Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Farelerde Kalp Yetmezliğine Neden Olmak Için İzoproterenol Mini PompasıNın İmplantasyonu

11.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/59646

⸱

3 Ekim 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, University of California, 2Department of Medicine, University of California, 3Department of Microbiology, Immunology & Molecular Genetics, University of California, 4Department of Molecular, Cell, and Developmental Biology, University of California

Bu makalede

Özet

İmplante ozmotik pompa ile izoproterenol kronik uygulama farelerde ileri kalp yetmezliği taklit etmek için yaygın olarak kullanılmıştır. Burada, 3 hafta boyunca sürekli izoproterenol uygulaması için cerrahi mini pompa implantasyonunda ayrıntılı yöntemlerin yanı sıra başarılı model oluşturma için ekokardiyografik değerlendirme yi açıklıyoruz.

Özet

Izoproterenol (ISO), seçici olmayan bir beta-adrenerjik agonisttir, farelerde kardiyak yaralanmaya neden olmak için yaygın olarak kullanılır. Akut model strese bağlı kardiyomiyopatiyi taklit ederken, ozmotik pompa ile yönetilen kronik model, insanlarda ileri kalp yetmezliğini taklit eder. Açıklanan protokolün amacı, implante edilmiş bir mini pompa kullanarak farelerde kronik ISO kaynaklı kalp yetmezliği modeli oluşturmaktır. Bu protokol, 100+ suşinda kalp yetmezliğine neden olmak için kullanılmıştır. Cerrahi pompa implantasyonu teknikleri ayrıntılı olarak açıklanmıştır ve farelerde bir kalp yetmezliği modeli oluşturmak isteyen herkes için ilgili olabilir. Buna ek olarak, her gerginlik için ekokardiyografik parametrelere dayalı haftalık kardiyak remodeling değişiklikleri ve model gelişimi için beklenen zaman sunulmaktadır. Özetle, yöntem basit ve tekrarlanabilir. İmplante edilen mini pompa ile 3-4 hafta boyunca uygulanan sürekli ISO, kardiyak remodeling yapmak için yeterlidir. Son olarak, ISO modeli oluşturma başarısı hipertrofi, ventrikül dilasyonu ve disfonksiyon gösteren seri ekokardiyografi ile in vivo olarak değerlendirilebilir.

Giriş

Azaltılmış ejeksiyon fraksiyonu ile kalp yetmezliği (HFrEF) kardiyovasküler homeostazı korumak için sempatik sinir sisteminin iyi tanınan telafi edici yanıt eşlik ediyor1. Kronik aktivasyon ile kalp ve dolaşım üzerine hemodinamik stres ve zararlı etkiler gözlendi. Bunlar kalp yetmezliği için çağdaş farmakoterapinin temel taşı haline gelmiştir ve nörohormonal sistemlerin kalp yetmezliği ve terapötik antagonizmasının ilerlemesinde önemli mekanizmalardır1.

Birkaç fare modelleri kalp yetmezliği temel araştırmalar için kullanılabilir. Genetik modeller moleküler tedavileri keşfetmek ve sinyal yollarını araştırmak için çekicidir. Ancak, bu modeller kalp yetmezliği ortak formları ile ilgili olmayabilir. Diğer yaygın modeller sol anterior inen (LAD) arter ligasyonu, transaortik daralma (TAC), ve izoproterenol (ISO), her biri farklı bir patolojiketiyoloji2 hedefleyen,3,4,5 ,6. LAD arter ligasyonu böylece iskemik kardiyomiyopati için özel bir model oluşturarak bir anterior duvar miyokard infarktüsü indükler. TAC kalp yetmezliği hipertansif bir model oluşturmak için akut basınç aşırı neden olur. Basınç gradyanı ölçülebilmesine rağmen, hipertrofi tabakalaşmasıiçin izin, hipertansiyon akut başlangıçlı doğrudan klinik alaka yoksun4. Hem LAD hem de TAC modelleri yürütmek için yüksek düzeyde cerrahi uzmanlık gerektirir. Kalp yetmezliği Akut ISO modeli strese bağlı kardiyomiyopati taklit, Ayrıca Takotsubo hastalığı olarak bilinen, akut miyokard infarktüsü taklit sol ventrikül katekolaminler ve aktivite belirgin bir artış ile karakterizedir7, 8 . Buna karşılık, kalp yetmezliği kronik ISO modelleri katekolaminler kronik yüksek düzeyde ile, ileri kalp yetmezliği belirtileri özellikleri mevcut1. Kronik ISO modelinin avantajları, ileri kalp yetmezliğini taklit eden kronik adrenerjik stimülasyon sağlaması ve oluşturmasının nispeten kolay olmasıdır. Araştırmacı, patolojilerini en iyi şekilde özetleyen bir model seçmeli.

