Yöntem makalesi

Salmonella Fitness yüksek verimlilik analizi için dijital PCR tabanlı rekabetçi endeksi

DOI:

10.3791/59630

⸱

13 Mayıs 2019

 , 
1Department of Medical Microbiology and Immunology, Creighton University School of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteriyel Fitness belirlenmesi için bu moleküler tabanlı yaklaşım dijital PCR üzerinden nicelik benzersiz genomik DNA barkodları kullanarak mikroorganizmaların kesin ve doğru algılanmasını kolaylaştırır. Protokol, Salmonella suşları için rekabetçi dizinin hesaplanmasında açıklanmaktadır; Ancak, teknoloji, herhangi bir genetiği değiştirilmiş organizmanın mutlak ölçümlerini gerektiren protokollere kolayca adapte olmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekabetçi bir endeks, bakteriyel Fitness ve/veya virulence değerlendirmek için kullanılan ortak bir yöntemdir. Bu yaklaşımın yarar gerçekleştirmek için kolaylığı ve bir vahşi tip organizmaya birçok suşların Fitness standartlaştırmak yeteneği tarafından örneklenmiştir. Teknik, ancak, mevcut fenotipi belirteçler ve aynı anda değerlendirilebilir suşların sayısı tarafından, çoğaltır deneyler çok sayıda ihtiyacı oluşturarak sınırlıdır. Çok sayıda deney ile eşzamanlı olarak, fenotipik işaretçileri dayalı bakterilerin ölçülmesini için işçilik ve malzeme maliyetleri önemsiz değildir. Olumlu yönlerini koruyarak bu olumsuz yönlerini aşmak için, bakteri kromozomları üzerine genetik belirteçleri mühendislik sonra doğrudan mikroorganizmalar ölçmek için moleküler tabanlı bir yaklaşım geliştirdik. Benzersiz, 25 baz çifti DNA barkodları, yaban tipi ve Salmonellamutant suşlarının kromozom üzerinde bir zararsız Locus yerleştirilir. In vitro rekabet denemeleri, havuzlanmış suşlardan oluşan inocula kullanılarak yapılmıştır. Rekabetin ardından, her bir gerilimin mutlak sayısı dijital PCR kullanılarak ölçülebilir ve her bir gerinim için rekabetçi endeksleri bu değerlerden hesaplanır. Verilerimiz, Salmonella 'yı ölçmek için bu yaklaşımın, hem son derece bol (yüksek Fitness) hem de nadir (düşük Fitness) mikroorganizmaları tespit etmek için son derece hassas, doğru ve hassas olduğunu göstermektedir. Buna ek olarak, bu teknik, neredeyse herhangi bir organizmaya modifikasyon yapabilen kromozomlar ve mikroorganizmaların mutlak ölçülmesini gerektiren çeşitli Deneysel tasarımlar için kolayca uyarlanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Patojen organizmaların Fitness ve virulinin değerlendirilmesi Mikrobiyoloji araştırmalarının temel bir özelliğidir. Bu karşılaştırmalar suşları veya mutasyona uğramış organizmalar arasında yapılması için, hangi araştırmacılar belirli koşullarda belirli genlerin önemini belirlemek için izin verir. Geleneksel olarak, virülans değerlendirmesi farklı bakteriyel suşları kullanarak enfeksiyon bir hayvan modeli kullanır ve enfekte hayvanın sonucunu gözlemlemek (örneğin bulaşıcı doz50, ölümcül doz50, ölüm zamanı, belirti şiddeti, eksikliği Belirtiler, vb.). Bu prosedür, virulence değerli açıklamaları sağlar, ancak vahşi türde varyasyonları algılamak için sonuçlar önemli farklılıklar neden suşları gerektirir. Ayrıca, sonuçlar yarı niceliksel çünkü hastalık ilerlemesi ve semptom şiddeti zaman içinde subjektif olarak niceleyilebilir, vahşi türe kıyasla virülans yorumu daha niteliksel (yani daha fazla, daha az veya eşit derecede virlan). Hayvan infeksiyonunun gerçekleştirilmesi için ortak bir alternatif, rekabetçi Endeksleri (BDT), doğrudan Fitness ya da bir gerinlik virülans karma bir enfeksiyon bir vahşi tip mevkidaşı karşılaştırmak değerleri oluşturmak için1. Bu teknik, vahşi tip bir gerinim için virülans standardizasyon ve zayıflatma derecesini yansıtacak şekilde ölçülebilir bir değer belirleme tarafından enfeksiyon geleneksel hayvan modeli üzerinde sayısız avantajları vardır. Bu teknik, iptal edilmiş bir rekabetçi Endeks (COı)2belirlenerek bakterilerde gen etkileşimlerini analiz etmek için de adapte edilebilir. Bir COI 'nin bir grup mutasyona uğramış organizmalar için hesaplanması, araştırmacılar iki genin bağımsız olarak patogeneze katkıda bulunup bulunmadığını ya da aynı virülans yoluna katılıp birbirlerine bağımlı olup olmadığını belirlemesine olanak tanır. Ayrıca, bir CI hesaplanması, organizmaların patogenezine değerli Öngörüler sağlayan bakterilerin numaralandırılmasını gerektirir. BDT ve COIs de araştırmacılar klinik hastalığa neden olmayan ama hala Fitness farklılıkları var avirlan suşları asses izin. Bu teknik, suşları tanımlamak için geleneksel antibiyotik direnci belirteçlerinin kullanımı ile sınırlıdır, böylece giriş suşlarının sayısını aynı anda sadece bir ya da iki kez sınırlandırır. Bu sınırlama nedeniyle, çok sayıda deneysel grup ve çoğaltır gereklidir, bu da işçilik ve malzeme maliyetlerine ilaveye ek olarak, deneysel koşullarda değişkenlik ve hatalı sonuçlar için fırsatları da arttırır. (Virulence, Fitness ve gen etkileşimlerini incelemek için karışık enfeksiyonlar kullanmanın faydaları ve uygulamalarının kapsamlı bir gözden geçirilmesi için, bkz: CR Beuzón ve D.W. Holden 1)

