Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Intravital görüntüleme ve sabit doku analizi kullanılarak kanserli hücre yaygınlaştırılması ile Ilişkili Metasküler kapı-aracılı vasküler geçirgenlik tümör Mikroortamının değerlendirilmesi

8.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/59633

⸱

26 Haziran 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Gruss-Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine, 3Integrated Imaging Program, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Surgery, Montefiore Medical Center, 5Department of Pathology, Montefiore Medical Center

Bu makalede

Özet

Biz metastazın tümör mikroortamı ile ilişkili geçici vasküler geçirgenliği değerlendirmek için iki yöntem tarif (tmem) kapı fonksiyonu ve kanser hücresi konvülsyon yüksek molekül ağırlığı İntravenöz enjeksiyon kullanarak (155 kDa) farelerde dekstran. Yöntemleri, canlı hayvanların intravital görüntüleme ve immünofluorescence kullanarak sabit doku analizi içerir.

Özet

Kanserle ilgili mortalite en yaygın nedeni metastaşı, primer tümörden ikincil sitelere kanser hücrelerinin yayılması gerektiren bir süreçtir. Son zamanlarda, primer meme kanserinde kanser hücresi yaygınlaştırılması ve akciğerde metastaz yapan ortamlarda sadece metastatik tümör mikroçevre (TMEM) denilen kapılardan oluşur. Meme kanserinde metastatik hastalığın uzak nüksü için TMEM kapı numarası prognostiktir. Tmem kapılar, bir perivasküler ile doğrudan temas içinde aktin düzenleyici protein Mena aşırı ifade eden bir kanser hücresinden oluşur, TIE2 ve VEGF yüksek düzeyde ifade eden proanjiyojenik makrophaj, bu hücrelerin her ikisi de sıkıca bir kan bağlı olduğu damar endotel hücresi. Kanser hücreleri tmem-ilişkili makrophage ve TMEM-ilişkili Mena-ifade kanser hücresi ortak aktivite tarafından düzenlenmiş geçici vasküler geçirgenlik nedeniyle t kapı yoluyla intravasate olabilir. Bu yazıda, TMEM-aracılı geçici vasküler geçirgenliğin değerlendirilmesi için iki yöntem açıklanmaktadır: intravital görüntüleme ve sabit doku immunofluorescence. Her iki yöntem de avantajları ve dezavantajları olmasına rağmen, iki birleştirerek tmem-mediated vasküler geçirgenlik ve TMEM işlevi için mikroçevresel önkoşulların en eksiksiz analizleri sağlayabilir. Meme kanserinde metastatik süreç ve muhtemelen diğer kanser türleri, TMEM kapı yoluyla kanser hücresi yayma içerir, bu TMEM kapı aktivitesinin analizi için iyi kurulan Yöntemler istihdam esastır. Burada açıklanan iki yöntem, kanser hücresini engelleyen ajanların klinik öncesi denemeleri için önemli olan saf veya farmakolojik olarak tedavi edilen hayvanlarda TMEM kapı aktivitesinin analizine kapsamlı bir yaklaşım sağlar. TMEM ile yaygınlaştırılması.

Giriş

Kanser metastani anlayışımızın son gelişmeler epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) ve bir göç/invazif kanser hücresi alt nüfus indüksiyonu, kendileri tarafından, Hematojen yayma için yeterli olmadığını ortaya çıkardı 1. Nitekim, daha önce tümör neovasküle genellikle düşük perikayt kapsamı ile karakterize olduğu gibi kanser ilişkili endotelyum bütünlüğü ile metasürleme kanser hücrelerinin intravasate düşünülmektedir, ve bu şekilde, çok geçirgen ve kararsız2,3,4. Tümör içindeki kusurlu fonksiyonların son derece düşündürmesine karşın, karsinogenez sırasında vasküler değişiklikler, tümör hücrelerinin kan damarlarını kolayca ve kontrollü olmayan bir şekilde nüfuz edebileceğine dair kanıt sağlamaz. Tümör hücrelerinin floresan olarak etiketlendiği intravital görüntüleme (IVI) çalışmalarından gelen Öngörüler (dekstrus veya kuantum noktaları gibi), damarsal flüoresan probların (örneğin dekstran veya Quantum dots), intravenöz enjeksiyonu ile etiketlenmiştir, tümör damarlarının eşit olduğu düşük molekül ağırlığı çözeltilerini (örneğin 70 KD), yüksek molekül ağırlığı çözeltilerini (155 KD) ve tümör hücrelerinin geçirgen endotelyum sadece, bir vasküler şube noktasında tercihen bulunan konvülsyon özel sitelerde çapraz olabilir5, 6 , 7. immunohistokimyasal (IHC) analiz hayvan modelleri ve insan hasta türevi malzeme kullanarak bu sitelerin "kapı" olduğunu göstermiştir vasküler geçirgenlik düzenleyen uzmanlaşmak, yerel ve geçmeli, kısa bir pencere sağlayarak göç/invazif kanser hücreleri için fırsat dolaşım girmek için. Bu kapılar "metastaz tümör mikroçevre" veya "tmem" olarak adlandırılır, ve, oldukça expectedly, onların yoğunluğu meme kanseri hastalarda metastatik hastalık gelişimi riski ile ilişkilidir8,9, 10' a kadar.