Bu yöntemin genel amacı, kalp yetmezliği hastalarında bulunan kronik sempatik aktivasyonu taklit etmek için sürekli ISO bültenleri implante mini pompa kullanarak farelerde kalp yetmezliği indüklemek için1. Yöntem basit ve tekrarlanabilir. Fare suşları arasında belirgin bir varyasyon olmasına rağmen, 30 mg/kg/gün'de 3 ila 4 hafta arasında uygulanan ISO, çoğu farede kardiyak remodeling yapmak için yeterlidir. Özellikle, ISO hafta boyunca pro-hipertrofik kompansatör faz yol açar 1 duvar inceltme, ventrikül dilatasyonu ve hafta sistolik fonksiyon azalma takip 2 ve 32. ISO modelinin oluşturulmasında başarı hipertrofi, dilatasyon ve ventriküler disfonksiyonu gösteren seri ekokardiyografi ile in vivo olarak değerlendirilebilir, ayrıca miyokardiyal için hasat edilen kardiyak dokunun histolojik ve moleküler değerlendirilmesi yoluyla eksinyolen lipid birikimi, fibrozis, ER stres, apoptoz, ve gen ekspresyonu9,10,11,12.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokol Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles hayvan bakım kurallarına bağlıdır (ARC protokolü #2010-075). Peri-prosedür fare bakımı ve analjezi yönetimi kuruma özgü olabileceğiiçin okuyucuların kendi IACUC onaylı protokollerine uymaları tavsiye edilir.

1. Isoproterenol ozmotik pompa hazırlanması

NOT: Bu işlem, 100'den fazla inbred fare suşlarından 18+ g ağırlığındaki 9+ haftalık dişi farelerde ve suşların bir alt kümesindeki erkek farelerde başarıyla uygulanmıştır. Bu işlem için maksimum vücut ağırlığı sınırı yoktur. Tedavi yaşının kalp yetmezliği gelişimine karşı isoproterenol kaynaklı duyarlılığı etkileyip etkilemediği bilinmediği için her zaman yaşla uyumlu kontrolleri ekleyin.

  1. Her fare için vücut ağırlığını tartın ve kaydedin.
  2. Her fare için uygun miktarda ve izoproterenol konsantrasyonunu hesaplayın (Bkz. Tablo 1 ; Ek Dosya).
    NOT: Bu deneyde kullanılan ozmotik pompalar(Malzeme Tablosu)100 μL'lik bir rezervuar hacmine sahiptir ve 28 güne kadar sürekli akış hızlarında ilaç teslim etmek üzere tasarlanmıştır. Pompa yüklemesi sırasında dolum tüpündeki hacim kaybını hesaba katmak için pompa başına fazladan 20 μL'lik bir isoproterenol çözeltisi hazırlayın.
  3. Analitik bir denge kullanarak uygun miktarda isoproterenol(Tablo 1)tartın ve 120 μL steril %0,9 NaCl çözeltisi içinde eritin. Pipet şiddetle veya girdap için 1 dakika tamamen izoproterenol solubilize etmek.
    NOT: Ozmotik pompaları bir laboratuvar biyogüvenlik kabininde hazırlayın. Pompalar cerrahi eldivenlerle kullanılmalıdır. Steril teknik ozmotik pompaların hazırlanması sırasında ve cerrahi implantasyon işlemi sırasında tavsiye edilir.
  4. Tartmak ve akış moderatör ile birlikte boş ozmotik pompa kaydetmek ve daha sonra akış moderatör kaldırın.
  5. 1.0 mL şırınga içine 120 μL isoproterenol çözeltisi aspire ve ozmotik pompalar ile sağlanan 27-gauge künt uçlu dolum tüpü takın.
    NOT: Şırınga ve dolum tüpünün hava kabarcıklarından arındırılmış olduğundan emin olun.
  6. Pompayı dik konumda tutarken, dolum tüpünün ucu pompa haznesinin altına yakın olana kadar dolgu tüpünü üstteki açılan pompadan takın.
  7. Izoproterenol çözeltisi pompa nın açılmasına kadar dolana kadar şırınga pistonlarını yavaşça iterek ozmotik pompayı yükleyin.
  8. Dolgu tüpünü dikkatlice çıkarın ve fazla çözeltiyi silin.
  9. Pompayı kapatmak için akış moderatörüne geri takın ve fazla çözümü silin.
  10. Rezervuar hacminin %90'Dan fazlasının ozmotik pompanın yeniden tartılarak doldurulduğundan onaylayın.
    NOT: Kontrol pompaları, pompa haznesini steril %0,9 NaCl çözeltisi ile doldurarak aynı şekilde hazırlanır.

