Biz transplantasyon için basit ve verimli bir yöntem sağlamak 2 '-deoxyguanosine bir çıplak fare renal kapsül içine e 18.5 timus tedavi. Bu yöntem, hem timik epitelyal hücreler fonksiyon ve T hücrelerinin olgunlaşma çalışmada Yardımcısı olmalıdır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Çıplak farelerde 2 '-Deoxyguanosine tedavi Murine embriyonik Thymus renal subkapsüler nakli
Bu makalede
Özet
Özet
Timus, T hücrelerinin gelişiminde ve farklılaşması konusunda önemli bir rol oynayan büyük bir merkezi bağışıklık organıdır. Thymus transplantasyonu tymik epitelyal hücre fonksiyonunu ve T hücrelerinin olgunlaşma in vivo araştırılması için önemli bir yöntemdir. Burada laboratuvarımızda 2 '-deoksinozin (donör lenfositleri tüketmek için) nakli için kullanılan deneysel yöntemleri açıklayacağız bir korele çıplak fare renal kapsül içine embriyonik timus tedavi. Bu yöntem hem basit hem de etkilidir ve özel beceriler veya aygıtlar gerektirmez. Bu basit yöntem ile elde edilen sonuçlar, nakledilen timus 'un alıcının T hücrelerinin üretimini etkili bir şekilde destekleyebilildiğini göstermiştir. Ayrıca, protokole ilişkin birkaç önemli nokta daha da uzatın.
Giriş
Timus merkezi bağışıklık organı, timus timositleri içinde pozitif ve negatif seçim geçmesi, ve olgun T hücreleri olmak1,2. Anormal pozitif veya negatif seçim sonucu immünyetmezlik veya otoimmün patolojiler sırasıyla3,4. Bu nedenle, timus organ nakli, bağışçının timus 'ta T hücrelerinin seçimi sürecini incelemek için önemli bir yaklaşımdır. Bu yöntem özellikle mutasyona uğramış embriyonik ölümcül fenotip neden gen mutasyonlar tarafından aracılı thymik epitelyal fonksiyon analiz ederken önemlidir5.
Nakledilen timus bir alıcının T hücrelerinin olgunlaşma incelemek için, timus içinde donör lenfositlerin tükenmesi gereklidir. Bu amaçla, embryonik 14-, 15-veya 16-gün (E14, E15, E16) timus genellikle6,7seçilir. Daha olgun aşamalardan Thymus, 2 '-deoksiguanozin ile tedavi ederek donör lenfositlerinin de başarıyla tükenebilir. Ancak, lenfositlerin tüketen ve eski timus kültürünün kullanımı için ayrıntılı bir protokol daha önce8,9tarif edilmedi. Transplantasyon protokolleri birkaç çalışmada10,11, daha fazla değişiklik ve bu protokollerin iyileştirilmesi ile tanıtıldı iken gereklidir.
Protokolümüz iki bölüme ayrılır: (ı) geç gelişimsel aşama e 18.5 timus 'tan T lenfositlerinin 2 '-deoxyguanosine içeren medyada kültür tarafından tükenmesi. (ii) kültürlü timus 'un alıcılara nakli. Bu yordamda, renal kapsülün içine büyük doku (E 18.5 Thymus) teslim etmek için basit bir yol geliştirdik, böbrek yaralanması olasılığı azalır. Daha sonra aşama timus üzerinde odaklanırken, protokollerimiz de doğrudan veya çeşitli gelişimsel aşamalarında veya diğer benzer boyutlarda dokularda timus transplantasyonu için değişiklikler ile kullanılabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Sunulan protokol, Jinan Üniversitesi 'nin hayvan bakımıyla ilgili etik komitesinin yönergelerine bağlıdır.
Not: kullanılan malzemeler malzeme tablosunda listelenir.
1. embriyonik timus izolasyonu
- Deney öncesi tüm cerrahi aletler otoklav ve 70% etanol ile Bench/Hood sterilize.
- Karbondioksit kullanarak, anestezi ve hamile kadın fare ötenize (18,5 gün başarılı çiftleşme sonrası). Ardından karın bölgesini% 70 etanol ile silin.
Not: burada Insm1+/lacz kadın ve Insm1+/lacz erkeklerde montaj ilişkili. Her embriyo için embriyonun uterusun izolasyonunda intraplacental enjeksiyonu yapıldı ve deapitasyon uygulandı. - Makası kullanarak, karnında mesane başlayan ve rahim her boynuz kadar çalışan bir "V" şeklinde kesilmiş olun.
