Method Article

MRNA Electroporation kullanarak Avian embriyoları çoklu proteinlerin hızlı ve verimli Ifade

DOI:

10.3791/59664

⸱

June 7th, 2019

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Southern California, Los Angeles, 2Department of Radiology and Developmental Neuroscience Program, Saban Research Institute, Children's Hospital Los Angeles, 3Keck School of Medicine, Department of Radiology, University of Southern California, Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz bıldırcın embriyo modeli sistemde çoklu proteinlerin hızlı ve verimli ifade izin veren bir yöntem olarak haberci RNA (mRNA) elektroporasyonu rapor. Bu yöntem floresan hücreler için kullanılabilir ve Elektroporasyon kısa bir süre sonra zaman atlamalı mikroskopinin in vivo hareketlerini kaydetmek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MRNA Elektroporasyon 'ın floresan proteinlerin, yaşayan bıldırcın embriyoları içinde DNA electroporasyon 'dan daha hızlı ve geniş çapta hücreleri etiketlemesine izin verdiği bildiriyoruz. Yüksek transfeksiyon verimliliği, en az 4 farklı MRI 'nin ~ 87% verimlilik ile ortak transfazine izin verir. Electroporated mRNAs 'ların çoğu, ilk 2 h sonrası Elektroporasyon sırasında bozulur ve gelişmekte olan embriyonun içinde zaman duyarlı deneyler yapılacaktır. Son olarak, çeşitli hücresel hedeflenen floresan proteinleri kodlayan Mros ile electroporated canlı embriyolar dinamik görüntü nasıl açıklar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Electroporation plazma membranında geçici gözenekleri oluşturmak için bir elektrik darbe kullanan bir fiziksel transfeksiyon yöntemidir, nükselik asitler veya kimyasallar gibi maddelerin sitosol içine geçmek için izin. Electroporation yaygın bakteri, Maya, bitkiler ve memelilerin hücreleri1,2,3içine DNA teslim etmek için kullanılır. Gelişmekte olan kuş embriyo içindeki hedef hücrelere ve dokulara genetik yükleri tanıtmak için rutin olarak kullanılır ve hücre4,5,6, kalkınma veya etiket göç nüfusun genetik kontrolünü incelemek için 7' ye kadar. Ancak, DNA Elektroporasyon8ile birçok deneysel sınırlamalar da var. Örneğin, DNA Elektroporasyon genellikle hücre başına ifade vektörler son derece değişken sayılar tanıttı ve daha sonra mrnas ve onlar kodlamak proteinler. Bu değişkenlik, hem görüntü analizi hem de veri yorumlama9,10karmaşıklaşır önemli hücre hücresi heterojenite yol açabilir. Ayrıca, DNA Elektroporasyon proteinleri sadece ~ 3 h sonrası Elektroporasyon ifade etmeye başlar ve 12 h kadar hücre numarası ve floresan yoğunluğu maksimum verimlilik ulaşmaz, muhtemelen çekirdek içine aktarmak için gerekli zaman nedeniyle ve komple hem transkripsiyon ve tercüme vivo11.

Bunun aksine, mRNA transfeksiyon, Xenopus laevis oositler de dahil olmak üzere çeşitli model sistemlerinde etkili bir şekilde kullanılan12,13, mRNA lipofectamine transfeksiyon 14 tarafından insan kök hücrelerini yeniden programlama ve yetişkin fareler15' te realcitrant nöral kök hücrelerini electroporating. MRNA Elektroporasyon 'ın, farklı floresan proteinlerini (FPs) kodlayan in vitro sentezlenmiş mrnas 'ları kullanarak erken kuş embriyonik gelişiminde hücreleri etkili bir şekilde etiketlemeye yönelik yeteneğini test ettik. Çalışmalarımız için, Xenopus ve zebra balığı embriyoları proteinleri ifade etmek için yaygın olarak kullanılan pCS2 + vektörü, çok amaçlı bir ifade vektörü kullandık. PCS2 + ' da bulunan SP6 ve T7 RNA polimeraz promotörleri, bir in vitro transkripsiyon/çeviri sisteminde kullanıldığında klonlanmış genden mRNA ve proteinin sentezine izin verir.

Burada, mRNA elektroporasyonu, gastrulating bıldırcın embriyoları floresan proteinleri (FPs) hızlı ve verimli ifade sağlar göstermektedir. Bu çalışmalarda kullanılan ifade vektörler birçok tasarlanmış ve üretti. Örneğin, lifeact-EGFP geni16 ' nın pCS2 + vector17 ' sini CMV organizatör ve SP6 promotör 'den ifade etmek için subklonladık. Eklenen gen, SP6 organizatör ve upstream bazılarında SV40 Poly (A) kuyruk18aşağı yatıyor. Embriyoların mRNA ve DNA ile birlikte electroporated, FPs içinde vitro transkripsiyonu mRNAs kodlanmış ilk 20 dk Electroporation içinde tespit edildi, DNA ifade vektörler FPs sadece sonra tespit edildi 3 h. nükleer, Golgi ve çok sayıda mRNAs kodlaması membran proteinleri aynı anda bir embriyo içine electroporated olabilir, bireysel hücrelerde çoklu proteinlerin hızlı ve verimli ifade sonucu. Son olarak, photobleaching (FRAP) tahlil sonra bir in vivo floresans kurtarma kullanarak, biz 2 saat içinde electroporated mRNAs çürümesi çoğunluğu gösterir. Böylece, sınırlı yeni protein çevirisi ile birlikte hızlı ilk protein üretimi mRNA Elektroporasyon ifade geçici kontrol gerektiğinde değerli bir teknik yapar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan prosedürleri Los Angeles Çocuk Hastanesi ve Güney Kaliforniya Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komiteleri onaylı yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Generation pCS2 tabanlı Ifade vektörler