2. Cerrahi aletlerin hazırlanması

  1. Fiber optik O-ring ışık mikroskobu aydınlatıcı, 2 adet forceps, iğne tutucu, sıcak boncuk sterilizatörler, cam boncuklar ve makas(Malzeme Tablosu)dahil olmak üzere tüm cerrahi aletleri temizleyin.
  2. Otoklav cerrahi aletleri 121 ° C 30 dakika için ameliyat öncesi aletleri sterilize etmek.

3. Isoproterenol ozmotik pompa cerrahi implantasyon

  1. Fareyi %95 O2 ve %5 CO2'de %3 izofluran ile indüksiyon odasına yerleştirerek anesteziyi teşvik edin. Anesteziyi nosekon ile %2 isofluran ile koruyun.
  2. Analjezi için kürek kemikleri arasında boynun ensesine 5 mg/kg karprofen s.c. uygulayın.
  3. Kornea dehidratasyon önlemek için gözlere oftalmik merhem yerleştirin.
  4. Solunum hızı, ayak ucutu refleksve mukoza rengi izleyerek anestezi derinliğini kontrol edin.
  5. Fareyi ısıtılmış bir ped üzerinde supine pozisyonunda yerleştirin. Alt karın saç çıkarın ve betadin veya klorheksidin ile cilt dezenfekte.
    NOT: Ameliyat sonrası enfeksiyonu en aza indirmek için, cerrahi alanın olay kıllarından arındırılmış olduğundan emin olun.
  6. 1 cm uzunluğunda orta hat deri kesi kesmek için cerrahi makas bir çift kullanın. Altta yatan periton duvarlarından deriyi dikkatlice incelemek için bir çift künt uçlu makas kullanın.
    NOT: Pompanın büyüklüğünü karşılamak için intraperitoneal teslimat tercih edilir.
  7. Periton duvarlarını forceps ile altta yatan bağırsaktan uzaklaştırın ve ince cerrahi makas kullanarak periton duvarlarında 0,8 cm'lik bir delik kesin.
  8. Önce akış moderatörü ile periton boşluğuna ozmotik pompa yerleştirin.
  9. Periton duvarlarındaki tutunucuyu 5.0 emilebilir dikişleri kesintiye uğramış bir şekilde kullanarak kapatın. Cilt kesisini kesintiye uğramış bir şekilde kapatmak için 6.0 emilemez dikişler kullanın.
  10. Kurtarma sırasında fareyi sıcak ve kuru tutmak için özel bir kuluçka makinesine yerleştirin. Normal solunum ve hareket dönüşü için ilk iki saat içinde her 30 dakikada bir fareyi izleyerek anesteziden iyileşmeyi değerlendirin.
  11. Fare anesteziden tamamen iyileştikten sonra, rutin gövdeye geri döndürün. Deney sonuna kadar her gün 3 güne kadar ve daha sonra her 2-3 gün sonra komplikasyonlar için hayvan izlemeye devam edin.
    NOT: Hayvanlar ameliyat sonrası ağrı veya enfeksiyon, kilo kaybı belirtileri, hareket kabiliyeti eksikliği, anormal duruş, damat yetersizliği ve kesi bölgesinin aşırı yalama veya ısırma belirtileri için izlenmelidir.
  12. Carprofen 5mg/kg s.c. her 24 saat kadar 48 saat ve daha sonra gerektiği gibi uygulayın.
  13. Cerrahi alan enfeksiyonlarını önlemek için içme suyunda 5 gün boyunca 0.25 mg/mL amoksisilin uygulayın.
  14. 7 ila 10 gün sonra emilmeyen dikişleri çıkarın.

4. Anestezi altında ekokardiyografik değerlendirme

NOT: Birkaç hafta boyunca seri kardiyak remodelasyonu izlemek için ekokardiyografik değerlendirme tekrar tekrar yapılabilir. 3 hafta boyunca haftalık aralıklarla ekokardiyografik ölçümler yaptık.

