmek ve maliyetleri azaltmak için, zaman ve çabaları bir hamilelik elde etmek. Bu hedefi başarmak için, bir IVF döngüsü sırasında elde edilen bir kohort içinde üreme yetkin embriyoları belirlemek için embriyo seçimi için onaylanmış yaklaşımlar kullanılmalıdır. Son kanıtlara göre, blastosist kültür1 kapsamlı kromozomal test ve vitrifiye-ısıtılmış euploid embriyo transferi ile KOMBINE (et) IVF verimliliği artırmak için en verimli çerçeve2. Belli ki, aneuploidyen testi, günümüzde çoğunlukla troektoderm 'den (TE) alınan birkaç hücreden temsil edilen bir embriyonik numune gerektirir, yani gebelikte embriyo eklerine (örn. plasenta) kökeni veren blastosist bölümü . Karyotip analizinin ötesinde, aynı zamanda tek gen mutasyonları, preimplantasyon genetik testleri (PGT;-aneuploidies için A-SR, yapısal kromozomal yeniden düzenlemeleri için-M monojenik hastalıklar için) olarak bilinen bir klinik strateji parçası olarak bir TE biyopsisi ile değerlendirilebilir. Diğer ooksit/embriyo biyopsisi yöntemleri teorik olarak son yıllarda klinik olarak benimsenmiştir, yani kutup organları biyopsisi ve plastomer biyopsisi. Ancak, günümüzde prosedürel dezavantajları (örn. daha yüksek iş yükü ve üreme etkisi riski) ve tanı sınırlamaları (örn. tek hücreli analiz sorunları) dolaylı olarak maliyetler, riskler ve (bir inceleme için bkz:3).

Bu yazıda, TE biyopsisi için ana protokollerden biri, sonraki vitrifikasyon, ısınma ve Transfer prosedürleri ile birlikte iyice tarif edilir. Burada özetlenen iş akışı, yoğun bir PGT ünitesi için idealdir.

Zaten bizim grup4,5tarafından önceden açıklanan, prosedür tam genişletilmiş blastosist ve birkaç te hücrelerinin kaldırılması zona pellucida sıralı açılış içerir (ortalama 7-8). Günde 3 lazer destekli hatching tabanlı blastosist biyopsi yöntemi6ile karşılaştırıldığında, bu prosedür blastosist biyopsisi ve vitrifikasyon gibi hassas prosedürlerin zamanında gerçekleştirilmesi gereken bir IVF biriminin günlük zamanlamasını kolaylaştırabilir. Blastokist tam genişlemesine ulaştığında biyopsi, kaldırmak için TE hücrelerini seçerek, böylece iç hücre kütlesinin (ICM) herniasyon riskini önleyerek, aksi takdirde prosedürü zorlu hale getiren bir şekilde yapılabilir. Literatürde, embriyo zaten blastosist aşamaya ulaştığında, prosedür5,7' den birkaç saat önce, lazer destekli hatching gerçekleştirilmesini içeren, Blastokist biyopsinin üçüncü bir protokolü de tanımlanmıştır. Bununla birlikte, bu yaklaşım daha zaman alıcı ve ağırlıklı olarak deneyimli operatörler ve orta-düşük günlük iş yükü görünümünde TE biyopsisi uygulayan ıVF ünitelerinde kullanılır.

Intrakyasmatik sperm enjeksiyonu (ıCSı)8 , IVF 'de genetik analizler yapmaya nişan alırsanız konsolide bir teknik olmalıdır. Benzer şekilde, blastosist aşamaya güvenli bir şekilde embriyolar toplamak için uygun bir kültür sistemi, TE biyopsi stratejisinin uygulanması için çok önemlidir. Düşük oksijen geriliminin kullanımı, yeterli sayıda kulkısım, Blastokist oranını tehlikeye atmayın, bu amaçla anahtar önkoşullardır9. Aynı zamanda, bir PGT döngüsünü güvenli bir şekilde yönetmek için etkili bir ağoprezervasyon programı gereklidir. Son on yılda, vitrifikasyon uygulanması embriyo Cryo-hayatta kalma oranları bile > 99%10,11artırdı. Bu, genetik testler yapmak ve embriyo transferini aşağıdaki menstrüel döngüye ertelemek için yeterli zaman sağladı, uyarılamayan ve muhtemelen daha fazla reseptif endometrium12.