- Makas kullanarak, mesometrium ve serviks/vajina kesmek ve rahim toplamak. Buzun üzerinde soğuk fosfat-tamponlu tuz (PBS) içeren bir petri tabak rahim yerleştirin. Sonra, bir uterus boynuz diğerine anterior uterus duvarı keserek, zarflı decidua olan embriyolar açığa. İnce Cımbız kullanarak, zarflı decidua dokularına geri soyma ve embriyoları serbest bırakmak için göbek kordonu kesti. Tüm embriyoları, Thymus izolasyonuna kadar buzda yeni bir petri tabağı içine yerleştirin.
- % 70 alkol ile bir embriyo silin ve yeni bir petri çanak yerleştirin. Bu adımda, steril koşulların korunduğundan emin olun.
- Makas ile alt çene yakın kesme, embriyonun kafasını çıkarın ve bir kağıt havlu ile kan drenaj. Sonra, aynı Petri tabağı üzerinde embriyo düzeltmek pozisyon.
Not: Biz Insm1 ve lacz genotyping için her embriyo kuyruğu bir parça kesti. - Makas kullanarak, yan göğüs duvarı aksiller ön boyunca yatay olarak kesti ve sonra göğsü açmak için diyafram kesti. Timus şimdi trakea ve kalp bitişik önünde bulunan iki beyaz lob olarak görünür olmalıdır.
- Timus arkasında bükülmüş uçlu forseps yerleştirin ve sonra yavaşça timus çekin. İki eklem lob içerdiğini onaylamak için timus bütünlüğünü kontrol ettiğinizden emin olun.
- 1 PBS ile timus yıkayın ve bir stereomicroscope altında bağ dokularını ve kan damarlarını kırpın.
2. izole embriyonik timus kültürü
- 500 μL kültür orta (RPMI1640 + 15% fetal sığır serumu (FBS) + 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin) her bir 24-kuyu plakasının her bir kuyu ekleyin. İyi başına bir timus ile kuyuların içine temiz thymi aktarın. Şekil 1 , kültür medyasında yalıtılmış timus görüntüler.
- Her Thymus-iyi içeren için 2 '-deoxygranosine son konsantrasyon 1,25 mM ekleyin.
- Her iki günde bir kültür medyasını ve 2 '-deokgranosinin yenileniyor, sekiz gün boyunca izole timus kültürü.
3. böbrek kapsülünde subkapsülü alanı kurmak
- İğne ve kırpılmış infüzyon tüpü hazırlamak için (Şekil 2), makas kullanarak 45 ° açı tüp kısmında kafa derisi ven iğne kes.
- Çıplak fare tartmak ve sonra bir pentobarbital ile anestezize (1,5%) Enjeksiyon (75 μg/g vücut ağırlığı).
- Parmak tutam takipte hiçbir refleks görülmez, fareyi çalışma masasına sağ lateral pozisyonda yerleştirin.
- Bir 0,5% Povidon İyot Swab ile, cerrahi alanda vücudun dış iç iki kez cilt dezenfekte.
- Makas kullanarak, sol böbrek alanında (son kaburga ve iliak arması arasında) omurga paralel bir 5 – 9 mm Cilt kesi olun. Sonra, subkutan doku ve kas yoluyla kesme ve böbrek maruz karın boşluğu açın.
- Böbrek maruz, bir yandan bir çift cımbız kullanın kas ve omurga tarafı kesi kenarı kapalı yağ dokusu kaldırmak için. Öte yandan, yavaşça böbrek dışarı sıkmak (alternatif olarak, böbrek her iki elin parmaklarını kullanarak sıkılabilir).
- Böbrek kapsülünün cerrahi sırasında nemli olduğundan emin olmak için böbreğin yüzeyini tuzlu (0,9% NaCl) ile ıslatın.
- Böbrek kapsülü bir Nick oluşturun ve hafifçe adım 3,1 hazırlanan iğne ucu kullanarak sağ alt tarafında böbrek kapsülü çizilmeye. Nick büyüklüğü 1/2 – 2/3 böbrek genişlikleri olmalıdır; böbrek üzerinde çizik yok.