Akış cytometri3,4,5ile niceli floresan etiketli hücrelerin kullanımı gibi bu sınırlamanın üstesinden gelmek için girişimleri yapılmıştır. Bu teknik, 1 ' i kullanarak hücreleri ölçülebilir) fenotipik işaretçileri veya 2) endojenously üretilen floresan proteinleri etiketli antikorlar. Etiketli antikorların kullanımı 1.000 hücre/mL algılama sınırı vardır ve bu nedenle3analiz etmek için hücre yüksek sayıda gerektirir. Floresan proteinlerini ifade eden hücreler değiştirilmiş bir fizyolojisine sahiptir ve yüksek protein ifadesi6' dan kaynaklanan Fitness değişikliklerine duyarlıdır. Her iki yöntem de Akış sitometrisi kullanılarak algılanabilir floresan belirteçleri sayısı ile sınırlıdır. Bir duvar modeli7' de 1.000 suşlarının ilk karma enfeksiyonundan 120 suşlarında zayıflama tespit eden bir Mikroarray tekniğinin gelişimi ile moleküler ölçüte bir gelişme elde edildi. Bu teknik, sonuç olarak önemli değişkenlik sağlayan mutasyona uğramış suşlarından RNA 'nın Mikroarray analizini kullandı.  Yine de, karışık enfeksiyonların büyük havuzları yararlı bir araç olabilir ve hassas algılama teknikleri kullanarak, bakteriyel virülans farklılıkları tespit edilebilir kuruldu. Yeni nesil sıralamanın geliştirilmesi ile, TN-Seq transpozon mutasyonların yardımcı programını genişletti ve rasgele mutasyona uğramış bakteri ölçümü için güçlü bir yöntem sağlayan8,9,10, 11' den itibaren. Alternatif bir protokol son zamanlarda Transpozonlar ihtiyacını ortadan kaldırır ve bunun yerine daha kolay tanımlamak ve genomik değişiklikleri ve fitness üzerindeki etkilerini izlemek için DNA barkodları kullanır geliştirilmiştir12. Bu teknoloji büyük bir ilerlemedir, ancak genomik barkodların eklenmesi hala rasgele bir süreçtir. Önceki deneylerin rastgele üstesinden gelmek için, Yoon et al. bakterilerin kromozomları üzerinde kesin yerlere yerleştirilen benzersiz DNA barkodları kullanarak Salmonella suşlarının BDT 'sını hesaplamak için bir yöntem geliştirdi13. Benzersiz barkodlu suşlar, SYBR yeşil ve her benzersiz barkodan spesifik astar içeren qPCR tabanlı bir yöntem kullanılarak saptandı. Bu teknik, qPCR 'den önceki iç içe-PCR ihtiyacının kanıtlandığı primer verimlilikler ve düşük hassasiyette farklılıklar da dahil olmak üzere KSC tarafından uygulanan kısıtlamalarla sınırlıdır. Yine de bu yaklaşım, hedeflenen genomik değişikliklerin, birden fazla bakteriyel suşların havuzlarını tespit etmek ve potansiyel olarak ölçmek için yararlanabileceğini göstermiştir.

Aşağıdaki protokolde, son derece hassas bir dijital PCR tekniği kullanarak büyük karışık inokula havuzları ve ardından doğru ölçüte sahip bakteriyel rekabet denemeleri yapmak için yeni bir metodoloji tarif ediyoruz. Protokol, kromozom bir zararsız bölgeye yerleştirilen benzersiz bir DNA barkod ile genetik etiketleme bakteriyel suşları içerir. Bu değişiklik suşları hızlı ve doğru geleneksel seri seyreltme yerine modern moleküler teknoloji kullanarak nicelik sağlar, yineleme kaplama, ve fenotipik belirteçler (yani antibiyotik direnci güveniyor koloninin şekillendirme birimleri sayma ). Değişiklikler, tek bir havuza alınan inokulum içinde birçok suşların eşzamanlı değerlendirilmesi için izin, önemli ölçüde tüm suşları tam aynı koşullara maruz çünkü deneysel değişkenlik olasılığını azaltır. Ayrıca bu teknik Salmonella enterica serovar typhimurium 'da geliştirilirken, herhangi bir genetik olarak kötü hale gelebilen organizmaya ve doğru bakteriyel sayılarının gerekli olduğu neredeyse her deneysel tasarıma son derece uyarlanabilir, yeni bir önceki yöntemlerle uygulanan kısıtlamalar olmadan Mikrobiyoloji laboratuvarlarında doğruluğu ve verimi artırmak için bir araçtır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Allelic Exchange için gerekli bileşenleri Içeren bir Plasmid üzerine benzersiz DNA barkodları dahil

Not: Yeni bir Plasmid, pskap adlı, yüksek kopya numarası ve artan dönüşüm verimliliği ile karşılaştırıldığında mevcut pKD13 allelik değişim plazmid oluşturuldu. Bu, 1.1-1.12 adımlarda açıklanmıştır (Şekil 1). Benzersiz DNA barkodları ve allelik değişimi için bileşenler içeren sonuçlandırılmış plazmids bir Plasmid deposu (malzeme tablosu) aracılığıyla mevcuttur.