  1. Klonlamak için pCS2. Lifeact-eGFP, vektör omurgasını hazırlamak 2 μg pCS2. CycB1-GFP (farklı bir ekleme içeren bir yapı) ile BamHI (10 U) ve Bsrgı (10 U) uygun sindirim tamponu (bkz. malzeme tablosu) Toplam reaksiyonda 1x seyreltilmiş 37 °C ' de 1 h için 50 μL hacmi (klonlama prosedürün şematik için bkz. Şekil 1 ).
    1. Dephosphorylate ücretsiz 3 ' OH karides alkalin fosfataz (1 U) ekleyerek kısıtlama enzim reaksiyondan vektör omurgası biter. 37 °C ' de 30 dak.
    2. Tüm karışımı çalıştırın 1% agaroz jel/1x Tris asetat EDTA (Tae) tampon içinde 90 V ~ 50 dk ve sonra jel leke bir 0,5 μg/ml etidium bromür çözeltisi içinde 1x Tae tampon 15 dakika yumuşak sallanan ile. Ayrıca, DNA boyutlarını belirlemeye yardımcı olmak için ücretsiz bir şeritte moleküler ağırlık işaretçileri yüklemek için emin olun.
    3. DNAS 'ın kesilmemesi için DNA güvenli UV transaydınlatıcıyı kullanarak, bir vektör omurgasını (4kb beklenen bant boyutu) agaroz jeli hızlı bir şekilde kesip, üreticinin talimatlarını kullanarak bir jel arıtma kiti kullanarak jel parçasından DNA parçasını izole edin.
  2. Adım 1,1 ile aynı anda, 1 saat 37 °C ' de 50 μL toplam reaksiyon hacminde 1x 'ye seyreltilmiş uygun sindirim tamponunda BglII (10 U) ve Bsrgı (10 U) ile 2 μg pEGFP-N1-Lifeact sindirerek Ekle hazırlayın. Daha önce adım 1.1.2-1.1.3 ' de açıklandığı gibi 800 BP bandı izole etmek için% 1 agaroz jel tüm karışımı çalıştırın.
  3. Hem vektör ve ekleme saflaştırılmış ve spektrofotometre üzerinde nicelik sonra, birleştirmek 50 ng vektör ve 38 ng Ekle (1:3 molar oranı eklemek için Vector) T4 DNA ligaz tampon eklendikten önce T4 DNA ligaz bağlı ligasyon reaksiyonu katalizleme. Ayrıca, hiçbir DNA denetimi, yalnızca bir vektör denetimi ve bir INSERT yalnızca denetimi ayarlayın. Oda sıcaklığında tüm reaksiyonları 30 dakika boyunca kulyın.
    1. Ligasyon karışımı (ler) 1 μL 'yi yetkili E. coli DH10 dönüştürün. Ayrıca, su sadece negatif kontrol ve pUC19 pozitif kontrol 20 pg dönüştürün. Bakteriler, 50 μg/mL ampisilin içeren Luria broth (LB) agar plakalarına yayılır ve bir gecede 37 °C ' de inküyeler.
    2. Ertesi sabah, her plakanın kolonileri saymak.
      Not: İdeal olarak, negatif kontrol plakaları üzerinde koloniler, vektör + Ekle ligasyon plakaları üzerinde > 100 koloniler ve sadece vektör plaka üzerinde daha az koloniler olmalıdır.
    3. En az 8 bakteri kolonileri seçin agar plaka vektör + Ekle ligasyon karışımı ile dönüştürülmüş ve steril kürdan veya pipet uçları kullanarak onları aşılamak 2 ml sıvı lb suyu içeren 50 μg/ml ampisilin.
    4. Ticari Plasmid Sage kitleri kullanarak klonlar her birinden DNA ayıklamak.
    5. Bir tanılama kısıtlama Özeti kullanarak her Klondan DNA 500 ng çalıştırın Noti kullanarak (10 u) ve bamhi (10 u) uygun sindirim tampon içinde 1x için seyreltilmiş 1 h 37 °c ve sindirilmiş DNA çalıştırın 1% agaroz jel 1x Tae tampon. PCS2. Lifeact-eGFP pozitif klonlar için beklenen bant boyutları 3,9 KB ve 978 BP vardır.
    6. 1 pg-100 ng DNA 'nın pozitif Klondan yetkin E. coli DH10 içine dönüştürülmesi ve 3-4 Sage reaksiyonları, in vitro transkripsiyon reaksiyonu için yeterli miktarda DNA elde etmek için önceki adımlarla ayrıntılı olarak hazırlar (10 μg asgari).