Her iki TE biyopsi ve vitrifikasyon sıkı becerileri gerektiren görevleri talep ve etkinliğini olmayan operatörler arasında farklılık gösterebilir. Bu nedenle, her operatörün bu prosedürleri klinik olarak gerçekleştirmesine izin vermeden önce belirli bir eğitim süresi savunulmuş; Dahası, operatörün becerilerini bakım, ağoprezervasyon ve biyopsi prosedürleri için anahtar performans göstergelerini (KPI) izleyerek periyodik olarak değerlendirilmelidir. Her bir ıVF Kliniği, uluslararası konsorsiyum ve/veya referans laboratuvarları tarafından yayımlanan sonuçlar tarafından yayımlanan olanları yaklaşık olmalıdır bu amaçla iç KPI 'Leri ayarlamanız gerekir.

TE biopsi, vitrifikasyon-ısınma ve tanık prosedürleri bizim ünitede, bu üç önceki yayınlarda bildirilen gibi tüm operatörler arasında standardize edilmiş teknikler doğrulandı11,13,14 .

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan blastosist biyopsisi için protokol, burada açıklanan, G. EN. E.R.A. Insan araştırma etiği Komitesi yönergelerine uyur.

Not: Gerekli malzemeler için malzeme tablosuna bakın. Daha fazla malzeme gerekli laboratuvar Ayakkabı ve kıyafet, cerrahi facemask, saç örtüsü, cerrahi eldiven, kalıcı olmayan toksik Marker, forseps ve dezenfektan gerektirir. Cerrahi elbisesi, tek kullanımlık cerrahi eldiven, facemask, saç örtüsü kullanımı kontaminasyon riskini önlemek için zorunludur. Tüm çalışma alanlarının yanı sıra, işlemde yer alan ekipman, herhangi bir prosedür başlatmadan önce laboratuvar dezenfektan (örn., Oosafe) ile iyice temizlenmelidir. Kullanılan tüm sarf malzemeleri ve ortamlar steril ve ayrı olarak paketlenmiş veya alaşağı edilmelidir. Bu biyopsi ve boru için adanmış bir iş istasyonu kullanmak ve yalnızca prosedüre katılan operatörler (embriyolog ve tanık) için bölgenin erişimini sınırlamak için önerilmektedir.

1. biyopsi Işleminden önceki gün hazırlığı

  1. Biyopsi kültürü yemeği hazırlayın.
    1. Bir ıVF kültür çanak içinde 20 μL ıVF kültür orta (malzeme tablosu) 6 damla yerleştirin ve embriyo kültürü Için 6 ml prewarmed mineral yağı ile bindirme (malzeme tablosu).
    2. Her damla için başka bir 10 μL ıVF kültür ortamı ekleyin. Bir gecede 37 °C ' de kontrollü bir atmosferde (% 5 O2, 6% Co2) inküye yapın.
  2. Biyopsi sonrası blastosist durulama için bir ıVF çanak 4-kuyu plakası hazırlayın.
    1. İlk iki Kuyudaki ıVF kültür ortamının 600 μL 'yi ve embriyo kültürü için 300 μL ön ısıtılmış mineral yağıyla bindirmeyi yerleştirin.
    2. Bir gecede 37 °C ' de kontrollü bir atmosferde (% 5 O2, 6% Co2) inküye yapın.
  3. TE hücre boruları için kullanılmak üzere her PCR tüpünde yükleme çözeltisi (malzeme tablosu) μl 1,5 dispense, döndürme ve 4 °c ' de tutun.