Her tmem kapı hücreleri üç farklı türde oluşur: bir perivasküler makrophage, bir tümör hücresi üzerinde akin-düzenleyici protein memeli etkin (Mena) ifade, ve bir endotel hücre, hepsi birbirleriyle doğrudan fiziksel temas1, 5,9,10,11,12,13. Bir konvülsyon kapı olarak tmem işlevi için önemli olay vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF) perivasküler makrophage14tarafından altta yatan gemi üzerinde lokalize salınım olduğunu. VEGF, endotel hücreleri arasındaki homotipik kavşakları bozabilir15, 16,17,18,19, geçici vasküler kaçak sonuçları bir fenomen, ayrıca "patlama" geçirgenliği olarak bilinen IVI çalışmaları 5' te açıklanmıştır. Tmem macrofajlar, VEGF-aracılı tmem fonksiyonu için gerekli olan Tirozin kinaz reseptörü TIE2, perivasküler niş için bu makrofajların homing ifade gösterilmiştir5,20,21 , 22. kanser hücresi yayılması ve metastezinin düzenlenmesi ek olarak, TIE2+ makrofajlar tümör anjiyogenezi merkezi regülatörleri olarak gösterildi21,22,23, 24, 25,26,27,28,29,30,31. Bu nedenle, TIE2+ macrofajlar tümör mikroortamının önemli bir bileşeni ve metastatik basamakların ana regülatörü temsil eder.

Daha iyi TMEM-aracılı vasküler geçirgenliği (yani "patlama") kavramsallaştırmak için, endotel hücre-hücre kavşak kesilmesi ile ilişkili olmayan vasküler geçirgenlik diğer modlarından ayırt etmek çok önemlidir. Bozulmamış bir endotelium (sıkı ve yapışan kavşakların bozulmamış olduğu), vasküler geçirgenlik üç ana türü vardır: (a) pinsitoz, hangi olabilir, ya da olmayabilir, yutulan malzemenin transkyumuna birleşebilir; (b) malzemenin endotel Fenestrae ile taşınması; ve (c) endotel sıkı kavşak15,16,17,18,19,32 tarafından düzenlenmiş paracellular yolu ile malzemenin taşınması, , 33 , 34. birçok tümörde tanımlanmasına karşın, yukarıda bahsedilen vasküler geçirgenlik modları çoğunlukla normal doku fizyolojisi ve homeostaz bağlamında tanımlanmıştır, bu da aşırı olan dokuları sınırlı geçirgenlik ( Örneğin, kan-beyin bariyeri, kan-testis bariyer), ya da bol geçirgenlik (örneğin, böbrek glomerüler cihaz Fenestre kapillaries)34,35,36,37.

Multifoton intravital görüntüleme ve Multiplexed immünofluorescence mikroskopi kullanarak, meme tümörlerinde TMEM-aracılı vasküler geçirgenlik ("patlama") ve diğer vasküler geçirgenlik modları arasında ayrım yapabiliriz. Bunu başarmak için, yüksek molekül ağırlığı, farelerde floresan etiketli prob tek bir İntravenöz enjeksiyon gerçekleştiriyoruz. Daha sonra spontan patlama olayları canlı farelerde intravital görüntüleme kullanılarak yakalanabilir; veya alternatif olarak, probun ekstrasitasyonu kan damarıyla (örn. CD31+ veya endomucin+) ortak lokalizasyon çalışmaları ve immünofluoresesans mikroskopisi kullanılarak tmem kapı ile nicelik olabilir. Burada sunulan protokoller, bağımsız olarak ya da birbirleriyle birlikte kullanılabilecek bu tekniklerin her ikisini de tarif eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Canlı hayvanları kullanan tüm deneyler hayvan kullanımı ve bakım kuralları ve yönetmeliklerine uygun olarak yapılmalıdır. Bu çalışmada açıklanan prosedürler, deneysel hayvanların bakımı ve kullanımı ile ilgili Ulusal Sağlık Enstitüleri yönetmeliklerine uygun olarak ve Albert Einstein Tıp Koleji hayvan bakımı ve kullanımı onayı ile yürütülmüştür. Komitesi (ıESUC).