  1. Ticari bir Plasmid Sage kiti kullanarak, pKD1314 ve ppcr Script cam SK+ , Luria-Bertani (lb) suyu ile yetiştirilen gece bakteriyel kültürlerden 50 μg/ml kanamisin veya 25 μg/ml kloramfenikol ile tamamlayıcı (pKD13 ve ppcr Script cam için) SK +, sırasıyla) (Tablo 1).
  2. Üreticinin özelliklerine göre ticari kısıtlama enzimleri HindIII ve BamHI kullanarak hem plazmids üzerinde kısıtlama sindirimler gerçekleştirin.
  3. PPCR Script cam SK+ reaksiyonunun kısıtlama enzimlerini ve EKSIZ DNA 'sını çıkarın ve 3.370-baz çifti (BP) Plasmid omurgasını üreticinin özelliklerine göre ticari olarak KULLANILABILIR bir DNA Temizleme Kiti kullanarak arındırın.
  4. PKD13 kısıtlama sindirimi parçaları bir elektroforez odası kullanarak% 1 agaroz jel ayırın.
  5. Mavi ışık transaydınlatıcıyı kullanarak bantları görselleştirin ve 1.333 BP parçasını jelden (Şekil 1C) çıkarın.
    Not: Bu parça, kromozomal allelik değiştirme için gerekli frt-flanked kanamisin direnç geni içerir.
  6. Ticari bir jel ekstraksiyon kiti kullanılarak adım 1,5 ' ten itibaren eksiz DNA 'Yı arındırın.
  7. PSKAP oluşturmak için, pKD13 'den (adım 1,6) gelen temizleşmiş parçayı pPCR Script cam SK+ ' a (adım 1,3), üreticinin özelliklerine göre ticari BIR T4 DNA ligaz kullanarak yerleştirin.
  8. Üreticinin protokolünün ardından birleştirilmiş pSKAP Plasmid ile kimyasal olarak yetkili DH5α hücrelerini dönüştürün (Tablo 1).
  9. 50 μg/ml kanamisin ile tamamlayıcı lb agar plakaları üzerine Spread transformanlar ve bir gecede 37 °c ' de inkük.
  10. Plaka bir koloni seçin ve yeni lb agar plaka üzerinde çizgi 50 μg/ml kanamisin ile tamamlayıcı ve 37 °c gece içinde inkük. Bu plakaya bir koloni seçin ve 50 μg/ml kanamycin ile tamamlayıcı lb suyu aşılamak kullanın. Her gece 37 °C ' de sürekli ajitasyon ile kültürü kulyın.
  11. Pskap 'i gecede bakteriyel kültürden arındırmak için ticari bir Plasmid Sage kiti kullanın.
  12. Üretici özelliklerine göre Hind III ve bam HI kullanarak adım 1,11 Plasmid bir tanı kısıtlama sindirimi gerçekleştirin. 1.4-1.5 adımlarında olduğu gibi% 1 agaroz jel üzerinde parçaları görselleştirin.
    Not: PSKAP toplam boyutu 4.703 BP olmalıdır. Adım 1,12 sonra parçaları 3.370 ve 1.333 BP olmalıdır.
  13. Pskap (Şekil 2) 725 pozisyonunda benzersiz bir 25-basepair DNA dizisi eklemek gibi bir şekilde eklemsel site yönlendirilmiş mutagenez (SDM) (Tablo 2 ve S1) için PCR astar tasarımı.
    Not: Barkod DNA, FRT-flanked kanamisin direnç geni dışında Plasmid içine yerleştirilir, bu nedenle barkod kanamyisin direnç kaseti sonraki kaldırılması sırasında kaybolmaz. Yeni barkod dizileri oluştururken, floresan etiketli hedefe özel PCR problarının (bundan böyle "prob" olarak anılacaktır) verimli bir şekilde yeni sırasına bağlandığından emin olmak için çevrimiçi araçlar kullanın. Oluşturmak için gerekli astar ile birlikte tarih için tasarlanmış ekleme dizileri, Tablolar 2 ve S1sağlanır.
  14. Hazırlamak SDM ticari yüksek doğruluk DNA polimeraz kullanarak reaksiyonlar, istenen astar çiftleri (Tablo 2), ve pSKAP şablonu. Aşağıdaki işlemleri yapmak için termocycler ayarlayın: 1) 98 °C 30 s, 2) 98 °C için 10 s, 56 °C için 15 s, 72 °C 2 dakika, 3) 2, 24 kez, 4) 72 °C 5 dakika, 5), 4 °C ' de tutun.
  15. PCR tamamlandıktan sonra, reaksiyona kısıtlama enzim DPN I ekleyerek pskap şablonu tüketmek. 37 °C ' de 20 dakika boyunca inkübe
    Not: Ürünün boyutunu ve saflığını doğrulamak için, bir agaroz jeli üzerinde PCR 'den ürünler görselleştirilmelidir. Modifiye edilmemiş pSKAP şablonundan oluşan bir kontrol DPN ı sindirimi yapılabilir ve sonraki adımlarında DNA şablonu tamamen sindirilmesi sağlamak için kullanılır.
  16. Üreticinin tavsiyelerine göre ticari kimyasal olarak yetkili DH5α hücrelerin 100 μL dönüştürmek için adım 1,15 ürün 5 μL kullanın.
  17. 25 μg/ml kloramfenikol ile tamamlayıcı lb agar plakaları üzerine Spread transformanlar ve 37 ° c 'de bir gecede inkük.
  18. Gecelik plakalardan bir koloni (veya koloniler) seçin ve 25 μg/ml kloramfenikol ile desteklenen ve 37 °c ' de geceleyin bireysel lb agar plakalarına yerleştirin. Gece plakaları bir koloni seçin ve 25 μg/ml chloramphenicol ile tamamlayıcı lb suyu 5 ml aşılamak için kullanın. Her gece 37 °C ' de sürekli ajitasyon ile kültürü (ler) kulyatın.
  19. Bir ticari Plasmid Sage kiti gece kültürü (ler) plazmids arındırmak için kullanın.
  20. Sanger dizisi M13 ileri sıralı astar kullanarak plazmidler saflaştırılmış (Tablo 2). Mutasyona uğramış bölgeyi orijinal Plasmid ile karşılaştırın ve SDM insertional doğruluk için değerlendir.
  21. Barkod ekleme ve doğruluğu onayladıktan sonra, her barkod ve Plasmid bir isim atayın.
    Not: Tarih için oluşturulan barkodlar iki harfli bir atama atanmıştır: AA, AB, AC,..., BA, BB, BC, vb. Barcoded plazmids pSKAP_AA, pSKAP_AB, pSKAP_AC,..., pSKAP_BA, pSKAP_BB, pSKAP_BC, vb olarak belirtilir.
  22. İstenen sayıda DNA barkodları oluşturmak için 1.14-1.21 arasındaki adımları yineleyin.

2. DNA barkod S kromozom üzerine tanıtmak. Typhimurium

Not: DNA barkodlarının S üzerine yerleştirilmesi . Typhimurium kromozom, S 'de kullanılmak üzere değiştirilmiş olan Datsenko ve Wanner14 tarafından tanımlanan bir allelik değişim yöntemi kullanılarak elde edilir . Typhimurium.