2. biyopsi prosedürü gününde hazırlık

  1. Biyopsi tabağı hazırlayın.
    1. 3 damla 10 μL HEPES-tamponlu Orta (insan serum albümin ile tamamlayıcı) (malzeme tablosu) BIR IVF kültür çanak satırda yerleştirin.
    2. (Çanak başına 4 blastosist kadar) ve embriyo kültürü için 6 ml önceden ısıtılmış mineral yağı ile bindirme-mevcut blastosist sayısına göre 1.1.1 adımı tekrarlayın.
    3. Biyopsi prosedürünü yapmadan önce 37 °C ' de en az 1 saat boyunca çanak inküye yapın.

3. Blastokist seçimi ve sınıflandırma

  1. Blastosist 'in genişlemesine ve ICM ve TE 'nin morfolojik görünümüne göre Not (Şekil 1).
    Not:     notlama kriterleri Gardner ve Schoolcraft15 ve daha önce capalbo et al. ve cimadomo ve al.4,11tarafından açıklanan uyarlanmıştır.
    1. Boyut ve genişleme notu olarak tanımlayın: a tam hatlı blastosist için, B bir hatching blastosist için, C tam genişletilmiş blastosist için, ve D genişletilmiş olmayan bir blastosist için (Bu embriyolar sadece onlar gün kadar daha fazla genişleme vermedi biyopsi 7).
    2. ICM notu tanımla: 1 belirgin ICM için birkaç kesinlikle paketlenmiş hücreler; birkaç ancak kabaca paketlenmiş hücreler ile ayırt edilebilir için 2; 3 çok az düşük kaliteli hücreler ile ayırt etmek zor.
    3. TE notu aşağıdaki gibi tanımlayın: 1 çeşitli hücrelerle iyi organize epitelyum için; birkaç hücreli gevşek epitelyum için 2; birkaç ve/veya büyük düşük kaliteli hücreler için 3.

4. troektoderm biyopsisi

  1. Tüm uygulanabilir tam genişletilmiş blastosist üzerinde te biyopsi gerçekleştirin (boyut ve genişleme için tercihen C Grade).
  2. Her biyopsi prosedürü için tutma ve biyopsi pipetleri ayarlayın. Biyopsi pipet için öneriler şunlardır: 30 μm iç çapı, 35 ° büküm açısı, 0,75 mm mesafe ucu bend.
  3. Biyopsi tabağını hastanın detayları ile etiketleyin (kadının adı ve soyadı, Doğum tarihi ve KIMLIĞI) ve sonra her damla embriyo ve döngü kimlikleri ile sayı yapın. Kalıcı toksik olmayan Marker kullanın.
  4. Biyopsi çanağın ilk damlası için 300 μm sıyırma pipet ile blastosist transfer ve kültür orta aşan kaldırmak için durulayın. Sonra biyopsi çanak ikinci damla Blastokist taşıyın.
  5. Tabak ters mikroskopla taşıyın ve biyopsi tabak üçüncü damla bazı orta duman çekiş biyopsi pipet Prime.
  6. 20X büyütme, Blastokist yönlendirmek ICM net bir görünüme sahip. Saat 7 ' de (TE hücrelerini çıkarmak için hedeflenen alanın tersi) görselleştirildiğinde, embriyonun tutan pipet üzerine sabitlenmelidir (Şekil 2a).
  7. Zona pellucida odaklanmak ve hem Pipetler ve blastosist aynı odak düzleminde olduğunu tespit.
  8. Lazer hedefe geçiş (darbe süresi 0,3 MS, 6,5 μm) ve lazer işaretçisini ICM 'nin karşı tarafındaki zona pellucida üzerine konumlandırın. Zona pellucida 2 − 3 lazer darbeleri ile matkap (Şekil 2B).
  9. Biyopsi pipetine yavaşça zona pellucida 'ya basın ve TE hücrelerini iç yüzeyinden ayırın ve blastosist çöküşü hızlandırın (Şekil 2C).
  10. TE ayrıldıktan sonra (Şekil 2D), delik üzerinden girin (gerekirse, son bir lazer nabız ile daha geniş yapmak) ve birkaç te hücreleri Aspire (ideal 7 − 813,16) yumuşak emiş biyopsi pipet içine (Şekil 2e).
  11. Hedef hücreleri uzatmak için ılımlı bir emiş uygularken biyopsi Pipeti biraz geriye doğru hareket ettirin (Şekil 2F).
  12. Lazeri, emişli hücrelerin en ince kısmına doğru yönlendirin ve hücre arasındaki kavşada 2 − 5 lazer darbeleri ateş ederek, hedef hücreleri embriyonun gövdesine ayırın (Şekil 2G). Lazer darbeleri ve darbe sayısı zamanlaması blastosist kalitesine göre ayarlanabilir; Ancak, hücre liziz önlemek için onları en aza indirmek deneyin.
  13. TE parçasının Blastokist 'den ayrılması (Şekil 2H) sonra, Blastokist 'den çok uzağa aynı biyopsi düşüşü içine bırakın. Bu, biyopsi pipet içine tekrar sucked önlemek için gereklidir (Şekil 2i).
  14. Blastokist 'i tutma pipetinden bırakın ve parçanın onlara yapışmasını önlemek için her iki pipeti hemen kaldırın.
  15. Kalite kontrol amacı için biyopsi parçanın bir resmini çekin (Şekil 3).
    Not: tek bir blastosist daha fazla prosedür başına biyopsi (biyopsi çanak başına en fazla dört) ise, embriyo arasında çapraz kontaminasyonu önlemek için yeni bir ile biyopsi pipet değiştirin.
  16. 4.1 − 4.13 arasındaki adımları yineleyin.
  17. Biyopsi tabağı laminar akış kaputu geri taşıyın.
  18. Çift KIMLIĞI ile biyopsi sonrası kültür çanak etiket ve embriyo ve döngü KIMLIĞI ile her damla.
  19. Bir tanık varlığı, temiz ıVF ortamında Blastokist durulayın ve son olarak post-biopsi çanak karşılık gelen damla taşıyın.
  20. Biyopsi sonrası tabağı kontrollü bir atmosferde (37 °C,% 6 CO2, 5% O2) vitrifikasyon kadar kuluçta taşıyın. Blastokist yeniden genişlemeyi önlemek için biyopsi işleminden 30 dakika içinde vitrifikasyon yapılması tavsiye edilir.