1. canlı hayvan görüntüleme kullanarak "patlama geçirgenliği" değerlendirilmesi

  1. Floresan makrofajlar ile fare Konakları içine syngeneic meme tümörlerin nakli
    1. Transplantasyon için uygun tümör dokusu parçaları oluşturun.
      1. Floresan muhabirler38ifade transjenik fareler ile spontan, autochthonous, genetiği değiştirilmiş fare meme kanser modeli mmtv-pymt fareler geçerek fare meme kanser modellerinde floresan etiketli tümörlerin oluşturulması, 39 [örn. gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP), gelişmiş Camgöbeği floresan protein (ecfp) veya Dendra2].
      2. Floresan etiketli tümörlerle MMTV-PyMT fareler 2 cm (yaklaşık 10-12 hafta yaş) daha büyük bir boyuta büyümeye izin verin.
      3. Tüm solunum durduktan sonra 30 saniyeye kadar% 5 Isoflurane ile bir odaya yerleştirerek MMTV-PyMT fareler taşıyan tümör ötenonize.
      4. Servikal dislocation gerçekleştirin.
      5. Topikal bir dondurmacı krem kullanarak ötenize fare karın saç çıkarın.
      6. Buz üzerinde DMEM/F12 hücre kültürü orta ile bir petri çanak yerleştirin.
      7. Fare ve Petri çanak duman kaputu içine buz yerleştirin.
      8. % 70 Etil alkol ile fare karın sanitize.
      9. Steril eldiven ve cerrahi aletler (Sterilized makas, forseps ve bıçak) kullanarak tümörlerin kaldırmak ve Petri çanak içine yerleştirin.
      10. Tümör küçük parçalar halinde (~ 2 mm x 2 mm x 2mm boyutunda), herhangi bir nekrotik porsiyonları atarak, onlar Petri çanak iken kesip.
    2. Tümör parçalarını alıcının konaklarına nakletme.
      1. Genetik olarak tasarlanan floresan etiketli makrofajlar, örneğin MacGreen40 veya macblue 41 Mice (Csf1r-GAL4VP16/UAS-ecfp) ile fareler yükseltin
      2. Floresan etiketli makrofajlar ile FVB fareler ~ 4-6 hafta yaş büyümeye izin verin).
      3. Bir oda içinde floresan etiketli makrofajlar ile fvb fareler anestezize bir taşıyıcı gaz olarak oksijen ile% 5 izofluran kullanarak.
      4. Anestezi azaltmak ~ 3% Isoflurane ve kuruma önlemek için fare gözlerine oftalmik merhem uygulayın.
      5. Fare 4inci meme bezi üzerinden saç çıkarın.
      6. Deriyi Betadine ile temizleyin. Prosedürün geri kalanı boyunca steril koşulların korunması önemlidir. Bu sterilize enstrümanlar ve reaktifler kullanarak içerir.
      7. Küçük bir kesi olun ~ 2-3 mm sadece 4TH meme aşağı.
      8. Meme yağ yastığı maruz olana kadar incelemek.
      9. Suni hücre dışı matriks Petri tabak ve ceket bir tümör parçası alın.
      10. 4. meme yağlı yastık altında nakil tümörleridir.
      11. Siyoakrilat yapıştırıcı kullanarak kesi kapatın.
      12. Anestezi tamamen kurtarır ve sternal recumbency korumak mümkün olana kadar sürekli hayvan izlemek. Ayrıca, tam iyileşme kadar diğer hayvanların şirkete hayvan iade etmeyin.
      13. Enfeksiyonları en aza indirmek için, hayvan içme suyu şişesi (8 fl oz) için 100 mg/ml enrofloksasin etken maddelerini antibiyotik 1 ml ekleyin.
      14. Tümör (~ 5 mm; ~ 4 hafta) palpe kadar büyümeye izin verin.
      15. Denemeye bağlı olarak, fareleri tedavi gruplarına ayırın ve uygunsa ilgili tedavileri gerçekleştirin.
  2. İntravital görüntüleme için kurulum
    1. Mikroskobun iki foton lazeri ve dedektörleri açın.
    2. Isıtma kutusunu açın ve mikroskobun x-y aşamasını önceden ısıtın.
    3. Özel yapılan Aşama Ekle42 x-y aşamasına yerleştirin.
  3. Görüntüleme penceresinin hazırlanması
    1. Görüntüleme için ayarlanmadan önce, özel yapılmış dairesel görüntüleme pencere çerçevesi42otoklav.
    2. Pencere çerçevesine ince bir siyanoakrilat yapıştırıcı tabakası yerleştirmek ve 8 mm 'lik dairesel kapak camı yerleştirmek için bir pipet veya bir insülin şırınga kullanın.
      Not: 1) kapak camının net diyaframında kalıntı almamak önemlidir. 2) görüntüleme için kullanmadan önce en az 1 saat pencere çerçevesine kapak camı uyulması önemlidir.
    3. Küçük bir miktarda aseton ile ıslatılmış bir laboratuvar silme kullanılarak, kapak camının açık diyafram açıklığı üzerinde herhangi bir aşırı siyanoakrilat ile dikkatle temizleyin.
  4. Görüntüleme sırasında sıvıların ve floresan boyaların uygulanması için kuyruk ven kateteri hazırlanması