2. mRNA 'nın In vitro transkripsiyon ile hazırlanması

  1. PCS2. LifeAct-eGFP ' d e 10 μg, NotI (10 U) ile eklemin 3 ' ucunda, 37 °C ' de 50 μL 'nin toplam reaksiyon hacminde 1x 'ye seyreltilmiş uygun bir sindirim tamponu üzerine doğru.
    Not: RNase kontaminasyonunu önlemek ve mRNA bozulmasını azaltmak için mRNA örneklerini kullanırken eldiven giyin.
  2. DNA 'Yı fenol karışımı kullanarak arındırın: kloroform: isoamill alkol (25:24:1, v/v).
    1. 200 μL 'ye eşit sindirim reaksiyonu toplam hacmini yapmak için 150 μL RNase-Free su ekleyin. Daha sonra, 200 μL fenol ekleyin: kloroform: isoamill alkol ve Vortex karışımı 20 s.
    2. Maksimum hızda bir mikrofuge Santrifüjü (18.400 x g) için 2 dk. dikkatle doğrandırılmış DNA içeren üst sulu faz çıkarın. Ek kirleri kaldırmak için bu adımı tekrarlayın ve alt ve üst sıvı fazlar arasında olabilir beyaz çökelme bozmaya dikkatli olun.
  3. 1/10 hacmi 3M sodyum asetat (RNase-Free) ve 2,5 hacimleri% 100 etanol ekleyerek doğrulanmış DNA 'Yı çökeltir. Karışımı-20 °c ' de > 30 dakika boyunca bırakın, sonra maksimum hızda santrifüpleme ile DNA 'yı Pelet (18.400 x g).
    1. 70% etanol ile DNA Pelet yıkayın, sonra > 5 dakika için Pelet hava kuru.
    2. 5 μL RNase-Free su içinde DNA Pelet çözülür. Spektrofotometrenin DNA 'sını ölçün.
      Not: Beklenen DNA konsantrasyonu 1.7-2.0 arasında A260/A280 oranında ~ 0.5-1 μg/μL 'dir.
  4. İn vitro transkripsiyon için (ıVT) pCS2. LifeAct-eGFP DNA 'nın 1 μg 'ını kullanın. 10 μL Cap analog (son konsantrasyon 0,8 mM) ve NTPs (ATP, CTP ve TTP için son konsantrasyon 1 mM; 0,2 mM GTP için), 2 μL 10X reaksiyon tamponu (son konsantrasyon 1x), 2 μL SP6 RNA polimeraz ve 20 μL 'ye kadar RNase içermeyen su.
    1. Transkript boyutuna bağlı olarak, ıVT karışımı yaklaşık 2 saat veya daha uzun bir süre için inküye.
      Not: 2 h inkübasyon iyi bir 3 KB transkript için çalışır, ancak gece kuluçta 5 KB 'den büyük transkriptler için daha iyi çalışır.
    2. Transkripsiyon reaksiyondan serbest nükleotidler kaldırmak için, mRNA 'yı çökeltmek için 30 μL LiCl RNA yağış çözeltisi (7,5 M Lityum klorür, 50 mM EDTA) ekleyin. Karışım kısaca Vortex ve 30 dakika boyunca-20 °C ' de saklayın. Max Speed (18.400 x g) bir mikrofuge 15 dakika Için aşağı mRNA spin ve% 70 etanol (RNase-Free) ile durulayın.
  5. Sentezlenmiş mRNA 'yı 15 μL RNase-Free suyla çözün. Sentezlenmiş mRNA 'yı 5 μL/tüpte (Toplam 3 tüp) dağıtın ve uzun süreli depolama için-80 °C ' ye yerleştirin. MRNA 'yı Spektrofotometre ile quantitate.
    Not: Beklenen verim 15-20 μg mRNA (~ 1 μg/μL) ' dir. 1 μL (1 μg/μL), mRNA 'nın 1 μg/μL 'den 500 ng/μL 'ye seyreltilmiş olduğunu ve her embriyonun ~ 200 nL ile enjekte edildiğini varsayarak, ~ 10 embriyoya sahip bir deney için yeterlidir. Her tüp, bu nedenle, ~ 5 denemeler için yeterli mRNA içerir.
  6. RNase dekontaminasyon çözeltisi (örn., RNase away) ile tüm jel ekipmanlarını temizledikten sonra 1% agaroz jel üzerinde mRNA ~ 300 ng çalıştırın ve mRNA 'nın bir bant olarak göründüğünden emin olun (ikincil yapılar formunda birden fazla bant mevcut olabilir) ve hiçbir smear RNA düşüşünü gösteren jel şeritte ppears.

3. mRNA Elektroporasyon karışımı hazırlanması

  1. İstenilen konsantrasyonda çözülme ve seyreltici mRNA (250-500 ng/μL RNase-ücretsiz su bu çalışmanın tüm mRNAs için iyi çalışır). Renkli boya 1/10 hacmi ekleyin (bkz: malzeme tablosu, RNAse-Free, 0,1% son konsantrasyon) mRNA enjeksiyon site görselleştirmek ve düzgün elektrotlar yerleştirmek için.
    Not:     Eğer DNA ve RNA bir Co-Elektroporasyon gerçekleştirmek için birleştirildiğinde, DNA 'Nın mRNA ve DNA karışımı öncesinde Phenol-Chloroform ekstraksiyon ve etanol yağış kullanarak RNases kontamine ücretsiz olduğundan emin olun.
    1. Bir sahte (RNA eklenmez) Elektroporasyon çözeltisi kullanarak negatif bir kontrol hazırlamanıza dikkat ediniz. Mümkünse, önceden doğrulanmış mRNA (önceki deneylerde FP başarıyla üretmek için gösterilen mRNA) kullanarak pozitif bir denetim hazırlayın.
      Not: Negatif denetim, verilerin normalleşmesi için arka plan floresan seviyeleri oluşturmak tüm görüntüleme denemeleri için gereklidir. Pozitif kontrol özellikle Elektroporasyon ayarlarının çalıştığını onaylamak için yardımcı olarak yeni transkripsiyonu mRNA ile çalışırken önemlidir.
  2. Elektroporasyon ile devam etmeye hazır olana kadar bozulmayı önlemek için mRNA Elektroporasyon çözümünü bir buz Bulamaç üzerine saklayın.