5. boru borusu

Not: Tüm prosedür, bir tanık ve oda sıcaklığında laminar akış kaput içinde bulunması gerekir. Prosedür sırasında, PCR tüpleri buz üzerinde soğuk bir tüp raf içinde tutun (Tamamlayıcı Şekil 1).

  1. PCR tüpleri kalıcı toksik olmayan Marker ile etiketleyin.
    Not: Etiketleme, genetik laboratuar tarafından istendiği şekilde yapılmalıdır. Genel olarak, hastanın adı ve Soyadı (baş harfleri), Çift KIMLIĞI, embriyo ve döngü KIMLIĞI (örneğin: JD 12345, 2. döngüsünün, Çift KIMLIĞI 12345 olan Jane Doe 'ya ait olan embriyo N. 1 için 1,2). Embriyo KIMLIĞI de tüpün gövdesinde mektuplarda rapor edilmelidir.
  2. Bir 60 mm x 15 mm Kültür çanak (boru çanak), biyopsi embriyo kimlikleri (Tamamlayıcı Şekil 1) ile kapak etiket ve içinde 2 10 μL biyopsi yıkama solüsyonu (tablo) damla hazırlayın.
  3. 140 μm sıyırma pipet (Tamamlayıcı Şekil 1) ile bazı biyopsi yıkama çözeltisi ile boru çanağın ikinci damlası.
  4. Kolayca TE parça (ler) görselleştirmek için stereomikoskop altında biyopsi çanak yerleştirin.
  5. TE parçası üzerine hafifçe biyopsi yıkama çözeltisi bırakın; sonra, onu sıyırma pipet içine yükleyin.
  6. TE parçasını, biyopsi yıkama çözeltisinin ikinci damlasında boru çanağına taşıyın ve 2 − 3 kez dikkatle durulayın.
  7. Ten parçasını PCR tüpünün altına (daha önce etiketlendikten sonra) yükleme çözümüyle aktarın, duvarları sıyırma pipetin ucunu ile dokunmamak için dikkat edin.
  8. Her te parçası için yeni bir kapiller kullanmak için dikkat, her TE parçası için 5,7 adım 5,3 adım yordamı yineleyin.
  9. Boru prosedürü sonunda, bir mini santrifüjte tüm PCR tüpler koymak ve birkaç saniye onları spin.
  10. Örnekleri, test için başvuran genetik laboratuvara gönderene kadar-20 °C ' de saklayın.