- Böbrek kapsülü Nick içine adım 3,1 hazırlanmış infüzyon tüpü kaydırın. Böbreğin uzun tarafında böbrek kapsülü içinde 3 – 4mm 'ye ulaşıncaya kadar böbrek kapsülünü yavaşça DISSOCIATE edilir. İnfüzyon tüpü geri çizin; böbrek subkapsüler alanı kurulmuştur.
4. embriyonik murine timus nakli
- Kültür medyasını tüketmek iki kez% 2,3 yılında kültürlü timus bitki yıkayın.
- 3,1 adımda hazırlanan kırpılmış infüzyon tüpünü, şırınga bağlayan arayüzünde bir şırıngaya bağlayın. Hazırlanmış timus 'un infüzyon tüpünü yavaşça aspirate.
- Yavaşça böbrek kapsülü içine kırpılmış infüzyon tüp yerleştirin ve üstün kutup ulaşmak. Timus böbrek kapsülü içine teslim; aynı anda hafifçe şırınga pistonu itmek sırasında yavaşça tüp geri çekin.
- Bir alkol lambası kullanarak, adım 3,1 hazırlanmış iğne biraz ısı. Tüm timus subkapsüler alanı içinde olduğundan emin olduktan sonra, Nick dağlamak için ısıtmalı iğne kullanın.
- Cauterization sonra, abdominal boşlukta böbrek geri. Periton ve kas sütür.
- Modifiye kesilmiş dikey yatak sütür kullanarak, cilt kesi kapatın (en az üç knot kravat ve herhangi bir aşırı iplik kesti).
- Bir Povidon İyot çubuğu kullanarak, kesi dezenfekte. Ağrıyı hafifletmek için, cerrahi sırasında ve sonra ameliyattan 3 gün sonra fluniksin (2 μg/g vücut ağırlığı) Subkutan Enjeksiyon yapıldı.
- Tamamen anestezi kurtarılana kadar, kızılötesi lamba altında fare sıcak tutun.
- Daha önce5,8,9açıklandığı gibi nakledilen timus diseksiyon ve fenotipik Analizi yürüten önce 8 hafta boyunca alıcının böbrek kapsülünde timus tutun.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada iki tam lob (Şekil 1) içeren izole e 18.5 timus gösterir. Ayrıca, biz infüzyon tüpü üzerinde bir eğim oluşturmak için kırpılmış olan kafa derisi ven iğne göstermek (Şekil 2). Sonra, aynı zamanda böbrek Kapsülü (Şekil 3A) ve timus (şekil3B) alıcı fareler içinde büyüme 8 hafta sonra nakledilen timus konumunun temsili bir görüntü göstermektedir. T hücrelerinin bir timus ile nakledilen çıplak fareler...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Embriyonik timus renal subkapsüler transplantasyonu, thymik epitelyal hücrelerin fonksiyonunun ve T hücrelerinin olgunlaşma sürecinin içinde vivo olarak incelenmesi için önemli bir yöntemdir. Embriyonik timus organ kültürü ve transplantasyon6,7üzerinde çeşitli deneysel çalışmalar olmasına rağmen, protokolümüz, murin embriyonik timus kültürü ve renal subkapsüler üzerinde basit bir alternatif prosedür sağlar. Eski timus dokusu için transplantasyon.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Herhangi bir ilgi çakışması ilan edildi.