  1. S üzerinde Locus belirleyin . DNA barkodu eklemek için typhimurium genom (Şekil 3).
    Not: Kromozom büyük, interjenik bir bölge seçin. Kodlama içermeyen RNA üreten bölgelerden kaçının. Bu çalışmada, artıklar 1.213.840 ve 1.213.861 (genom montajından GCA_ 000022165.1) arasında belirlenen P koymak için bir Locus aşağı aşağı kullanılmıştır. Bu bölge daha önce genlerin Trans tamamında genetik olarak manipüle edilmiştir15. Alternatif olarak, bir DNA barkod aynı anda ilgi bir geni bozarken tanıtılabilir. Bunu yapmak, bu protokole en az değişiklikler gerektirir ve mutant yaratılmasını kolaylaştırır.
  2. Özel barkod ve frt-flanked kanamisin direnç geni, istenen pskap barkod içeren Plasmid dan adım 1,21 (Tablo 2) yükseltmek için PCR astar tasarımı. 2,1 adımda seçilen bölge için homolog olan 40-nükl uzantıları ekleyin (Tablo 2) her astar 5 ' sonuna.
  3. Bir ticari yüksek sadakat polimeraz, adım 2,2 astar ve istenen pSKAP barkod içeren Plasmid şablon olarak kullanarak amplifikasyon gerçekleştirin. Aşağıdaki işlemleri yapmak için termocycler ayarlayın: 1) 98 °C 30 s, 2) 98 °C için 10 s, 3) 56 °C için 15 s, 4) 72 °C için 60 s, adımları yineleyin 2-4 29 kez, 5) 72 °C 5 dakika, 6) 4 °C ' de tutun.
  4. PCR tamamlandıktan sonra, 1,15 adımda açıklandığı gibi dpni kullanarak şablon DNA 'sı tüketmek. Üreticinin özelliklerine göre ticari bir DNA Temizleme Kiti kullanarak DNA 'Yı arındırın ve konsantre olun.
  5. S'de mutantlar oluşturmak için önceden yayımlanan protokole bakın. Typhimurium strain 14028s PCR ürünleri14,16,17,18.
    Not: Kanamyisin direnç geni kromozom 'dan eksiz olması gerekli değildir. Ancak, genin eksizyonu, bakteri kromozom için minimal şekilde bozulur, böylece potansiyel aşağı genleri çerçeve içinde bırakacak bir 129 BP yara izi oluşur. Kanamyisin direnç geni içeren gerinim, P22 aracılı dönüştürücü ile suşları arasındaki barkodları taşımak için kullanılabilmesi önerilir.
  6. Uygun barkodlarla istenen suşları oluşturmak için 2,3 – 2,5 arasındaki adımları yineleyin.
    Not: Barkodlar vahşi tip S içine tanıtılabilir . Daha sonra daha fazla genetik manipülasyon, veya barkodlar daha önce genetik olarak değiştirilmiş suşları içine tanıtılabilir olabilir typhimurium.

3. bakteriyel büyüme koşulları ve In vitro yarışma Assays

  1. Bakteri stokları, çizgi istenen S. Her liman LB agar plakaları üzerine benzersiz bir DNA barkod typhimurium suşları. 37 ° c 'de bir gecede plakaları kulküat.
  2. Her gerinim tek bir koloni seçin ve lb suyu 5 ml aşılamak. Sabit ajitasyon ile 37 °C ' de 20 h için inkübe.
    Not: Gece kültürünü kullanarak, her bir barkoddan saf genomik DNA (gDNA) toplamak için 3,5 adıma geçin. Bu, Bölüm 6 ' da sonraki doğrulama ve denetim denemeleri için gereklidir.
  3. Her yarışma tahlil için, uygun büyüklükte bir steril tüp içine her gece kültürünün eşit hacimli transfer. İyice en az 5 s için güçlü vortekslenir tarafından birlikte suşları karıştırın.
    Not: Transfer için her gece kültürünün hacmi her koşul ve çoğalmak için yeterli olmalıdır, yanı sıra giriş ölçmek için gDNA yalıtılması için. Mutlak giriş mikroorganizmaları dijital PCR kullanarak nicelleşmiş olacak çünkü kültürlerin optik yoğunlukları ölçmek için tamamen gerekli değildir, her gerinim için giriş bakteri sayısı yaklaşık darboğazları önlemek için eşit olmalıdır veya Deney erken eşit olmayan rekabet. Bu protokolde temsilcilik rekabeti, 8 suşların büyüme oranlarını aynı anda karşılaştırır. Bireysel Deneysel tasarımlar için ek veya daha az suşlar gerekli olabilir.
  4. 4,9 ml steril lb suyu içine karışık inokulumunu 100 μL transfer. İstenilen süre veya istenilen optik yoğunluğa göre 37 °C ' de inküye yapın.
  5. 500 1 dakika boyunca > 12000 x g 'de santrifüjleme ile inokulumunu μL 'yi topla. supernatant çıkarmak ve atmak. Hücrelerle Bölüm 4 ' e hemen geçin.
  6. İstenilen zaman noktalarında, > 12000 x g 'de santrifüjleme ile kültür ve hasat hücrelerinin 500 μL plakaya kaldırmak 1 dakika. supernatant kaldırmak ve atmak.
    Not: Birden fazla zaman noktalarında plakaya toplama,-20 °c ' de Pelet dondurmak ya da hemen her koleksiyondan sonra 4,1 adıma geçin.

4. gDNA 'Yı S. ' den toplama ve ölçme Typhimurium (adım 3,5 ve 3,6)

  1. Bir ticari gDNA arıtma kiti kullanarak hücrelerden gDNA hasat. Varsa, isteğe bağlı RNA tükenmesi adımını gerçekleştirin.
    Not: RNA tükenmesi gerekli değildir; Ancak RNA 'nın varlığı DNA konsantrasyonunu yapay olarak artıracak ve sonraki adımlarda anormal hesaplamalara yol açacaktır. Ticari bir gDNA arıtma kiti kullanıyorsanız, sütunun DNA ile aşırı yüklendiğinden emin olmak için üreticinin önerilerini izleyin. Numunenin sonraki adımlarla ölçülebilir olması durumunda minimum DNA konsantrasyonu gerekmez.
  2. Her örnekteki DNA 'Yı ölçmek için spektrofotometre kullanın.
    Not: DNA herhangi bir güvenilir yöntem kullanılarak nicelik olabilir.
  3. Aşağıdaki denklemin kullanıldığı bakteriyel genom boyutuna göre gDNA kopya numarasını hesaplayın: X ng 'de DNA miktarı ve N bir çift telli DNA molekül (genom boyutu) uzunluğudur.
    figure-protocol-1
    Not: 660 g/mol, 1 DNA BP ortalama kitle olarak kullanılır. organizmanın nüklesotit bileşimine bağlı olarak küçük varyasyonlar bulunabilir. Hesaplama yapmak için birçok hesap online mevcuttur.