6. Blastokist vitrifikasyon

  1. Vitrify yeniden genişleme önlemek için te biyopsi 30 dakika içinde blastosist çöktü.
  2. Vitrifikasyon plakasını kadın detayları ve vitrifiye edilmelidir blastosist kimlikleri ile etiketleyin.
  3. Etiket vitrifikasyon destek (ler) kadın adı ve soyadı ile, Çift KIMLIĞI, üzerinde yüklenecek embriyonun KIMLIĞI yanı sıra prosedür tarihi. Çok düşük sıcaklıklarda bile bütünlüğünü koruyan özel cryolabels kullanılır (-196 °C).
  4. Oda sıcaklığında, vitrifiye edilecek her blastosist için 0,3 ml dengelemesinden solüsyonu (es) (malzeme tablosu) dağıtır.
  5. Bir tanık varlığında, 300 μm sıyırma pipet kullanarak ES 'de blastosist taşıyın.
  6. Blastokist 'i 13 − 15 dakika boyunca ES 'de bırakın. Hacminin ilk daralması sonra, kademeli bir yeniden genişleme gözlenir.
  7. Küçük bir soğutma rafı sıvı nitrojen (LN2) ile doldurun ve laminar akış kaputu altına yerleştirin.
  8. İkinci kuyunda 300 μL vitrifikasyon çözeltisi (VS) (malzeme tablosu) dispense. Blastokist tam yeniden genişleme sonra, 1 dakika için VS çözüm aktarmak ve ES seyreltilmesi için durulayın.
  9. Bir tanık varlığında, vitrifikasyon desteği üzerinde blastosist yükleyin ve VS fazlalığının kaldırılması dikkat. Çözüm ince bir film Blastokist çevreleyen gerekir.
  10. Vitrifikasyon desteğini LN2 ' ye dalın ve numuneye yakın kabarcık oluşumu riskini azaltmak için enerjik bir şekilde taşıyın.
  11. LN 2 ' de vitrifikasyon desteğini tutarken koruyucu kapağı yerleştirin.
  12. Bir tanık huzurunda, uzun süreli LN2 depolama tankında vitrifikasyon desteğini taşıyın.

7. Non-biopsied Blastocysts suni daralma

  1. Herhangi bir TE biyopsisi yapılırsa, vitrifikasyon öncesinde hemen blastositleri yapay olarak daraltabilirsiniz (Şekil 4).
    1. Kültür çanak kuluçkenden ters mikroskop için hareket ettirin ve seçilen embriyo odaklanmak.
    2. Lazer hedefe geçiş (Pre-set Nabız: 0,3 MS, 6,5 μm), ICM karşı tarafında zona pellucida hedef, daha sonra doğrudan 1 – 2 lazer darbeleri TE hücreler arasındaki kavşak için ICM güvenli bir mesafede. Blastositler 5 dakikadan kısa sürede çökmelidir.
  2. Bölüm 6 ' da açıklandığı gibi çökmüş Blastokist vitrifikasyonu ile devam edin.