Teşekkürler
Bu çalışma, Jinan Üniversitesi başlangıç paketi ile S.J. ve bilim ve teknoloji programı Guangzhou Çin (Grant No 201704020209 için S.J.) tarafından desteklenmektedir. Biz yazma redaksiyon ve düzenleme için Amy botta (Biyoloji bölümü, York Üniversitesi, Toronto, on M3J 1p3, Kanada) teşekkür ederiz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| % 0.5 Povidone iyot | Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd | 20171113 | |
| % 0.9 Sodyum Klorür Enjeksiyonu | Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd | 2C17112101 | |
| 1 mL Steril şırınga | Solarbio | YA1090 | |
| 2'-Deoksiguanozin | MEC | HY-17563 | DMSO'da 1M, 1:800 (son 1.25mM) |
| 24 Kuyulu Plaka | Corning Incorporated | Costar 3524 | |
| 4-0 İplikli cerrahi sütür iğneleri | NingBo Cheng-He Mikrocerrahi Aletler Fabrikası Çin | YY0166-2002 | |
| 60mm Hücre Kültürü Tabağı | Corning Incorporated | 430166 | |
| 70 ETOH | LIRCON | 20181221 | |
| APC anti-fare CD8a antikorları | Biolegend | 100711 | 1:100 |
| Bükülmüş uçlu ince forseps, JZ 10 cm | Şangay Tıbbi Cihazlar Group Co., Ltd. | JD1060 | Kullanmadan önce sterilize etmek için |
| Enjeksiyon için Sefmetazol Sodyum | Sichuan Hexin Pharmaceutical co, Ltd | 0.5ml %0.9 NaCl çözeltisinde 079 6mg, 7.5ul/g vücut ağırlığı | |
| Diseksiyon makası, JZ 10 cm | Şangay Tıbbi Cihazlar Group Co., Ltd. | JC2303 | kullanmadan önce sterilize etmek |
| için (FBS? | GIBCO | 10270-106 | |
| İnce forseps, JZ 10 cm | Şangay Tıbbi Cihazlar Group Co., Ltd. | JD1050 | Kullanmadan önce sterilize etmek için |
| Akış sitometrisi | BD | FACSCanto II | |
| Flunixin meglumine | MACLIN | F810147 | 1ml içinde 1 mg %0.9 NaCl çözeltisi, 2ul/g vücut ağırlığı |
| Forseps, Dumont#5 | World Precision Instruments | 14098 | Kullanmadan önce sterilize etmek için |
| Kızılötesi lamba | OTLAN | MT-810 | |
| İğne tutucu, JZ 14 cm | Şangay Tıbbi Cihazlar Group Co., Ltd. | J32010 | Kullanmadan önce sterilize etmek için |
| PE anti-fare CD4 | Biolegend | 100511 | 1:100 |
| Penisilin-Streptomisin karışımı | GIBCO | 15140122 | 1:100 |
| Pentobarbital sodyum tuzu | Sigma | P3761 | PBS'de %1.5 çözelti, 75ug/g vücut ağırlığı |
| RPMI1640 Orta | GIBCO | C14-11875-093 | |
| Kafa derisi damar iğnesi | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | XC001 | |
| Yaylı makas | VANNAS | S11014-12 | Stereomikroskop kullanmadan önce sterilize etmek için |
| OLYMPUS | SZ61 | ||
| Steril 15cm pamuklu çubuk | Guangzhou Haozheng | 20150014 | |
| Steril gazlı bez 5 cm x 7 cm-8P | Guangzhou Haozheng | 20172640868 | |
| Steril PBS (1x) | GENOM | GNM20012 | |
| Doku forsepsleri, JZ 12,5 cm | Şangay Tıbbi Cihazlar Group Co., Ltd. | J41010 | Kullanmadan önce sterilize etmek için |
Kaynaklar
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see). Nature Reviews Immunology. 14, 377-391 (2014).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nature Reviews Immunology. 5, 772-782 (2005).
- Spits, H., Touraine, J. L., Yssel, H., de Vries, J. E., Roncarolo, M. G. Presence of host-reactive and MHC-restricted T cells in a transplanted severe combined immunodeficient (SCID) patient suggest positive selection and absence of clonal deletion. Immunological Reviews. 116, 101-116 (1990).
- Nagamine, K., et al. Positional cloning of the APECED gene. Nature Genetics. 17, 393-398 (1997).
- Yanagihara, T., et al. Intronic regulation of Aire expression by Jmjd6 for self-tolerance induction in the thymus. Nature Communications. 6 (8820), (2015).
- Jenkinson, W., Jenkinson, E., Anderson, G. Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).
- T-Cell Development: Methods and Protocols. Bosselut, R., Vacchio, M. S. , Methods in Molecular Biology, vol. 1323 (2016).
- Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).
- Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163 (4), 975-987 (2015).
- Morillon, Y. M. 2nd, Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. (99), e52709(2015).
- Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504(2012).
- JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. Lab Animal Research. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).
- Gierl, M. S., Karoulias, N., Wende, H., Strehle, M., Birchmeier, C. The zinc-finger factor Insm1 (IA-1) is essential for the development of pancreatic beta cells and intestinal endocrine cells. Genes & Development. 20 (17), 2465-2478 (2006).
- Tao, W., et al. Haploinsufficiency of Insm1 Impairs Postnatal Baseline β-Cell Mass. Diabetes. 67 (12), 2615-2625 (2018).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