    1. Bir kuyruk ven kateter oluşturmak için polietilen boru 30 cm parça kes.
    2. 30 G iğnesinin iğne kısmını Luer konik tarafından hafifçe kırılana kadar iğneyi ileri geri eğerek ayırın.
      Not: iğne ucu Luer konik değil, yakın tutulmalıdır. Bu iğne sopa yaralanmasını önlemek için iğne kavramak için penye veya forseps ile gerçekleştirilebilir.
    3. İğne Künye ucunu polietilen tüpün bir ucuna takın.
    4. Başka bir 30 G iğne keskin ucunu takın, Luer konik bağlı tutarak, tüp karşı ucuna.
    5. 1 cc şırıngayı fosfat tamponlu tuz ile doldurun, montajlı kateterin luer konik içine takın ve kuyruk ven kateterini sistemde hava kabarcıkları olmadığından emin olun.
    6. Vasküler etiketleme için, 1 cc şırıngayı 100 μL, 10 mg/kg 155 kDa dextran-tetramethylrhodamine (TMR) veya Quantum dots ile doldurun.
  5. Görüntüleme için fare hazırlanması
    1. Altında bir kafeste fare anestezize (~ 1 ayak altında) bir ısı lambası kullanarak 4%-5% Isoflurane ile karışık 100% oksijen bir akış için ayarlanmış 1.5-2 L başına dk.
    2. Cerrahi çalışma alanı üzerinde ısı lambası açın. Bu adım, cerrahi sırasında fare çekirdek fizyolojik vücut sıcaklığını korumak için önemlidir.
    3. Isı lambası altında fareyi yerleştirin ve cerrahi süresi için% 2-3% anestezi aşağı.
      Not: ısı lambayı güvenli bir mesafeden (~ 1 ayak) uzak tutmak için fareyle aşırı ısınmayı önlemek için emin olun.
    4. Göz ve körlüğün kurutulması önlemek için fare gözleri üzerinde oftalmik merhem yerleştirin.
    5. Fare parmak-tutam testi gerçekleştirerek anestezize olduğunu test edin. Eğer hayvan geri çekilirse, ısofluran dozajı% 1 oranında artar ve 1-2 dk. içinde yeniden test edilir.
    6. Tail ven kateteri kuyruğun en distal noktasına yerleştirin.
    7. Tail ven kateteri kuyruk etrafında sarar ve dislodged almaz emin olmak için iğne sopa laboratuar bandı küçük bir parçası ile kuyruğuna yapıştırır.
    8. Yeterli hidrasyon sağlamak için kuyruk ven kateterine PBS başına 50 μL enjekte edilir. Bu fare için ölümcül olabilir gibi çok fazla sıvı (h başına 200 μL) veya kateter içine herhangi bir kabarcıkları enjekte önlemek için önemlidir.
    9. 4TH ve 5inci meme bezleri üzerinde karın üzerinde saç kaldırma dondurmalı krem kullanarak.
    10. Deriyi Betadine ile temizleyin ve cildin kurumasına izin verin.
    11. Bir uzunlamasına orta çizgi kesi hemen genital üstün başlayan ve 4inci meme bezi üstün yönü seviyesine kesi taşımak olun.
    12. 4inci Meme bezinin üstün yönü için kesi enine taşıyın. Bu noktada kan kaynağının ödün vermemek için önemlidir.
    13. Steril forseps ve makas kullanarak bir doku flep oluşturarak peritonum kapalı meme yağ Pad incelemek.
      Not: cilt flep görüntüleme önemli hareket eserler ve doku dehidrasyon duyarlıdır. Bu kaçınılmaktadır, daha önce43açıklandığı gibi,44, flep cilt tarafına arkasında kauçuk sert bir parça yapıştırarak (yumuşak doku düzeltmek ve vücudun geri kalanından izole etmek için) ve daha sonra sığ bir görüntüleme içine tümör yerleştirerek hidrasyon korumak için pencere. Bu bu ortamda tümör ve çevreleyen doku çok uyumlu olarak istikrarlı görüntüleme için önemlidir.
    14. (Siyanoakrilat tutkal ile) yapıştırarak cilt flep stabilize 2 cm x 2 cm kapak cilt tarafına ölçüm küçük bir parça sert kauçuk. Tümör, lastik tarafından stabilize edilen bölgenin merkezinde olmalıdır.
    15. PBS damlaları ile nemlendirici maruz doku tutun.
    16. Özel yapılmış görüntüleme penceresi çerçevesinin dış kenarına siyanoakrilat küçük bir film uygulayın.
    17. Kapak camının ortasına küçük bir PBS (~ 10 – 20 μL) damlacık uygulayın.
    18. Çevredeki flep dokusunu laboratuar silme ile kurutun. Pencere çerçevesindeki siyanoakrilgeç, cam üzerindeki PBS ile temas etmediği için, bu siyanoakrilgeç polimerize ve zamanından önce ayarlanmasına neden olduğundan emin olmak için önemlidir.
    19. Şeffaf diyafram merkezinde tümör ile doku flep için küçük görüntüleme penceresini yapıştırın.
    20. Isıtma kutusunu sahneden çıkarın.
    21. Anestezize fare ve kuyruk ven kateteri mikroskop aşamasına aktarın. Kuyruk ven kateteri düşmemesi için aşırı dikkatli olun.