4. electroporate mRNAs içine yaşam bıldırcın embriyo

  1. Her gün taze yapılmış döllenmiş bıldırcın yumurtaları toplayın ve 1 haftadan fazla olmayan bir nemlendirilmiş buzdolabında 13 °C ' de saklayın. 38 °c ' de arzu edilen embriyonik Gelişimsel aşamalara kadar bıldırcın yumurtalarını19,20,21.
    Not: Bu çalışmada hem statik hem de dinamik görüntüleme için HH3 ila HH5 kullanılmıştır. HH3 embriyolar için, yumurta oda sıcaklığında bırakarak 2 saat önce hasat için embriyolar genellikle daha fazla fiziksel manipülasyonlar daha dayanıklıdır olarak yalıtım süreci çok daha kolay yapar soğutulur.
  2. Embriyoları ak kültür sistemi22' ye göre yalıtın ve hazırlayın. En az bir negatif kontrol (electroporated değil) olarak hizmet vermek dahil olmak üzere en az 5 embriyo, koşul başına toplayın.
    1. Yavaşça kırmak ve 10 cm Petri çanak içine yumurta dökün. Bir transfer pipetiyle kalın albümin çoğunu çıkarın ve embriyonun kağıt halka sıkıca yapışdığından emin olmak için bir doku silme ile sarısı yüzeyini hafifçe silerek embriyonun etrafında kalan kalın albumini çıkarın.
    2. Ön filtre kağıdı ( malzeme tablosunabakınız) embriyo üzerine Lay ve düzgün embriyonun çevresindeki kesmek için makas kullanın.
    3. Bir Pasteur pipet ile embriyonun PBS ile ilgili olarak, embriyo yapışmasını herhangi bir sarısı boşaltmak için nazik akışları kullanarak.
      Not: Bu embriyo sarısı daha sopa eğilimindedir ve genellikle sonraki yıkama adımları sırasında vitellus membrandan ayrılacaktır çünkü genç (< HH3) embriyolar ile çalışırken bu adım önemlidir.
    4. Yavaşça, daha fazla temizlik için PBS ile dolu bir petri tabağı içine ve sarısı kapalı bir eğik açı embriyo/kağıt yüzük çekin. Bir kez sarısı çoğu kaldırıldı, bir 35 mm Petri tabak agar/Albumen bir yarı katı karışımı ile kaplı üzerinde embriyo ventral tarafı yukarı yerleştirin.
  3. Cam mikropipet çektirme aleti kullanılarak altı ila 8 10 cm uzunluğunda cam mikrokapillarleri (O.D. = 1,2 mm) hazırlayın.
  4. Embriyo ventral tarafı PBS ile dolu Elektroporasyon odasına yerleştirin. Cam mikrokapiller kullanarak, mRNA veya DNA/mRNA Elektroporasyon karışımı 200 nl bir bolus istenilen bölgeyi kaplayan epiblast ve vitellus membran arasındaki boşluğa enjekte.
    Not: Pellucida için tüm ön alan ve opaca için bazı alan bu yazıda gösterilen deneylerin çoğunda electroporated oldu.
  5. Pozitif ve negatif elektrotları (Platin düz kare elektrot; 5 mm yan uzunluğu) sırasıyla embriyonun üst ve alt kısmına ve aşağıdaki darbe sırasını kullanarak electroporate yerleştirin: 5 V 'lik beş kare elektrik darbeleri, 100 ms aralıkla 50 MS süresi bir In vivo electroporator kullanarak. Elektrotlar arasındaki mesafenin ~ 5 mm olduğundan emin olun.
    Not: Elektroporasyon parametreleri optimize kırılgan embriyonik hücreleri öldürebilirim koşulları önlemek için çok önemlidir. Çeşitli Elektroporasyon cihazları için gerilim, darbe uzunluğu, nabız aralıkları ve DNA ve mRNA için darbe sayısı parametreleri dikkate alınmalıdır.
  6. Electroporated embriyoları 38 °C ' de istenilen gelişim aşamasına kadar kulyatın.
    Not: Floresan diseksiyon stereoskopi (bkz. malzeme tablosu) transferyon dışı embriyolar ile transfeksiyon yaparak ekrana yardımcı olur.
  7. Embriyoların statik olarak görüntülenmiş olması halinde, PBS 'de% 4 civarında formaldehite ile Oda sıcaklığında 1 saat veya 4 °c ' de bir gecede düzeltin.
    1. Filtre kağıdının çevresindeki makas ile pürüzsüz bir şekilde kesme ve keskin forseps ile dorsal yüzeyinde parlak membran soyma tarafından vitellus membrandan embriyolar çıkarın nazikçe.
    2. PBS/Triton 'da sabit embriyoları yıkayın (% 0,1) 2x 5 dakika ve in situ hibridizasyon veya immün boyama ile devam isterseniz.
    3. Son olarak, PBS/Triton 'da 0,5 μg/μL DAPI 'de embriyo leke (0,1%) Oda sıcaklığında en az 30 dakika. Embriyoları PBS/Triton 2x 'de 5 dakika yıkayın ve Skala-U2 çözeltisi23 gecede embriyo temizleyin.
  8. Elektroporasyon verimliliğini analiz etmek için (bkz. Şekil 2), görüntüdeki tüm hücrelerden nükleer anahatlar elde etmek Için ımagej 'deki ikili ve parçacık analiz aracını ve DAPI kanalını kullanın.
    1. İkili aracı ımagej üzerinde kullanmak için tek bir z-Slice hücre çoğunluğu içeren DAPı kanalda kullanın ve işlem ≫ ikili ≫ Ikili yap'ı tıklatın. Yakındaki hücreleri ayırmak için işlem ≫ ikili ≫ Watershedseçeneğini tıklatın. Analiz ≫ parçacıkları analizedin, boyut 100-500 (μm2) olarak ayarlanmış olarak hücre anahatlarını edinin.
    2. Hücrelerin çoğunluğunun DAPı kanalında özetlendiğinden emin olun ve YG Yöneticisi açılır penceresinde daha fazla ≫ kaydet 'i tıklatarak hücre anahatlarını kaydedin.
    3. Daha önce kaydedilmiş dosyayı mRNA veya DNA kanalındaki tek bir z diliminde açarak mRNA ve DNA kanalı için floresan yoğunluğu değerleri elde etmek için bu anahatları kullanın ve ardından YG yöneticisinde ölçü 'i tıklatın.
    4. Son olarak, bu yoğunluk değerlerini filtreleyin, transfitleştirilmiş olarak < 6000 floresan yoğunluğa sahip hücreleri sayma ve > 6000 floresan yoğunluğu olan hücreler.