5. dDigital PCR üzerinden DNA barkodlarının nicel tespiti için tasarım astar ve problar

  1. Sbarkodlu bölgesini yükseltmek için tasarım astar. Putp , typhimurium kromozom aşağı (Şekil 3c ve Tablo 2).
    Not: Primer ve prob tasarımları çok sayıda çevrimiçi program (malzeme tablosu) tarafından kolaylaştırılabilir. Barkodlar tüm aynı loci takılı ise, amplifikasyon astar tek bir dizi tüm barkodları için evrensel.
  2. Tasarım 6-karboksfloresan (FAM) tabanlı ve/veya hexachlorofluorescein (HEX)-tabanlı problar her barkoddan (Tablo 2 ve S1) özeldir.
    Not: Bu denemede kullanılan damlacık okuyucusu, hem FAM hem de HEX tabanlı probları aynı anda Multiplex bir reaksiyon içinde algılamaya yeteneğine sahiptir. Tasarım 1/2, HEX kullanmak için FAM ve 1/2 kullanmak için problar. Bu gerekli bir adım değildir ancak uygulanırsa reaktif kullanımını ve deneysel maliyetleri azaltacaktır.
  3. 1) 20 mM her ileri ve ters amplifikasyon astar, 2) 10 mM tek bir FAM prob ve 3) 10 mm tek bir HEX prob (Eğer Multiplexing) içeren 20X primer-prob ana karışımları olun.

6. dijital PCR kullanarak her genomik barkod için her Pprimer-prob seti duyarlılık ve özgüllüğü doğrulayın

Not: Bu protokol, sekiz benzersiz barkodları örnek olarak sekiz benzersiz prob ile doğrulama kullanır. Kullanılan barkodların sayısı artan veya çeşitli Deneysel tasarımlar karşılamak için azaltılabilir.

  1. Biri dışında her barkod içeren bir gDNA havuzu oluşturun. Bu havuzu, tek kalan barkodu içeren gDNA ile bir seyreltme serisi gerçekleştirmek için seyreltici olarak kullanın ( Şekil 4' te örnek seyreltme şeması sağlanır).
    Not: Bir seyreltilme olarak havuzlanmış gDNA kullanımı hassasiyet ascertaining sırasında tutarlı bir arka plan sağlar. 4,3 adımda belirlenen kopya numaralarını kullanarak, gDNA 'yı önerilen dijital PCR aralığında bir kopya numarasına seyreltin (20 μL reaksiyon başına 1-100000 kopya). Aralığın, toplam gDNA değil, her benzersiz hedef (barkod) için ayarlanmış olduğunu aklınızda bulundurun.
  2. Prob bazlı Kimya için tasarlanan dijital PCR supermix kullanarak üreticinin tavsiyelerine göre yinelenen dijital PCR için reaksiyonları hazırlayın. 6,1 adım karışımları şablon DNA olarak kullanın. Adım 6,1 yılında seyreltilmiş barkod için prob içeren adım 5,3 20X primer-prob ana karışımı kullanın.
  3. Prob bazlı Kimya için tasarlanan dijital PCR supermix kullanarak üreticinin tavsiyelerine göre dijital PCR için çoğaltır kontrol reaksiyonları hazırlayın. Her prob karışımı için kontrol reaksiyonları 1) şablon kontrolleri (NTCs), 2) negatif kontroller ve 3) pozitif kontroller oluşmalıdır.
    Not: En az sayıda çoğaltma denetimi reaksiyonları iki ' dir. Bu örnek protokol dört NTCs, altı negatif denetim ve her barkod için altı pozitif denetim kullanır. Negatif kontroller, test edilen sondaya karşılık gelen barkod dışında her barkodla gDNA içermelidir. Bu, her yoklama özgüllüğü doğrular.
  4. Her barkodlu gdna örneği için dijital PCR reaksiyonları oluşturmak için 6.1-6.3 arasındaki adımları yineleyin. Şekil 5' te örnek bir plaka düzenlemesi sunulmaktadır.
    Not: Bu ve sonraki adımlar, damlacıkları ve akış tabanlı teknolojiyi kullanan belirli bir dijital PCR platformuna dayanarak açıklanmıştır. Çip tabanlı teknolojiyi kullanan alternatif dijital PCR platformları, bu protokoldeki hafif değişikliklerle kolayca yerine konulabilir. Adım 6,4 tüm astar setleri doğrulamak için 1 96-Well plaka daha fazla gerekebilir. QPCR aksine, dijital PCR tarafından analiz ayrı plakalar kolayca plakalar arasında standardize referans kuyuları gerek kalmadan karşılaştırılabilir.
  5. Üreticinin talimatlarına göre bir damlacık jeneratör kullanarak her reaksiyon durumu için damlacıklar oluşturun.
  6. Yeni oluşturulan damlacıkları uygun 96-Well plakasına aktarın. 5-50 μL çok kanallı pipet üzerinde 200 μL pipet uçları kullanın.
    Not: Damlacıklar pipetleme yaparken, yavaşça ve düzgün pipet! Dijital PCR ekipman üreticisi, belirli bir üreticiden (örneğin, Ranin) sadece Pipetler ve Pipet uçları kullanmanızı önerir. Bu pipet uçları, damlacıkları yok edebilir veya damlacık okuyucusunun mikrofluidiklarına zarar verebilecek mikroskobik plastik parçaları olmayan pürüzsüz bir açılım vardır. Birçok marka ipuçları incelendi ve üretim kalitesi bir spektrumuna sahip gözlenen. Pipet Ucu alternatifleri kullanılarak eşdeğer sonuçlar elde edilmiştir; Ancak, dikkat üreticinin önerileri saparak kullanılmalıdır.
  7. Tüm damlacıklar oluşturulan ve transfer edildikten sonra, bir folyo plaka mühürleyici ile plaka mühür.
  8. Aşağıdaki Bisiklet koşullarını gerçekleştirmek için üretici tarafından önerilen termocycler kullanın: 1) 94 °C 10 dk; 2) 94 °C 1 dk, rampa hızı 1 °C/s olarak ayarlanır; 3) 55 °C 2 dakika, rampa hızı 1 °C/s 'de ayarlanır; 4) adımları yineleyin 2 ve 3 49 kez; 5) 98 °C 10 dk; 6) 4 °C ' ye kadar 24 saate tutun.
    Not: Damlacık reaksiyonunda termal transfer standart PCR ile aynı değildir. Reaksiyon koşulları değiştirilmesi gerekebilir.
  9. Termobisiklet gerçekleştirilirken, örnek adı, deney tipi (mutlak miktarma), kullanılan supermix, hedef 1 adı (FAM barkod adı), hedef 1 tipi (NTC, pozitif kontrol, gibi plaka kurulum bilgileri ile veri analizi yazılımı programı, negatif kontrol veya bilinmeyen), hedef 2 adı (HEX barkod adı), hedef 2 türü (boş, pozitif kontrol, negatif kontrol veya bilinmeyen). Son plaka kurulum bilgileri Şekil 5' te gösterilir.
  10. Termobisiklet tamamlandıktan sonra, tamamlanan reaksiyonları damlacık okuyucusuna aktarın ve okuma sürecini üreticinin talimatlarına göre başlatın.