    22. Eğilme pozisyonunda sahne fare yerleştirin.
    23. Anestezinin bakımını sağlamak için isofluran 'ın burun konisini burnun üzerine yerleştirin.
    24. Pencereyi özel x-y aşama plakasının üzerindeki delik içine takın.
    25. Fizyolojik bir sıcaklık sağlamak için Isıtma kutusunu sahneye geri yerleştirin.
    26. Arka pençe için klip sensörü üzerinden bir Nabız oksimetre prob ekleyerek hayvanın hayati belirtileri izleyin.
    27. Yeterli kan akışını korumak ve fare anestezisi üzerinde önlemek için yavaşça% 0.5-1% ısofluran azaltın.
  6. İntravital görüntüleme
    Not: Bu bölümde tarif ettiğimiz görüntüleme, daha önce5,39,45olarak açıklanan özel yapılı iki lazer multifoton mikroskop üzerinde gerçekleştirildi. Kısaca, bir femtosaniye lazer 90 femtosaniye darbeli Lazer ışık 880 nm merkezli oluşturmak için kullanılır. Floresan ışık dört eşzamanlı alma dedektörlerinin üçü ile algılanır (mavi = 447/60, yeşil = 520/65, ve kırmızı 580/60; merkezi dalga boyu/bant genişliği) bir dikroik tarafından uyarma ışığında ayrılması sonra (Chroma, Z720DCXXR). Mikroskop standı içeren bir 25x, 1,05 NA (sayısal diyafram) uzun çalışma mesafesi (2 mm) objektif lens. Özel olarak üretilmiş bir mikroskop kullanıldığında, aşağıda açıklanan protokol, ticari olarak kullanılabilen multifoton mikroskop üzerinde de gerçekleştirilebilir.
    1. 25x, 1,05 NA mikroskop hedefi ve optik temas yapmak için pencerenin kapak camı arasında damıtılmış su bir damla yerleştirin.
    2. Pencere yüzeyine yakın floresan tümör hücreleri olan alanlara odaklanmak için mikroskop mercek kullanın.
    3. Akan kan damarlarını ve etiketli makrofajları bulun. Damar dinamiklerini değerlendirmek için kan damarlarının akan olması önemlidir.
    4. Mikroskopla multifoton moduna geçin.
    5. Yaklaşık 50 μm ölçen z-serisinin üst ve alt sınırlarını ayarlayın.
      1. Z-serisinin üst sınırını, hedefi istenen başlangıç konumuna, en yüzeysel pozisyonda taşımak ve Z konumuna üst düğmeye tıklayarak yazılım içinde sıfır olarak işaretlemek için odak ayarlayıcısı kullanarak ayarlayın.
      2. Z-serisinin alt sınırını, hedefi en derin tabakaya taşıyarak (genellikle daha küçük tümörlerde 50-70 μm) ve Z konumu alt butonuna tıklayarak ayarlayın.
      3. Z-Step boyutunu 5 μm olarak ayarlayın.
    6. Zaman atlama paneli düğmesini tıklatın ve objektif lensin üzerindeki suyu doldurmak için yeterli zaman sağlamak üzere satın almalar arasındaki zaman aralığını en az 10 sn 'ye ayarlayın. Bu uzun zaman atlamalı sırasında amaç üzerinde bir sıkmak pipet ile elle yapılır.
    7. Kuyruk ven kateterine PBS ile şırınga çıkarın ve 155 kDa dextran-TMR (tetrametil Rhodamine) içeren başka bir şırınga ile değiştirin.
    8. Kuyruk ven kateter üzerinden 155 kDa dextran-TMR 100 μL enjekte.
    9. Enjeksiyondan sonra TMR şırıngasını PBS şırıngası ile değiştirin.
    10. Z-Stack ve Time-Lapse düğmelerini tıklayarak ve ardından kayıt düğmesine tıklayarak z-Stack zaman aşımı görüntüleme elde etmek.
    11. Hayvan yeterli hidrasyon korumak için her 30-45 dk PBS 50 μL enjekte. Bu sıvı aşırı yükleme neden olabilir gibi zaman zaman 200 μL enjekte kaçının.
  7. Ötenazi
    1. Isofluran% 5 ' e artırın ve solunum durdurulduktan sonra 30 s kadar yerinde burun koni ile% 5 izofluran altında hayvan tutmak.
    2. Fareyi aşamasından çıkarın.
    3. Servikal dislocation gerçekleştirin.
  8. Görüntü işleme
    1. Imagej içine tüm görüntüleri yükleyin ve 5 boyutlu hyperstack (x, y, z, t ve renk kanalı) onları biçimlendirmek.
    2. Spektral örtüşme ayrımı gerçekleştirin (örn: GFP ve CFP) ve38kurulan yöntemleri kullanarak hyperstacks x-y drift ortadan kaldırılması.
    3. Arka plan sinyalinin görünür hale gelmesi için kan kanalının beyaz seviyesini artırmak üzere parlaklık ve kontrast ayarını kullanın.
    4. Her z dilimi için, her filmi geçici vasküler sızıntı belirtileri için dikkatle inceleyin ("patlama"). Film hızlı kare hızları (40 fps) bu kimlik yardımcı olabilir koşma.
    5. Bir patlama belirlendikten sonra, bu kanalın parlaklığını normal bir seviyeye döndürür ve hyperstack 'i bu bölgeye ve z dilimine kırpın.