5. Electroporated mRNAs tarafından kodlanmış görüntü FPs

  1. Floresan diseksiyon stereoskopinin altında bulunan tüm elektroporasyonlu embriyolar baktıktan sonra dinamik görüntüleme deneyleri için en sağlıklı ve iyi electroporated embriyo seçin.
    1. Bu embriyonun deney sırasında ölmesi durumunda, seçilmiş embriyonun görüntülenmesi sırasında diğer elektroporasyonlu embriyoları ve elektroporated olmayan embriyo (negatif kontrol) ile ayrı bir kuluçlan içinde yer almaya devam edin.
  2. Dinamik görüntüleme için, daha önce24,25,26 tersine çevrilmiş bir konfokka mikroskop ile açıklandığı gibi tüm Mount EX OVO kuş embriyo kültürünü kullanın.
    Not:     mikroskop, görüntüleme sırasında 36 °c ' de sıcaklık tutan bir aşama kuluçta ( malzeme tablosunabakın) ile donatılmıştır. 36 °C ' de embriyoların, yüksek sıcaklıklarda daha uzun süre hayatta kaldıkları mikroskop kurma sırasında gözlemlenmiştir, çünkü lazer embriyo üzerinde yerel ısıtmaya neden olabilir. Okuyucular kendi mikroskop seti için optimum aşama kuluçta sıcaklığını belirlemelisiniz.
    1. Dinamik olarak görüntü için ve embriyogenesis görselleştirmek için, PBS ile electroporated embriyo kısaca bir PBS temiz forseps kullanarak etrafında embriyo taşıyarak Elektroporasyon işlemi sırasında embriyonun dorsal tarafında oluşturabilir herhangi bir kabarcıklar kaldırmak için temizleyin Çözüm.
    2. Temiz embriyo Albumen ince bir tabaka içeren bir görüntüleme çanak üzerine doğrudan yerleştirin-agar (~ 150 μL) embriyo22dorsal yüzeyinde herhangi bir kabarcıklar oluşturmak için emin olun.
    3. Uzun süreli görüntüleme için hayatta kalma sağlamak için, görüntüleme çanak iç kenarları küçük bir nemli haddelenmiş kağıt parçası ekleyin ve görüntüleme ve inkübasyon sırasında buharlaşma en aza indirmek için parafin filmi kullanarak çanak mühür.
    4. Bu tabağı hızlı bir şekilde bir Konfokal mikroskop ön ısıtılmış aşamaya taşıyın ve enjekte ve electroporated bölgeyi tanımlayan aydınlık alan kanal (PMT lazer% 20) kullanarak embriyo renkli boya bulun.
  3. İstenilen amaca (10 veya 20X), dikroik Mirror (Gfp nm için 488 Nm, RFP için 561), emisyon Spectra (Gfp için 499-562 Nm, RFP için 570-695 Nm) için görüntüleme yazılımını ayarlayın ve uygun bir lazer (Gfp için 488 Nm, RFP için 561 Nm) açın.
    Not:     electroporated mRNA 20 dakika içinde görülen proteinlere çevrildi (bkz. Şekil 3). Bu yazıda görüntüleri çoğu için kullanılan görüntüleme meta: 20X amacı ile ters bir konfokit mikroskop (bkz. malzeme tablosu); piksel bekleme süresi, ~ 1,5 μs; 4 satırlı taramalar anlamına gelir.
    1. Görüntüleme yazılımında canlı tıklayın ve lazer gücünü her mikroskop lazer gücüne bağlı olarak floresan yoğunluğu için uygun bir ayara ayarlayın. Embriyo% 1 lazer gücü kullanarak görüntüleme ile başlayın, 800 kazanç ve doymuş pikseller görülene kadar lazer gücünü% 1 artışlarla yavaşça artırın.
    2. Artık doymamış pikseller görülene kadar lazer gücünü biraz azaltarak izleyin.
      Not: Bir embriyonun görüntüleme oturumunun başlangıcı için seçilen lazer gücü daha önceki zaman noktaları için iyi olabilir ama hücrelerin floresan zaman içinde çok daha parlak veya dimmer olur daha sonra zaman noktalarında ideal değil. Bunu gidermek için, electroporated hücreler genellikle Elektroporasyon sonra ilk 6 saat içinde daha parlak olsun bu yana biraz daha düşük güç ayarlarında embriyo görüntü (bkz Şekil 3A-E sinyal artışı miktarlama için). Sonraki görüntüler doygunsa, orijinal görüntüleme ayarları ile görüntüye devam edin, ancak daha zayıf görüntüleme ayarları (küçük iğne deliği veya zayıf lazer gücü) ile hemen sonra ek bir görüntü alın.
    3. Farklı zaman noktalarında bireysel hücre göç izlemek için her 3-5 min embriyo görüntü. Bu çalışma için, görüntüleri z-yığınları (~ 50 μm kalınlığında) tüm electroporated alanı, artı z-yığını altına doğru bazı ekstra oda, embriyo görüntüleme oturumu boyunca agaroz yatak içine lavabolar.
    4. İlk filmin ilk birkaç zaman noktalarını kontrol ederek hücrelerin ne kadar hızlı hareket ettiğini inceleyin. Hücreler hızlı bir hızda hareket ederse (yani görüntülenmiş bölgenin alanından birkaç zaman noktası içinde çıkacaklar anlamına gelir), görüntülenmiş alanın yakınlaştırmasını (1x à 0.8 x) veya farklı bir bölgeyi görüntülemesini deneyin.
      Not: Bölgede embriyonik bölgeler pellucida çok daha hızlı alan opaca daha hareket. Ayrıca, Genç embriyo (HH3, HH5) genellikle eski embriyolar (> HH7) ile karşılaştırıldığında daha hızlı hareket geçiren hücreler içerir.
    5. Embriyonun electroporated bölgesini görüntülemenin ardından, aynı embriyonun bir un-electroporated bölgesi olan otofloresans düzeylerini belirlemek için (düşük lazer gücü <% 10 ' luk bir embriyo görüntü için kullanılır) minimal olmalıdır.