7. rekabetçi endeks deneyinde bakteri sayısını ölçmek

  1. Seyreltilmiş gDNA, yukarıda açıklandığı gibi, Bölüm 4 ' ten uygun bir konsantrasyona kadar yalıtılmış ve ölçülebilir.
  2. Uygun supermix kullanarak üreticinin tavsiyelerine göre dijital PCR için reaksiyonları hazırlayın. Şablon olarak adım 7,1 DNA kullanın. Denemede bulunan olası barkodlar için prob (ya da FAM ve HEX algılıyorsanız probları) içeren bir 20X primer prob ana karışımı kullanın.
  3. Deneysel tasarımında kullanılan tüm barkodlar tespit edilebilir kadar farklı 20X primer-prob Master karışımları kullanarak adım 7,2 olarak ek dijital PCR reaksiyonlar hazırlayın.
  4. 6,3 'de açıklandığı gibi her koşul için denetimler içerir. Bu 1) şablon denetimleri (NTCs), 2) negatif denetimler ve 3) pozitif denetimler içerir.
  5. 6.5-6.10 adımlarında açıklandığı gibi protokole devam edin.

8. dijital PCR verilerini analiz edin ve mutlak kopya numaralarını hesaplayın

  1. Tüm kuyular okunduğunda ve çalıştırma tamamlandığında, veri analiz yazılımını kullanarak. QLP veri dosyasını açın.
    Not: Burada açıklanan dosya türleri ve veri çözümleme yordamları, bir dijital PCR üreticisine özeldir. Alternatif dijital PCR platformları kullanıyorsanız, dosya türleri ve veri analizi prosedürleri kullanılan platforma özel olacaktır ve üreticinin önerilen özelliklerine göre yapılmalıdır.
  2. Aynı primer-prob ana karışımını kullanan tüm kuyuları seçin.
  3. Damlacıklar sekmesinde, her bir kuyunda (hem pozitif hem de negatif damlacıklar) analiz edilen damlacıklar sayısını inceleyin. Analiz dışında 10.000 toplam damlacıkları daha az olan herhangi bir iyi hariç.
  4. 1D genlik sekmesine gidin ve pozitif ve negatif damlacıklar genlikleri inceleyin. İki farklı nüfus oluşturduğundan emin olun.
  5. Yazılım içinde, kullanılan her prob için pozitif ve negatif damlacıklar arasında bir kesme yapmak için eşik özelliğini kullanın (Şekil 6).
    Not: Adım 5,3 aynı primer-prob ana karışımını kullanan tüm kuyular aynı eşiklere sahip olmalıdır.
  6. Tüm kuyulara uygun eşikler uygulandıktan sonra, yazılım her reaksiyonda DNA kopyası sayısını hesaplayacak. Daha fazla analiz kolaylaştırmak için bir elektronik tabloya veri verme.
    Not: Veri çözümleme yazılımı, kopya numarasını belirlemek için Poisson dağılımına uygun pozitif ve negatif damlacıklar sayısını kullanır.
  7. 8,6 adımından değerleri kullanarak, örnekteki her benzersiz genomik barkodın ilk kopya numarasını hesaplayın. Negatif kontrol reaksiyonları ortalama yanlış pozitif oranı belirlemek ve deneysel reaksiyonlar elde edilen değerlerden bu değeri çıkarın. Her denemeyi (Tablo 3) ayarlarken gerçekleştirilen dilüsyonları temel alarak değerleri gerektiği gibi çarpın.

9. Barcoded suşların dijital PCR tabanlı miktarından CI veya COı hesaplayarak bir organizmanın göreli Fitness belirlemek

  1. Aşağıdaki formülleri kullanarak barkodlu bir gerinim CI hesaplayın: birÇıkış belirli bir timepoint barkodlu gerinim mutlak kantifikasyon, WTÇıkış aynı anda barkodlu vahşi tip bakterilerin mutlak miktarın olduğunu timepoint, birgiriş barkodlu gerinim giriş inokulumunu mutlak kantifikasyon, WTgiriş barkodlu vahşi tip bakterilerin giriş inokulumunu mutlak kantifikasyon olduğunu, XÇıkış tüm suşları toplamı aynı timepoint, Xgiriş tüm barkodlu suşların toplam giriş inokulumunu toplamını olduğunu.

figure-protocol-2
figure-protocol-3
Not: Avantajları, dezavantajları ve her formül en uygun kullanımı için tartışma bakın.