8. devredilebilir Blastokist ısınma

  1. ET günü, her bir kuyu için 600 μL ön equilibrated ıVF kültür ortamını yerleştirerek ET 4-Well plakasını hazırlayın. 37 °C ' de kontrollü bir atmosferde (% 5 O2, 6% Co2), Blastokist ısınma yapılırken inküye yapın.
  2. Kadın adı ve soyadı, Çift KIMLIĞI, içinde ısınacak embriyonun KIMLIĞI ile ısınma çanak etiket.
  3. 1 mL çözme çözeltisi (TS) (malzeme tablosu) BIR IVF tek kuyu tabağı (Tamamlayıcı Şekil 1) ve 37 °c ' ye sıcak bir TERMOSTATIN en az 1 saat önce prosedüre başlanması için ısıtın.
  4. LN2 ile küçük bir soğutma desteğini doldurun ve çalışma alanının yakınında laminar akış kaputu içine yerleştirin.
  5. Prosedüre başlamadan önce, vitrifikasyon desteğiyle bildirilen Blastokist bilgileri kontrol edin. Tüm kimlikleri genetik rapor ile eşleşmelidir ve sıcak için blastosist devredilebilir olanlar arasında seçilmelidir. Prosedür sırasında bir tanık gereklidir.
  6. TERMOSTATIN dışında ısıtılan TS 'i içeren tek kuyun tabağı alın ve stereomicroscope altında ısıtmalı bir aşamaya yerleştirin.
  7. LN2 içindeki koruyucu kapağı forseps kullanarak çekin.
  8. 37 °C TS içine vitrifikasyon desteğinin ucunu hızla Dalma.
  9. Mikroskobik gözlem altında, Blastokist ucdan serbest bırakılıncaya kadar vitrifikasyon desteğini yavaşça hareket ettirin.
  10. Blastokist 'i TS 'deki toplam 1 dakika boyunca bırakın, TS 'in altında tutmak için dikkat edin.
  11. Oda sıcaklığında 200 μL seyreltme çözeltisi (DS) (malzeme tablosu) vitrifikasyon plakasının ilk kuyusu üzerinde dağıtılır.
  12. DS için Blastokist transfer ve gradyan bir tür oluşturmak için onun üstünde bazı TS bırakmadan iyi altına yerleştirin. 3 dakika bırak.
  13. 2 farklı kuyularda (WS1 ve WS2) 200 μL yıkama çözeltisi (WS) dispense.
  14. WS1 için Blastokist transfer ve onun üstünde bazı DS orta bırakmadan iyi altına yerleştirin. Sonra WS2 için Blastokist transfer ve 1 dakika boyunca bozulmamış bırakın.
  15. Kadın adı ve soyadı, Çift KIMLIĞI, içinde kültürlü olacak embriyonun KIMLIĞI ile sonrası ısınma ET plaka etiket.
  16. Bir tanığın varlığında, ısıtılmış blastosist 'i, ısınma sonrası ET plakasında önceden eşitlenebilir kültür ortamına aktarın.
  17. ET plakasının ilk kuyusu içinde Blastokist durulayın ve ikinci kuyu yerleştirin.
  18. Isınma sonrası kültür çanağını kontrollü bir atmosferde (37 °C,% 6 CO2, 5% O2) ve kültür için blastosist en az 1,5 h, hayatta kalma ve yeniden genişleme kontrol etmeden önce aktarın.
    Not: Şekil 5 dejenere örnekleri gösterir, Cryo-hayatta ama yeniden genişletilmiş ve Cryo-hayatta ve tam genişletilmiş blastocysts.