2. sabit doku analizi kullanılarak ekstrasküler dekstrün değerlendirilmesi

  1. Tümör ve numune hazırlama
    Not: bu protokolün 2 'nci bölümü, meme tümörlerinin meme Karsinomu (örn. mmtv-PyMT) Ortotopik transplantasyon fare modelinden hasat edildiğini varsayar. Bu model, protokolün 1St bölümünde açıklanan aynı olabilir, floresan etiketli tümörlerin bu noktada gerekli olmasa da.
    1. Deneysel boru hattının sonlandırılmasından sonra (örn. ilaç tedavileri, vb.), fareler ödün vermeden önce 10 mg/mL 155 kDa dextran-tetrametil Rhodamine, 1 h 100 μL bir kuyruk-boşuna enjeksiyon gerçekleştirin.
    2. Fareler feda ve göğüs tümörlerini hasat.
    3. 48-72 h için% 10 formalin içinde tümörler düzeltin ve parafin-katıştırma devam edin.
    4. Bir mikrotome kullanarak, formalin-sabit parafin-katıştırılmış (FFPE) dokulardan iki 5 μm kalınlığında sıralı slaytlar kesti. Bir slayt dextran boyama için kullanılır, diğer TMEM üç-ıFC gerçekleştirmek için kullanılacak iken, referans için.
      Not: TMEM üç-immunohistokimya Protokolü başka bir yerde 10tanımlanmıştır.
  2. İki sıralı bölümden ilki için boyama ve tarama
    1. Slaytları standart bir de-paraffinization protokolüne gönderin. Bu Ksilin iki sonraki Immersions içerir (10 dk her), seri seyreltilmiş alkol çözümleri dehidrasyon takip (100%, 95%, 70%, ve 50% EtOH H2O 2 dk her daldırma için).
    2. Antijen alımı (kaynama noktasına yakın) Isıtma ile gerçekleştirin (pH 6,0-düzeltilmiş) sitrat içinde altı bölümleri 20 dakika boyunca.
    3. Numuneler 15-20 dakika için oda sıcaklığına serin ve sonra 2 dakika her yıkama için PBS 3x yıkayın edelim.
    4. Engelleme arabelleğinde 60-90 dk için blok (% 10 FBS; 1% BSA; 0,0025% balık cilt jelatin; 0,05% PBST, yani PBS ile% 0,05 Ara-20).
    5. Numuneleri, sırasıyla Endomucin ve TMR 'ı hedefleyen primer sıçan ve tavşan antikorlarının karışımı ve sonra PBST 3x, 2 dk. içinde yıkayın.
    6. Fare IgG (Alexa-647) ve tavşan IgG (Alexa-488 için konjuated) karşı ikincil eşek antikorları karışımı ile numuneler inkük ve sonra PBST 3x 2 dk her yıkayın.
    7. Rutin bir DAPı boyama gerçekleştirin (yani 5-6 dk için DAPı çözeltisi daldırma), bir glisersiz "Hard" montaj ortamı kullanarak slaytlar monte ve tarama kadar karanlık bir yerde saklayın.
    8. Optimum sonuçlar için, slaytları dijital tüm slayt tarayıcısıyla tarayın.
  3. Görüntü Analizi
    1. Dijital patolojiye uygun herhangi bir yazılımı kullanarak, her durumda 10 yüksek güç alanı (HPFs) yakalayın.
    2. Endomucin (kırmızı) ve TMR (yeşil) kanalları TIFF olarak ayrı olarak kaydedin.
    3. Imagej kullanarak, TIFF dosyaları yükleyin ve 8-bit görüntüleri dönüştürmek.
    4. 8 bitlik görüntüleri negatif kontrol düzeyine eşik ve Endomucin ve TMR "maskeleri" gösteren iki binarized görüntüler oluşturun.
    5. İkili araçlardan, Endomucin maskesinde Dolgu delikleri 'ni seçin.
    6. Aşağıdaki beş ilgi alanı oluşturun ve kaydedin: 1) "dekstran Roi" (ROI1), 2) olarak eşli dekstran görüntü "vasküler Roi" (ROI2), 3) olarak eşli endomucin görüntü olarak ters endomucin görüntü "ekstrasküler YG" (ROI3), 4) kesişen " Ekstrasküler YG "ve" dextran ROI "görüntü (ROI1 ∩ ROI3)" Ekstrasküler dextran ROI "(ROI4), ve 5) olarak tüm görüntü" tümör ROI "(ROI5).
    7. ROI5 alanı tarafından ROI4 alanı bölmek ve 100 tarafından çarpı ekstrasküler dekstran tüm tümör kapsar yüzde alanı oluşturmak için.
    8. 10-20 için işlemi yineleyin (doku kullanılabilirliği bağlı olarak) durum başına HPFs ve her durumda ortalama bir Ekstrasküler dextran (% alan) üretir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu Protokol makalesinde açıklanan deneysel yordamlar kısaca özetlenmiştir ve Şekil 1A-C' d e gösterilmektedir.

TMEM-aracılı vasküler geçirgenliği ölçmek ("patlama aktivitesi") ve vasküler geçirgenlik diğer modlarından deneysel gürültüyü azaltmak için (örneğin, tanıtımlarda açıklandığı gibi, transselüler ve paracellular), intravenöz (serum) yüksek moleküler ağırlık probları enjeksiyon, 155 gibi kDa dextran, tetrametil Rhodamine konjuit. Düşük molek...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, TMEM kapılardan mevcut olan belirli bir vasküler geçirgenlik tipini görselleştirmeye ve ölçmek için uygulanabilir iki protokol özetlemektedir ve damar geçirmez ve yapışan kavşaların bozulması ile ilişkilidir. Vasküler geçirgenlik bu tür geçici ve üçlü TMEM hücre kompleksi tarafından kontrol edilir, yukarıda açıklandığı gibi5. TMEM-Associated vasküler geçirgenliği belirlemek ve ölçmek yeteneği, bir yanlısı metastatik kanser hücresi mikroortamının değerlendirilmesi için çok önemlidir, hem de...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir ilgi çatışması ifşa.

Teşekkürler

Biz görüntüleme desteği için Albert Einstein Tıp Koleji 'nde analitik görüntüleme tesisi (AıF) teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NCı (P30CA013330, CA150344, CA 100324 ve CA216248), SIG 1S10OD019961-01, Gruss-Lipper Biophotonics merkezi ve entegre görüntüleme programı ve Montefiore 's Ruth L. Kirschstein T32 cerrahlar eğitim hibe tarafından destekleniyordu Tümör mikroçevre çalışması için (CA200561).