  1. Tüm zaman noktalarında Barkodlu her gerinim için adım 9,1 yineleyin.
  2. Varsa, aşağıdaki formülleri kullanarak COI hesaplayın nerede: birÇıkış mutasyona uğramış gen ile bir barkodlu gerinim mutlak kantifikasyon a verilen timepoint, ABçıkışı bir barkodlu gerinim mutlak kantifikasyon olduğunu aynı timepoint içinde a ve B mutasyona uğramış genler ile, birgiriş mutasyona uğramış gen aile barkodlu gerinim giriş inokulumunu mutlak kantifikasyon, ABgirişi giriş inokulumunu mutlak kantifikasyon olduğunu mutasyona uğramış genler ile barkodlu gerinim a ve b, bçıkışı , belirli bir timepoint 'te mutasyona uğramış gen B ile bir barkodlu gerilimin mutlak ölçüsüdir ve bgirişi , girişin mutlak ölçümlerini oluşturmaktadır. mutasyona uğramış gen Bile barkodlu gerinim inokulumunu.

figure-protocol-4
Veya
figure-protocol-5

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu metodolojinin kullanımı, hedef DNA 'yı tanımlamak için kullanılan her prob hassasiyeti ve özgüllüğü doğrulamak için uygun kontrol reaksiyonları gerçekleştirilmesini gerektirir. Bu temsilci denemede, sekiz benzersiz DNA barkodları ile kimlik tespiti için sekiz probla onaylandı. Tüm sekiz probların hem NTC hem de negatif kontrol reaksiyonları (Tablo 3) yanlış pozitifi düşük bir oranı vardı, oldukça benzer DNA dizileri arasında bile kendi özgülüğü vurgulayarak. Her koşulu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroorganizmaların doğru şekilde ölçülmesine yönelik yetenek, mikrobiyoloji araştırmaları için önemli bir öneme sahiptir ve ilk karma nüfusun benzersiz suşları numaralandırılması, Fitness ve virülans özelliklerini değerlendirmek için paha biçilmez bir araç olduğunu kanıtladı Bakteri. Ancak, bunu gerçekleştirmek için teknikler moleküler biyoloji modern gelişmeler ile ilerlemedi değil. Birçok bakterinin kromozomları kolayca değiştirmek için teknoloji, S dahil . Typhimurium, yaklaşık iki yıl için kullanılabilir ol...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yayında rapor edilen araştırma, George F. Haddix Cumhurbaşkanı fakülte Araştırma Fonu ve Ulusal Sağlık Enstitüsü Genel tıp bilimi (NıH) tarafından GM103427 ödül numarası uyarınca desteklenmektedir. İçerik sadece yazarlar sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmez.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.5 mL mikrosantrifüj tüpleriEppendorf22600028Herhangi bir üreticiden
16 mL kültür tüpleriMidSci8599Herhangi bir üreticiden
temin edin 5-200 & mu; L pipet uçlarıRAININ30389241üretim kalitesine dayalı alternatif uç markalarını dikkatli bir şekilde tedarik edin
; L çok kanallı pipetRAININ17013804Alternatif çok kanallı pipetleri dikkatli kullanın
AgaroseThermoFisher ScientificBP160-500Herhangi bir üreticiden temin
BLAST AnaliziNCBIN/Ahttps://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
C1000 96 Derin Kuyu Reaksiyon Modüllü Dokunmatik TermodöngüleyiciBio Rad 1851197ddPCR malzemelerini Bio Rad'dan temin etmelisiniz. Alternatifler henüz mevcut değil.
Kimyasal olarak yetkin DH5 ve alfa;Invitrogen18258012Herhangi bir üreticiden temin edin veya kendinizi hazırlayın
KloramfenikolThermoFisher ScientificBP904-100Herhangi bir üreticiden temin
edin Cytation5 Mikroplaka okuyucuBioTekCYT5MFdoğru bir şekilde ölçebilen herhangi bir sistemi
kullanınBioRadN/A: ddPCR malzemelerini Bio Rad'dan temin etmelisiniz. Alternatifler henüz mevcut değil.
ddPCR 96 Kuyulu PlakalarBio Rad12001925ddPCR malzemelerini Bio Rad'dan temin etmelisiniz. Alternatifler henüz mevcut değil.
ddPCR Damlacık Okuyucu YağBio Rad1863004ddPCR malzemelerini Bio Rad'dan temin etmelisiniz. Alternatifler henüz mevcut değil.
Problar için ddPCR Supermix (dUTP yok)Bio Rad1863024ddPCR malzemelerini Bio Rad'dan temin etmelisiniz. Alternatifler henüz mevcut değil.
QX200/QX100 Damlacık Jeneratörü için DG8 KartuşlarıBio Rad1864008ddPCR malzemelerini Bio Rad'dan temin etmelisiniz. Alternatifler henüz mevcut değil.
QX200/QX100 Damlacık Jeneratörü için DG8 ContalarıBio Rad1863009ddPCR malzemelerini Bio Rad'dan temin etmelisiniz. Alternatifler henüz mevcut değil.
Problar için Damlacık Oluşturma YağıBio Rad1863005ddPCR malzemelerini Bio Rad'dan temin etmelisiniz. Alternatifler henüz mevcut değil.
KanamisinThermoFisher ScientificBP906-5Herhangi bir üreticiden
Luria-Bertani agarThermoFisher ScientificBP1425-2Herhangi bir üreticiden temin edin veya agar, tripton, maya sindirimi ve NaCl'den kendiniz yapın
Luria-Bertani suyuThermoFisher ScientificBP1426-2Herhangi bir üreticiden temin edin veya tripton, maya sindirimi ve NaCl'den kendiniz yapın
PCR Plakası Isı Yalıtımı, folyo, delinebilirBio Rad1814040ddPCR malzemelerini Bio Rad'dan temin etmelisiniz. Alternatifler henüz mevcut değil.
PCR TüpleriEppendorf951010022Herhangi bir üreticiden
temin edin Petri kaplarıThermoFisher ScientificFB0875712Herhangi bir üreticiden temin
pPCR Komut Kamerası SK+Stratagene/Agilent211192Artık ticari olarak mevcut değil
Primer/Prob TasarımıIDTN/Ahttps://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
pSKAP ve pSKAP_BarcodesAddgenePlazmid numaraları 122702-122726www.addgene.org
PX1 PCR Plaka KapatıcıBio Rad1814000ddPCR malzemelerini Bio Rad'dan temin etmelisiniz. Alternatifler henüz mevcut değil.
QX200 Damlacık JeneratörüBio Rad1864002ddPCR malzemelerini Bio Rad'dan temin etmelisiniz. Alternatifler henüz mevcut değil.
QX200 Damlacık OkuyucuBio Rad1864003ddPCR malzemelerini Bio Rad'dan temin etmelisiniz. Alternatifler henüz mevcut değil.
Salmonella typhimurium suşu ATCC 14028sATCC ATCC 14028swww.atcc.org
Take3 Mikro Hacimli PlakaBioTekTAKE3Herhangi bir üreticiden temin edin, DNA'yı doğru bir şekilde ölçebilen herhangi bir sistemi kullanın
Thermo Scientific FastDigest BamHIThermoFisher ScientificFERFD0054Herhangi bir üreticiden temin
Thermo Scientific FastDigest DpnIThermoFisher ScientificFERFD1704Herhangi bir üreticiden
Thermo Scientific FastDigest HindIIIThermoFisher ScientificFERFD0504Herhangi bir üreticiden temin
Thermo Scientific GeneJet Jel Ekstraksiyonu ve DNA Temizleme Mikro KitiThermoFisher ScientificFERK0832Herhangi bir üreticiden temin
Thermo Scientific GeneJet Miniprep KitiThermoFisher ScientificFERK0503Herhangi bir üreticiden temin
Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA PolimerazThermoFisher ScientificF534LHerhangi bir üreticiden temin
Thermo Scientific T4 DNA LigazThermoFisher ScientificFEREL0011Herhangi bir üreticiden temin
ThermocyclerBio Rad1861096Herhangi bir üreticiden
temin edinUVP Visi-Blue TransilluminatorThermoFisher ScientificUV95043301Veya DNA'nın görselleştirilmesini sağlayan başka bir transilümatör
Su, Moleküler Biyoloji SınıfıThermoFisher ScientificBP28191Herhangi bir üreticiden temin
temin edin 5-50 & mu edin Herhangi bir üreticiden temin edin, DNA Veri Analiz Yazılımını (QuantaSoft ve QuantaSoft Data Analysis Pro) temin edin edin edin temin edin edin edin edin edin edin edin