  1. Isofluran%1.25 ila %1.5 oranında indüksiyon odasında anestezi edin. Uygun şekilde sakinleştirildikten sonra, farenin bir burun konisi aracılığıyla anestezi almaya devam etmesini sağlayan bantla ekokardiyografi platformuna sabitleyin.
  2. Aşırı sedasyonun negatif kronotropik ve inotropik etkilerini en aza indirmek için %1'lik bir bakım dozajına indirgen. Çalışma boyunca solunum ve kalp hızlarını dikkate alın ve gerektiğinde isofluran dozunu ayarlayın.
  3. Bir depilatif losyon ile göğüs saç çıkarın ve saç ücretsiz göğüs silin.
  4. Ultrason jelini göğüse yerleştirin ve ultrason sondasını kalbi görüntülemek için konumlandırın.
  5. B modunda, parasternal uzun eksenli görünümde sol ventrikül (LV) görüntü. Ultrason ışınının düzlemindeki aort kapağını ve LV apeksini hizalamak için ekokardiyografi platformını ayarlayın.
  6. Lv uzun eksenini ultrason ışınına ve LV maksimum çapını görüntünün merkezine yerleştirmek için ekokardiyografi platformını yatırın.
  7. Ultrason sondasını 90 derece çevirerek LV kısa eksenini görüntüleyin.
  8. M modunda LV duvar kalınlığı ve iç boyutları ölçün.
  9. Fareyi kafese geri yerleştirin. Normal solunum ve spontan vücut hareketlerinin geri dönüşü için monitör.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Daha önce yayınlanan çalışmamızda, 105 Hibrid Fare Çeşitliliği Paneli (HMDP) suşları 2,13arasında ozmotik pompa ile 21 gün boyunca 30 mg /kg/d iso dozu uygulandı. ISO tedavisinin 1, 2 ve3. Yazarlar arasında izoproterenol etkisini okudu önceki bir çalışmada benzer 23 fare suşları14, biz ekokardiyografik parametreler arasında çarpıcı inter-zorlanma varyasyon gözlendi. Ekokardiyografik parametrelere dayalı haftal...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu yöntemi kronik beta-adrenerjik stimülasyona2,13nedeniyle kardiyak sonuçları değerlendirmek için 100' den fazla inbred fare suşlarına uyguladık. Izoproterenol duyarlılık önemli farklılıklar fare suşları arasında var olduğu bilinmektedir ve gerektiğinde ilgi zorlanma özelleştirilebilir16. Bu fare suşları arasında beta-adrenerjik reseptör fonksiyonu varyasyon u olabilir17, otonom sinir sistemi aktivitesinde zorlanma...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Yazarlar nih K08 HL133491 finansman desteği için kabul.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Akış Moderatörlü Mikro-Ozmotik Pompa Sistemi YerindeAlzetModel 1004Doldurma borusu, akış moderatörü ve pompa gövdesi
(-) içerir - İzoproterenol hidroklorürSigma-Aldrich16504-1G(-) - İzoproterenol hidroklorür, -20 ° C'de depolanması gereken bir tozdur.
1 ml steril şırıngaVWRBD309602
30 W LED Fiber optik O-ring ışık mikroskobu aydınlatıcıAmScopeSKU: LED-30WR
5-0 KAPLAMALI VICRYL (poliglaktin 910) SütürEthiconJ303H5-0, emilebilir
İnce Makas - SharpFST14060-09
Cam boncuklarFST18000-46
Sıcak boncuk sterilizatörlerFST18000-50
İris forsepsWPI15915
Look Sharpoint 6-0, 18" Siyah Naylon Monofilament SütürLOOKAA-21766-0, emilmez
İğne tutucuWPI15926
Normal Salin, %0,9 NaClFisher89167-772