9. Embriyotransfer

  1. ET yapmak için, laminar akış kaput ısıtmalı aşamasında çanak yerleştirin, böylece embriyo düşük büyütme mikroskop altında görünür.
  2. Yaklaşık 0,4 mL ıVF kültür ortamı alın. Şırınga ucunu iç kateterin alıcı ucuna sıkıca sabitleyin ve sonra orta 0,1 mL 'ye kadar bırakın.
  3. Katetere giren embriyoları gözlemlemeye kadar, kültür ortamını aspirate (minimum miktarda medya: 10 − 15 μL).
  4. Kateteri plastik kasa içine yerleştirin ve ameliyathane gidin ve dahili kateteri harici kılavuza yerleştirin.
  5. Bir kez rahim ulaştı, embriyo (s) serbest bırakmak için şırınga pistonu itin. Pistonlu 0,1 mL okuma kadar çok yavaş orta bırakın.
  6. Kateteri laboratuara geri götürün ve embriyonun aktarıldığı mikroskop altında kontrol edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 6 , protokol standartlaştırılması ve her operatörün performansını izlemek için kabul edilebilir bir biyopsi prosedürün tüm sonuçlarının bir düzenini temsil eder. Ana prosedür sonucu biyopsi/biopsilerin tamamlanması için zamanlamadır; Ana teknik sonuç, son olarak tanısı konulmamış blastosist bir yeniden biyopsi gerektiren ya bir kesin veya belirsiz tanı neden olabilir genetik test sonrası üretilen Arsa kalitesidir; Ana biyolojik sonucu ısınmadan sonra Cr...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sadece iyi tecrübeli embriyologlar, eğitim süresini tamamlamış ve hem biyopsi hem de blastosist vitrifikasyonu gerçekleştirmelidir. Ayrıca, bir tanık, prosedürleri izlemek ve i sırasında etkili bir izlenebilirliği garanti etmek için gereklidir) biyopsi blastosist biyopsi çanak (Tamamlayıcı Şekil 1) sonrası biyopsi çanak (ek Şekil 1) hareketlerini ), ardından vitrifikasyon plakasına (Tamamlayıcı Şekil 1) ve son olarak vitrifikasyon desteğine (Tamamlayıcı Şekil 1

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AG ve RM verileri topladığımız ve taslağı tasarlanan. DC verileri analiz etti, temsili sonuçları hazırladı, istatistikleri gerçekleştirdi ve el yazması revize edildi. FMU ve LR, sonuçların ve tüm yazmanın eleştirel tartışmalarını sağladı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
< güçlü > Ekipman< / güçlü >
Soğuk tüp rafıBiyocisionXTPCR96
Elektronik pipet kontrolörüFisher Scientific710931
Flexipet ayarlanabilir tutamak setiCookG18674Striptizci tutucu
Gilson PipetmanGilson66003p20
IVF Elektronik Tanık SistemiCooperSurgical Doğurganlık & Genomik ÇözümlerRI Tanık ART Yönetim Sistemi
Ters mikroskopNikonEclipse TE2000-U
Laminer Akış BaşlığıIVF TECHA Sınıfı hava akışı
Lazer objektifRISatürn 5
Mikro enjektörlerNikon NarishigeNT-88-V3
PCR tüpleri için mini santrifüjEppendorf0.2 mLl PCR tüpleri için
StereomikroskopLeicaLeica M80
TermostatPanasonicMCO-5AC-PE
Tri-gaz inkübatörüPanasonicMCO-5M-PE02/CO2
Sarf malzemeleri
Biyopsi pipetiRI7-71-30FB3572030 &mikro; m ID, daire 35 & derece; C
CryolockCryolockCL-R-CT
CSCM kompleIrvine Scientific90165ile desteklenmiş IVF kültür ortamı
CookG17934
Flexipet pipetCookG26712140µ m sıyırma pipet ucu
Flexipet pipet CookG46020300µ m sıyırma pipet uçları
Tutma pipetiRI7-71-IH35/2030 & m ID, daire 35 & derece; C
İnsan Serumu AlbüminiIrvine Scientific9988
IVF Embriyo kültürü için bir kuyu çanakFalcon353653
Mineral YağIrvine Scientific9305
Modifiye HTF OrtamıIrvine Scientific90126Hepes Tamponlu orta
Nuclon DeltaYüzey Thermofisher scientific176740Tüp bebek kabı 4- sürgülü kapaklı kuyu plakası
Primaria Hücre kültürü kabıCorning35380260 mm x15 mm
ReproplateKitazato83016
Serolojik pipetFalcon35755110ml
Steril tek kullanımlık Gilson uçlarıEppendorf0030 075.021200 & mikro; L
GenetiklaboratuvarBoru Kiti PCR tüpleri (0.2 mL), yükleme solüsyonu, biyopsi yıkama solüsyonu
Vitrifikasyon ortamıKitazatoVT801Dengeleme ve vitrifikasyon solüsyonları
Isınma ortamıKitazatoVT802Çözdürme ve seyreltme solüsyonları
CSLQSPIN HSA Embriyo Transfer Kateteri tarafından sağlanan