6. floresans kurtarma Photobleaching sonra (FRAP) assay mRNA bütünlüğü için

Not: Photobleaching sonra bir in vivo floresan kurtarma (frap) tahlil ne kadar uzun transfekte mRNA FPs içine çevrilebilir belirlemek için kullanılabilir. Aşağıdaki protokol, H2B yarı ömrünü algılamak için bir FRAP deneyi özetliyor. Bir electroporated embriyo içinde Citrine mRNA.

  1. 20X 0,8 NA objektif ve tamamen açık pinhole kullanarak ters Konfokal mikroskop üzerinde FRAP denemeleri gerçekleştirin.
    1. Stereomikoscope üzerinde H2B-Citrine Elektroporasyon teyit ve ters Konfokal mikroskop üzerinde önceden ısıtmalı aşamada embriyo ayarı sonra (bkz: adım 5.2.4), çeşitli zaman H2B-Citrine hücresel floresans en photobleach puan (45 dk, 2 h, ve 5 h-Electroporation) ile 405 nm lazer kullanarak 70% lazer gücü, 100 yineleme, tarama hızı 4, kalan floresan sadece% 5 bırakır.
      Not: Bu işlem birkaç dakika sürebilir.
    2. Photobleaching sonrası 36 °C ' de embriyoları sahnede kulymaya devam edin.
  2. Photobleached hücrelerin tamamen Post-Treatment ölmedi olduğunu gösteren fotoksüeli bölge içindeki hücreleri aktif olarak bölünmesine dikkat ettiğinizden emin olun.
  3. Konfokal mikroskobu kullanarak düzenli zaman aralıklarında (3 veya 5 dakika) 30 dakikaya kadar (elektroporated bölgenin z-yığınları) çamaşır suyu görüntüleri alın.
    Not: Varsa, photobleached bölgede hücre hayatta kalma sağlamak için pozitif bir kontrol olarak transgenik H2B-XFP hattı kullanın. Electroporated mRNA tarafından kodlanmış FP için floresan kurtarma oranı azalmalıdır, ancak transgene ile kodlanmış FP için tüm film boyunca tutarlı kalması gerekir.
  4. Görüntüleme koşullarının, embriyo hayatta kalmadığından emin olmak için, aynı zamanda fotobleerli olmayan electroporated embriyoları, görüntüleme için bir kontrol olarak hizmet edebilir.
  5. MRNA çürümesi sonrası Elektroporasyon için photobleaching sonuçlarını quantitate için, ımagej kullanarak her hücrenin Merkezi (7,5 μm Daire) Floresan yoğunluğunu ölçerek zaman içinde hücre floresans (3 veya 5 dk) izleyin. Bu mitoz geçirmiyor ve tamamen photobleached olmuştur photobleached bölgede tüm hücreler için bunu ölçün.
    Not: Mitotik çekirdekler kromatin yoğuşması nedeniyle interfaz çekirdekleri daha güçlü floresans var bu yana kantifikasyon mitotik hücreler atlayarak düşünün.
  6. Çeşitli zaman noktalarında (45 dk, 2 h ve 5 h) zaman içinde floresans yoğunluğunu zaman sonrası çamaşır suyu üzerine çizin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mRNA Elektroporasyon DNA Elektroporasyon daha etkilidir