Kaynaklar

  1. Hartupee, J., Mann, D. L. Neurohormonal activation in heart failure with reduced ejection fraction. Nature Review Cardiology. 14 (1), 30-38 (2017).
  2. Wang, J. J., et al. Genetic Dissection of Cardiac Remodeling in an Isoproterenol-Induced Heart Failure Mouse Model. PLoS Genetics. 12 (7), 1006038(2016).
  3. Balakumar, P., Singh, A. P., Singh, M. Rodent models of heart failure. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 56 (1), 1-10 (2007).
  4. Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. Small animal models of heart failure: development of novel therapies, past and present. Circulation: Heart Failure. 2 (2), 138-144 (2009).
  5. Huang, W. Y., Aramburu, J., Douglas, P. S., Izumo, S. Transgenic expression of green fluorescence protein can cause dilated cardiomyopathy. Nature Medicine. 6 (5), 482-483 (2000).
  6. Breckenridge, R. Heart failure and mouse models. Disease Model and Mechanism. 3 (3-4), 138-143 (2010).
  7. Wittstein, I. S., et al. Neurohumoral features of myocardial stunning due to sudden emotional stress. New England Journal of Medicine. 352 (6), 539-548 (2005).
  8. Templin, C., et al. Clinical Features and Outcomes of Takotsubo (Stress) Cardiomyopathy. New England Journal of Medicine. 373 (10), 929-938 (2015).
  9. Shao, Y., et al. A mouse model reveals an important role for catecholamine-induced lipotoxicity in the pathogenesis of stress-induced cardiomyopathy. European Journal of Heart Failure. 15 (1), 9-22 (2013).
  10. Kudej, R. K., et al. Effects of chronic beta-adrenergic receptor stimulation in mice. Journal of Molecular Cell Cardiology. 29 (10), 2735-2746 (1997).
  11. Zhuo, X. Z., et al. Isoproterenol instigates cardiomyocyte apoptosis and heart failure via AMPK inactivation-mediated endoplasmic reticulum stress. Apoptosis. 18 (7), 800-810 (2013).
  12. El-Demerdash, E., Awad, A. S., Taha, R. M., El-Hady, A. M., Sayed-Ahmed, M. M. Probucol attenuates oxidative stress and energy decline in isoproterenol-induced heart failure in rat. Pharmacology Research. 51 (4), 311-318 (2005).
  13. Rau, C. D., et al. Mapping genetic contributions to cardiac pathology induced by Beta-adrenergic stimulation in mice. Circulation Cardiovascular Genetics. 8 (1), 40-49 (2015).
  14. Berthonneche, C., et al. Cardiovascular response to beta-adrenergic blockade or activation in 23 inbred mouse strains. PLoS One. 4 (8), 6610(2009).
  15. Chang, S. C., Ren, S., Rau, C. D., Wang, J. J. Isoproterenol-Induced Heart Failure Mouse Model Using Osmotic Pump Implantation. Methods Molecular Biology. 1816, 207-220 (2018).
  16. Shusterman, V., et al. Strain-specific patterns of autonomic nervous system activity and heart failure susceptibility in mice. American Journal of Physiology-Heart Circulation Physiology. 282 (6), 2076-2083 (2002).
  17. Faulx, M. D., et al. Strain-dependent beta-adrenergic receptor function influences myocardial responses to isoproterenol stimulation in mice. American Journal of Physiology-Heart Circulation Physiology. 289 (1), 30-36 (2005).
  18. Zhang, G. X., et al. Cardiac oxidative stress in acute and chronic isoproterenol-infused rats. Cardiovascular Research. 65 (1), 230-238 (2005).
  19. Boluyt, M. O., et al. Isoproterenol infusion induces alterations in expression of hypertrophy-associated genes in rat heart. American Journal of Physiology. 269 (2), Pt 2 638-647 (1995).
  20. Hohimer, A. R., Davis, L. E., Hatton, D. C. Repeated daily injections and osmotic pump infusion of isoproterenol cause similar increases in cardiac mass but have different effects on blood pressure. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 83 (2), 191-197 (2005).
  21. Cross, H. R., Murphy, E., Koch, W. J., Steenbergen, C. Male and female mice overexpressing the beta(2)-adrenergic receptor exhibit differences in ischemia/reperfusion injury: role of nitric oxide. Cardiovascular Research. 53 (2), 662-671 (2002).
  22. Klingman, G. I., McKay, G., Ward, A., Morse, L. Chronic isoproterenol treatment of mice: effects on catecholamines and rectal temperature. Journal of Pharmaceutical Sciences. 62 (5), 798-801 (1973).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Kalp Yetersizliği ModeliOzmotik Pompa İmplantasyonuFare Kardiyak RemodellemeSeri Ekokardiyografiİzoproterenol UygulamasıCerrahi Pompa İmplantasyonuKronik Beta-Adrenerjik StimülasyonKardiyak Hipertrofi DeğerlendirmesiVentriküler Dilatasyon Analizi
Farelerde Kalp Yetmezliğine Neden Olmak Için İzoproterenol Mini PompasıNın İmplantasyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.