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beuzón, C. R., Holden, D. W. Use of mixed infections with Salmonella strains to study virulence genes and their interactions in vivo. Microbes and Infection. 3 (14-15), 1345-1352 (2001).
  2. Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Valentine, P. J., Ficht, T. A., Heffron, F. Synergistic effect of mutations in invA and lpfC on the ability of Salmonella typhimurium to cause murine typhoid. Infection and Immunity. 65 (6), 2254-2259 (1997).
  3. Vital, M., Hammes, F., Egli, T. Competition of Escherichia coli O157 with a drinking water bacterial community at low nutrient concentrations. Water Research. 46 (19), 6279-6290 (2012).
  4. Schellenberg, J., Smoragiewicz, W., Karska-Wysocki, B. A rapid method combining immunofluorescence and flow cytometry for improved understanding of competitive interactions between lactic acid bacteria (LAB) and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) in mixed culture. Journal of Microbiological Methods. 65 (1), 1-9 (2006).
  5. Becker, D., et al. Robust Salmonella metabolism limits possibilities for new antimicrobials. Nature. 440 (7082), 303(2006).
  6. Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria. Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).
  7. Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), e1000477(2009).
  8. Ahmer, B. M., Gunn, J. S. Interaction of Salmonella spp. with the intestinal microbiota. Frontiers in Microbiology. 2, 101(2011).
  9. Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
  10. Van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nature Methods. 6 (10), 767(2009).
  11. van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome‐wide fitness and genetic interactions determined by Tn‐seq, a high‐throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Current Protocols in Microbiology. 36 (1), (2017).
  12. Mutalik, V. K., et al. Dual-barcoded shotgun expression library sequencing for high-throughput characterization of functional traits in bacteria. Nature Communications. 10 (1), 308(2019).
  13. Yoon, H., Gros, P., Heffron, F. Quantitative PCR-based competitive index for high-throughput screening of Salmonella virulence factors. Infection and Immunity. 79 (1), 360-368 (2011).
  14. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  15. Henard, C. A., Bourret, T. J., Song, M., Vázquez-Torres, A. Control of redox balance by the stringent response regulatory protein promotes antioxidant defenses of Salmonella. Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36785-36793 (2010).
  16. Poteete, A. R., Fenton, A. C. λ red-dependent growth and recombination of phage P22. Virology. 134 (1), 161-167 (1984).
  17. McCollister, B. D., Bourret, T. J., Gill, R., Jones-Carson, J., Vázquez-Torres, A. Repression of SPI2 transcription by nitric oxide-producing, IFNγ-activated macrophages promotes maturation of Salmonella phagosomes. Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 625-635 (2005).
  18. Shaw, J. A., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium has three transketolase enzymes contributing to the pentose phosphate pathway. Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11271-11282 (2018).
  19. Freter, R., O'Brien, P., Macsai, M. S. Role of chemotaxis in the association of motile bacteria with intestinal mucosa: in vivo studies. Infection and immunity. 34 (1), 234-240 (1981).
  20. Taylor, R. K., Miller, V. L., Furlong, D. B., Mekalanos, J. J. Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (9), 2833-2837 (1987).
  21. Nogva, H. K., Dromtorp, S., Nissen, H., Rudi, K. Ethidium monoazide for DNA-based differentiation of viable and dead bacteria by 5'-nuclease PCR. Biotechniques. 34 (4), 804-813 (2003).
  22. Nocker, A., Camper, A. K. Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques. FEMS Microbiology Letters. 291 (2), 137-142 (2009).
  23. Nocker, A., Cheung, C. -Y., Camper, A. K. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells. Journal of Microbiological Methods. 67 (2), 310-320 (2006).
  24. Nocker, A., Mazza, A., Masson, L., Camper, A. K., Brousseau, R. Selective detection of live bacteria combining propidium monoazide sample treatment with microarray technology. Journal of Microbiological Methods. 76 (3), 253-261 (2009).
  25. Nocker, A., Sossa, K. E., Camper, A. K. Molecular monitoring of disinfection efficacy using propidium monoazide in combination with quantitative PCR. Journal of Microbiological Methods. 70 (2), 252-260 (2007).
  26. Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5111-5117 (2007).
  27. Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, T. A., Roth, J. R. The Alternative Electron Acceptor Tetrathionate Supports B12-Dependent Anaerobic Growth ofSalmonella enterica Serovar Typhimurium on Ethanolamine or 1, 2-Propanediol. Journal of Bacteriology. 183 (8), 2463-2475 (2001).
  28. Taylor, R. G., Walker, D. C., McInnes, R. E. coli host strains significantly affect the quality of small scale plasmid DNA preparations used for sequencing. Nucleic Acids Research. 21 (7), 1677(1993).
  29. Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: Tc R and Km R cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158 (1), 9-14 (1995).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Salmonella KondisyonuBakteriyel KantifikasyonDNA BarkodlarSu RekabetiGenetik Mark rlerDamlac k OkuyucuVeri Analizi

İlgili makaleler