Biz pCS2 + kullandık. H2B-Citrine in vitro transkripsiyonu mRNA hazırlamak için. DNA elektroporasyonu genellikle 1-2 μg/μL 'de gerçekleştirildiği için, mRNA elektroporasyonu için (H2B-Citrine için 0.25-0.5 μg/μL civarında olmak üzere hesaplanan) mRNA equimolar konsantrasyonu kullandık. İlk olarak pCS2 + ' nın Elektroporasyon verimliliğini test ettik. H2B-Ci...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde, biz nasıl tam mikroenjeksiyon ve elektrostatik bıldırcın embriyoları hücrelerine mRNA electroporate hakkında adım adımı talimatlar sağladı. İn vitro sentezlenmiş mRNA elektroporasyonu, gastrulating bıldırcın embriyoları içinde floresan proteinlerin (FPs) hızlı ve verimli bir şekilde ifade edilmesini sağlar (Şekil 2 ve 3). Electroporated mRNAs 'dan çevrilmiş H2B-Citrine proteininden floresans, ~ 20 dakika içinde Konfokal mikroskobik tarafından tespit edilebilir...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir ilgi anlaşmazlıkları bildirmek zorunda.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz bu işe yardımcı bilgiler için David Huss teşekkür ederiz. Bu çalışma tarafından kısmen desteklenmektedir Rose Hills Vakfı yaz Araştırma Bursu (2016-2018) ve USC Provost 's Altgrad araştırma bursu MT, saban Araştırma Enstitüsü Intramural eğitim doktora öncesi Ödülü MD, ve Üniversitesi Güney Kaliforniya lisans araştırma Associates programı Ödülü ı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BamHI-HFNew England BiolabsR3136L
BglIINew England BiolabsR0144S
BsrG1-HFNew England BiolabsR3575S
NotI-HFNew England BiolabsR3189L
SalI-HFNew England BiolabsR3138L
Fenol: Kloroform: İzoamil AlkolThermo Fisher
SP6 mMessage Makinesi in vitro transkripsiyon kitiThermo FisherAM1340
Hızlı YeşilFCF Sigma AldrichF7252
Triton X-100Sigma Aldrich934434- (1,1,3,3-Tetrametilbutil) fenil-polietilen glikol, t< / em>-Oktilfenoksipolietoksietanol, Polietilen glikol tert< / em>-oktilfenil eter
DAPISigma AldrichD95422- (4-Amidinofenil) -6-indolekarbamidin dihidroklorür, 4 asal ;, 6-Diamidino-2-fenilindol dihidroklorür, DAPI dihidroklorür
Whatman No.1 filtre kağıdıSigma AldrichWHA1001125
gliserolSigma AldrichG9012
ÜreSigma Aldrich51457
pmTurkuaz2-GolgiAddgene36205pmTurkuaz2-Golgi, Dorus Gadella'nın bir hediyesiydi (Addgene plazmidi # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)
pmEGFP-N1-LifeActNat. Yöntemler 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722
pCS2.Lifeact-mGFPAddgeneBu kağıt
pCS.H2B-sitrinAddgene53752pCS-H2B-sitrin Sean Megason'dan bir hediyeydi (Addgene plazmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)
pCS.memb-mCherryAddgene#53750pCS-memb-mCherry, Sean Megason'dan bir hediyeydi (Addgene plazmidi # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)
Zeiss LSM-780 ters mikroskopCarl Zeiss Microscopy GmbHLSM-780, hayati görüntüleme çalışmaları için gereken hassasiyeti sunan konfokal ve çok fotonlu bir mikroskoptur. Motorlu bir sahne, bir otomatik odaklama cihazı ve tam sahne üstü karartma inkübatörü ile donatılmış olan 780, üst düzey canlı hücre / embriyo görüntüleme için mükemmel bir mikroskoptur. Yüksek hassasiyetli 32 kanallı Quasar dedektörü, spektral görüntüleme, doğrusal karıştırma ve yüksek renk sayımı (>4) görüntü elde etmeye olanak tanır. Uyarma, 6 çizgi tek foton lazer (405, 458, 488, 514, 564 ve 633 nm), Chameleon (Koherent) 2 foton lazer (690nm ila 1000nm aralığında) ile yapılabilir ve ZEN 2011 SP7 (Black) sistem yazılımı ile çalıştırılabilir.
CUY-21 EDIT in vivo elektroporatörBex Co., Ltd.
Platin düz kare elektrot, yan uzunluk 5 mmBex Co., Ltd.
Olympus MVX10 FL Stereo MikroskopOlympus LifeScience
XM10 Tek renkli kameraOlympus LifeScience
HCR için Fosfat Tamponlu Salin (PBS) (10 kez;, pH 7.4) 1 L 10 kez stok çözeltisi hazırlamak için 80 g NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g Na2HPO4 (susuz; Sigma-Aldrich S3264) ve 2.7 g KH2< / sub<>PO sub>4 < / sub> (susuz; Sigma-Aldrich P9791). HCl ile pH'ı 7.4'e ayarlayın ve son hacmi ultra saf H2O ile 1 L'ye getirin. HCR için PBS'de CaCl2 ve MgCl2 kullanmaktan kaçının. HCR için PBS'nin RNaz içermeyen bir çözelti olarak hazırlanması önemlidir (ör., dietilpirokarbonat [DEPC] tedavisi yoluyla).
1.37 M NaCl
27 mM KCl
80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4
PBS/TritonmL Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) ve 100 mL 10× ekleyin; PBS ila 890 mL ultra saf damıtılmış H2O. Çözeltiyi 0.2 & mu ile filtreleyin; m filtreleyin ve 4 ° C'de saklayın Kullanana kadar C.
1 kez; fosfat tamponlu salin (PBS) (DEPC ile işlenmiş; pH 7.4)
% 0.1 Triton X-100
15593031LF701P5E1