GSK el yazması, şekil 1C ve 3B için görüntüleme gerçekleştirilen, sabit doku analizi protokolü geliştirdi ve analiz ve tüm verileri yorumlanan; JMP el yazması yazdı ve Şekil 1B, 2C ve 3A için cerrahi ve intravital görüntüleme yapıldı; LB & AC , şekil 2B için cerrahi ve intravital görüntüleme işlemi gerçekleştirdi; RJ , Şekil 2A için cerrahi ve intravital görüntüleme işlemi gerçekleştirdi; JSC Co-el yazması yazdı ve analiz ve tüm verileri yorumlanan; Mho Co-el yazması yazdı ve analiz ve tüm verileri yorumlanan; ve de şekil 2D için cerrahi ve intravital görüntüleme gerçekleştirilen, el yazması ortak yazdı, sabit doku analizi ve intravital görüntüleme protokolleri geliştirdi, ve analiz ve tüm verileri yorumlanan.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Anti-tavşan IgG (Alexa 488)Life Technologies CorporationA-11034
Anti-sıçan IgG (Alexa 647)Life Technologies CorporationA-21247
Sığır Serumu AlbüminFisher ScientificBP1600-100
SitratEng Scientific Inc9770
Kapak Cam FişleriElektron Mikroskobu Bilimleri72296-08
Siyanoakrilat YapıştırıcıHenkel Yapıştırıcı1647358
DAPIPerkin ElmerFP1490
Dekstran-Tetrametil-RodaminSigma AldrichT1287
DMEM / F12Gibco11320-033
Endomüsin (birincil antikor)Santa Cruz Biyoteknolojisc-65495
EnrofloksasinBayer84753076 V-06/2015
Fetal Sığır SerumuSigma AldrichF2442
Balık Derisi JelatinFisher ScientificG7765
İnsülin ŞırıngaBecton Dickinson309659
İzofloranHenry ScheinNDC 11695-6776-2
MatrigelCorningCB40234Yapay hücre dışı matris
İğnesi (30 G)Becton Dickinson305128
Fosfat Tamponlu TuzluYaşam Teknolojileri A.ŞPBS
Polietilen BoruBilimsel Emtialar A.ŞBB31695-PE / 1
Nabız OksimetresiKent ScientificMouseOx
Puralube Veteriner MerhemDechraNDC 17033-211-38
Quantum DotsLife Technologies CorporationQ21561MP
KauçukMcMaster Carr1310N14
TMR (birincil antikor)InvitrogenA6397
Tween-20MP Biyolojik TWEEN201
KsilenFisher Bilimsel184835
. .