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Glujovsky, D., Farquhar, C., Quinteiro Retamar, A. M., Alvarez Sedo, C. R., Blake, D. Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology. Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), CD002118(2016).
  2. Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garcia-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: a meta-analysis. Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).
  3. Cimadomo, D., et al. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. Biomedical Research International. 2016, 7193075(2016).
  4. Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).
  5. Capalbo, A., et al. Implementing PGD/PGD-A in IVF clinics: considerations for the best laboratory approach and management. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. , (2016).
  6. McArthur, S. J., Leigh, D., Marshall, J. T., de Boer, K. A., Jansen, R. P. Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts. Fertility and Sterility. 84 (6), 1628-1636 (2005).
  7. Kokkali, G., et al. Birth of a healthy infant following trophectoderm biopsy from blastocysts for PGD of beta-thalassaemia major. Human Reproduction. 20 (7), 1855-1859 (2005).
  8. Rienzi, L., Ubaldi, F., Anniballo, R., Cerulo, G., Greco, E. Preincubation of human oocytes may improve fertilization and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13 (4), 1014-1019 (1998).
  9. Wale, P. L., Gardner, D. K. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).
  10. Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
  11. Cimadomo, D., et al. Associations of blastocyst features, trophectoderm biopsy and other laboratory practice with post-warming behavior and implantation. Human Reproduction. , (2018).
  12. Evans, J., et al. Fresh versus frozen embryo transfer: backing clinical decisions with scientific and clinical evidence. Human Reproduction Update. 20 (6), 808-821 (2014).
  13. Capalbo, A., et al. Consistent and reproducible outcomes of blastocyst biopsy and aneuploidy screening across different biopsy practitioners: a multicentre study involving 2586 embryo biopsies. Human Reproduction. 31 (1), 199-208 (2016).
  14. Cimadomo, D., et al. Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during PGD/PGS cycles. Reproductive Biomedicine Online. 33 (3), 360-369 (2016).
  15. Gardner, D. K., Schoolcraft, B. Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond 1999. Jansen, R., Mortimer, D. , Parthenon Press. 377-388 (1999).
  16. Cimadomo, D., et al. Inconclusive chromosomal assessment after blastocyst biopsy: prevalence, causative factors and outcomes after re-biopsy and re-vitrification. A multicenter experience. Human Reproduction. , (2018).
  17. de Boer, K. A., Catt, J. W., Jansen, R. P., Leigh, D., McArthur, S. Moving to blastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryo transfer at Sydney IVF. Fertility and Sterility. 82 (2), 295-298 (2004).
  18. Capalbo, A., Rienzi, L. Mosaicism between trophectoderm and inner cell mass. Fertility and Sterility. 107 (5), 1098-1106 (2017).
  19. McCoy, R. C., et al. Evidence of Selection against Complex Mitotic-Origin Aneuploidy during Preimplantation Development. PLoS Genetics. 11 (10), e1005601(2015).
  20. Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).
  21. Lee, H., et al. Live births after transfer of rebiopsy and revitrification of blastocyst that had “no diagnosis” following trophectoderm biopsy. Fertility and Sterility. 106 (3), e164(2016).
  22. Capalbo, A., et al. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).
  23. Hammond, E. R., Shelling, A. N., Cree, L. M. Nuclear and mitochondrial DNA in blastocoele fluid and embryo culture medium: evidence and potential clinical use. Human Reproduction. 31 (8), 1653-1661 (2016).
  24. Vera-Rodriguez, M., et al. Origin and composition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture during preimplantation development. Human Reproduction. 33 (4), 745-756 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Trofoektoderm H creleriZona PellucidaVitrifikasyon ProtokolPreimplantasyon Genetik TanIVF Embriyo TransferiLazer Destekli BiyopsiEmbriyo VitrifikasyonuKriyokoruma Deste iGenetik Laboratuvar Testleri

İlgili makaleler