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
  2. Potter, H. Electroporation in biology: methods, applications, and instrumentation. Analytical Biochemistry. 174 (2), 361-373 (1988).
  3. Shillito, R. D., Saul, M. W., Paszkowski, J., Muller, M., Potrykus, I. High-Efficiency Direct Gene-Transfer to Plants. Bio-Technology. 3 (12), 1099-1103 (1985).
  4. Cui, C., Rongish, B., Little, C., Lansford, R. Ex Ovo Electroporation of DNA Vectors into Pre-gastrulation Avian Embryos. CSH Protocol. 2007 (24), 4894(2007).
  5. Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protocol. 3 (3), 419-426 (2008).
  6. Voiculescu, O., Stern, C. D. Manipulating Gene Expression in the Chick Embryo. Methods Molecular Biology. , 105-114 (2017).
  7. Chuai, M., et al. Cell movement during chick primitive streak formation. Developmental Bioliogy. 296 (1), 137-149 (2006).
  8. Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Developmental Dynamics. 229 (3), 433-439 (2004).
  9. Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 41 (3), 335-344 (1999).
  10. Nakamura, H., Watanabe, Y., Funahashi, J. Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 42 (3), 199-201 (2000).
  11. Teddy, J. M., Lansford, R., Kulesa, P. M. Four-color, 4-D time-lapse confocal imaging of chick embryos. Biotechniques. 39 (5), 703-710 (2005).
  12. Green, M. R., Maniatis, T., Melton, D. A. Human beta-globin pre-mRNA synthesized in vitro is accurately spliced in Xenopus oocyte nuclei. Cell. 32 (3), 681-694 (1983).
  13. Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology. 770, 55-75 (2011).
  14. Luni, C., et al. High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics. Nature Methods. 13 (5), 446-452 (2016).
  15. Bugeon, S., et al. Direct and efficient transfection of mouse neural stem cells and mature neurons by in vivo mRNA electroporation. Development. 144 (21), 3968-3977 (2017).
  16. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  17. Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes and Development. 8 (12), 1434-1447 (1994).
  18. Krieg, P. A., Melton, D. A. Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs. Nucleic Acids Research. 12 (18), 7057-7070 (1984).
  19. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  20. Eyal-Giladi, H., Kochav, S. From cleavage to primitive streak formation: a complementary normal table and a new look at the first stage of the development of the chick. I. General morphology. Developmental Biology. 49, 321-337 (1976).
  21. Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. Developmental stages of the Japanese quail. Journal of Anatomy. 216 (1), 3-15 (2010).
  22. Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220 (3), 284-289 (2001).
  23. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neurosciences. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  24. New, D. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3, 320-331 (1955).
  25. Drake, C. J., Davis, L. A., Hungerford, J. E., Little, C. D. Perturbation of beta 1 integrin-mediated adhesions results in altered somite cell shape and behavior. Developmental Biology. 149 (2), 327-338 (1992).
  26. Sato, Y., et al. Dynamic analysis of vascular morphogenesis using transgenic quail embryos. PLoS ONE. 5 (9), e12674(2010).
  27. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).
  28. Uetrecht, A. C., Bear, J. E. Golgi polarity does not correlate with speed or persistence of freely migrating fibroblasts. European Journal of Cell Biology. 88 (12), 711-717 (2009).
  29. Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. , 5th edition, Garland Science. (2007).
  30. Arndt-Jovin, D. J., Jovin, T. M. Fluorescence labeling and microscopy of DNA. Methods Cell Biol. 30, 417-448 (1989).
  31. Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annu Rev Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
  32. Heikal, A. A., Hess, S. T., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Webb, W. W. Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine). Proceedings of the National Academy of Science U S A. 97 (22), 11996-12001 (2000).
  33. Iizuka, R., Yamagishi-Shirasaki, M., Funatsu, T. Kinetic study of de novo chromophore maturation of fluorescent proteins. Analytical Biochemistry. 414 (2), 173-178 (2011).
  34. Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mechanism of Development. 121 (9), 1137-1143 (2004).
  35. Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Developmental Biology. 233 (1), 13-21 (2001).
  36. Meyer, S., Temme, C., Wahle, E. Messenger RNA turnover in eukaryotes: pathways and enzymes. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 39 (4), 197-216 (2004).
  37. Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review in Genetics. 50, 235-266 (2016).
  38. Harland, R., Misher, L. Stability of RNA in developing Xenopus embryos and identification of a destabilizing sequence in TFIIIA messenger RNA. Development. 102 (4), 837-852 (1988).
  39. Lippincott-Schwartz, J. The long road: peering into live cells. Nature Cell Biology. 12 (10), 918(2010).
  40. Sato, Y., Lansford, R. Transgenesis and imaging in birds, and available transgenic reporter lines. Development Growth & Differentiation. 55 (4), 406-421 (2013).
  41. Goldman, R. D., Spector, D. L. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

mRNA ElectroporationAvian EmbryosFluorescent ProteinsProtein ExpressionConfocal MicroscopyPhotobleaching AssayTransfection EfficiencyEmbryo ImagingQuail EmbryosDynamic Imaging

Related Articles