Kaynaklar

  1. Karagiannis, G. S., Goswami, S., Jones, J. G., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Signatures of breast cancer metastasis at a glance. Journal of Cell Science. 129 (9), 1751-1758 (2016).
  2. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  3. Raza, A., Franklin, M. J., Dudek, A. Z. Pericytes and vessel maturation during tumor angiogenesis and metastasis. American Journal of Hematology. 85 (8), 593-598 (2010).
  4. Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Experimental Cell Research. 316 (8), 1324-1331 (2010).
  5. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  6. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  7. Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Research. 67 (6), 2649-2656 (2007).
  8. Sparano, J. A., et al. A metastasis biomarker (MetaSite Breast Score) is associated with distant recurrence in hormone receptor-positive, HER2-negative early-stage breast cancer. npj Breast Cancer. 3, 42(2017).
  9. Rohan, T. E., et al. Tumor microenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 106 (8), (2014).
  10. Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clinical Cancer Research. 15 (7), 2433-2441 (2009).
  11. Pignatelli, J., et al. Invasive breast carcinoma cells from patients exhibit MenaINV- and macrophage-dependent transendothelial migration. Science Signaling. 7 (353), 112(2014).
  12. Oktay, M. H., Jones, J. G. TMEM: a novel breast cancer dissemination marker for the assessment of metastatic risk. Biomarkers in Medicine. 9 (2), 81-84 (2015).
  13. Roussos, E. T., et al. Mena invasive (Mena(INV)) and Mena11a isoforms play distinct roles in breast cancer cell cohesion and association with TMEM. Clinical & Experimental Metastasis. 28 (6), 515-527 (2011).
  14. Harney, A. S., et al. The Selective Tie2 Inhibitor Rebastinib Blocks Recruitment and Function of Tie2(Hi) Macrophages in Breast Cancer and Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (11), 2486-2501 (2017).
  15. Bates, D. O., Lodwick, D., Williams, B. Vascular endothelial growth factor and microvascular permeability. Microcirculation. 6 (2), 83-96 (1999).
  16. Lee, Y. C. The involvement of VEGF in endothelial permeability: a target for anti-inflammatory therapy. Current Opinion in Investigational Drugs. 6 (11), 1124-1130 (2005).
  17. Roberts, W. G., Palade, G. E. Neovasculature induced by vascular endothelial growth factor is fenestrated. Cancer Research. 57 (4), 765-772 (1997).
  18. Stan, R. V., et al. Immunoisolation and partial characterization of endothelial plasmalemmal vesicles (caveolae). Molecular Biology of the Cell. 8 (4), 595-605 (1997).
  19. Roberts, W. G., Palade, G. E. Increased microvascular permeability and endothelial fenestration induced by vascular endothelial growth factor. Journal of Cell Science. 108, Pt 6 2369-2379 (1995).
  20. Arwert, E. N., et al. A Unidirectional Transition from Migratory to Perivascular Macrophage Is Required for Tumor Cell Intravasation. Cell Reports. 23 (5), 1239-1248 (2018).
  21. Kadioglu, E., De Palma, M. Cancer Metastasis: Perivascular Macrophages Under Watch. Cancer Discovery. 5 (9), 906-908 (2015).
  22. Hughes, R., et al. Perivascular M2 Macrophages Stimulate Tumor Relapse after Chemotherapy. Cancer Research. 75 (17), 3479-3491 (2015).
  23. Riabov, V., et al. Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis. Frontiers in Physiology. 5, 75(2014).
  24. Squadrito, M. L., De Palma, M. Macrophage regulation of tumor angiogenesis: implications for cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 123-145 (2011).
  25. Ferrara, N. Role of myeloid cells in vascular endothelial growth factor-independent tumor angiogenesis. Current Opinion in Hematology. 17 (3), 219-224 (2010).
  26. Solinas, G., Germano, G., Mantovani, A., Allavena, P. Tumor-associated macrophages (TAM) as major players of the cancer-related inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 86 (5), 1065-1073 (2009).
  27. Venneri, M. A., et al. Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer. Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).
  28. Lewis, C. E., De Palma, M., Naldini, L. Tie2-expressing monocytes and tumor angiogenesis: regulation by hypoxia and angiopoietin-2. Cancer Research. 67 (18), 8429-8432 (2007).
  29. Mazzieri, R., et al. Targeting the ANG2/TIE2 axis inhibits tumor growth and metastasis by impairing angiogenesis and disabling rebounds of proangiogenic myeloid cells. Cancer Cell. 19 (4), 512-526 (2011).
  30. Lewis, C. E., Ferrara, N. Multiple effects of angiopoietin-2 blockade on tumors. Cancer Cell. 19 (4), 431-433 (2011).
  31. Gabrusiewicz, K., et al. Anti-vascular endothelial growth factor therapy-induced glioma invasion is associated with accumulation of Tie2-expressing monocytes. Oncotarget. 5 (8), 2208-2220 (2014).
  32. Karagiannis, G. S., Condeelis, J. S., Oktay, M. H. Chemotherapy-induced metastasis: mechanisms and translational opportunities. Clinical & Experimental Metastasis. , (2018).
  33. Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219 (4587), 983-985 (1983).
  34. Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).
  35. Satchell, S. C., Braet, F. Glomerular endothelial cell fenestrations: an integral component of the glomerular filtration barrier. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 296 (5), 947-956 (2009).
  36. Stan, R. V. Endothelial stomatal and fenestral diaphragms in normal vessels and angiogenesis. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11 (4), 621-643 (2007).
  37. Mruk, D. D., Cheng, C. Y. The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation. Endocrine Reviews. 36 (5), 564-591 (2015).
  38. Entenberg, D., et al. Imaging Tumor Cell Movement in Vivo. Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-19 (2013).
  39. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  40. Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  41. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. Journal of Leukocyte Biology. 83 (2), 430-433 (2008).
  42. Entenberg, D., et al. Time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
  43. Pastoriza, J. M., et al. Black race and distant recurrence after neoadjuvant or adjuvant chemotherapy in breast cancer. Clinical & Experimental Metastasis. , (2018).
  44. Williams, J. K., et al. Validation of a device for the active manipulation of the tumor microenvironment during intravital imaging. Intravital. 5 (2), 1182271(2016).
  45. Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment. Journal of Visualized Experiments. (112), e54042(2016).
  46. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  47. Roussos, E. T., et al. Mena invasive (MenaINV) promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer. Journal of Cell Science. 124, Pt 13 2120-2131 (2011).
  48. Karagiannis, G. S., et al. Neoadjuvant chemotherapy induces breast cancer metastasis through a TMEM-mediated mechanism. Science Translational Medicine. 9 (397), (2017).
  49. Chang, Y. S., Jalgaonkar, S. P., Middleton, J. D., Hai, T. Stress-inducible gene Atf3 in the noncancer host cells contributes to chemotherapy-exacerbated breast cancer metastasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (34), 7159-7168 (2017).
  50. Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
  51. Winkler, F., et al. Kinetics of vascular normalization by VEGFR2 blockade governs brain tumor response to radiation: role of oxygenation, angiopoietin-1, and matrix metalloproteinases. Cancer Cell. 6 (6), 553-563 (2004).
  52. Goel, S., et al. Normalization of the vasculature for treatment of cancer and other diseases. Physiological Reviews. 91 (3), 1071-1121 (2011).
  53. Jain, R. K. Normalizing tumor microenvironment to treat cancer: bench to bedside to biomarkers. Journal of Clinical Oncology. 31 (17), 2205-2218 (2013).
  54. Carmeliet, P., Jain, R. K. Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (6), 417-427 (2011).
  55. Meijer, E. F., Baish, J. W., Padera, T. P., Fukumura, D. Measuring Vascular Permeability In Vivo. Methods in Molecular Biology. 1458, 71-85 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

TMEM Kapı YoluSabit Doku İmmünofloresansıYüksek Moleküler Ağırlıklı DekstranEndomusin BoyamasıTMR Dekstran İşaretlemesiEkstravasküler Dekstran Analizi
Intravital görüntüleme ve sabit doku analizi kullanılarak kanserli hücre yaygınlaştırılması ile Ilişkili Metasküler kapı-aracılı vasküler geçirgenlik tümör Mikroortamının değerlendirilmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.