Oral Nötrofillerin Değerlendirilmesinde Mürin Periodontitin Sağlam Ligatür Kaynaklı Modeli

Periodontal hastalık (PH) önemli konak morbidite ve ekonomik yük ile ilişkili bir osteolitik durumdur, hangi dişeti iltihabı ve etkilenen dentition için hem yumuşak doku eki ve osseous destek kaybı ile kendini gösterir^1,2,3,4. Bu süreç, oral mikrobiyota ve konak doğuştan gelen bağışıklık sistemi arasındaki etkileşimler tarafından yönetilir. Ayrıca diyabet, kardiyovasküler hastalık ve kanser^5,6,7,8dahil olmak üzere diğer sistemik inflamatuar hastalıkların alevlenme ile ilişkilidir. Tarihsel olarak, BU PD patogenezpors gibibelirli bakterilerin büyük miktarlarda bağımlı olduğu varsayımında 9^. Ancak, son kanıtlar PH mikrobiyal bileşeni diş biyofilm aracılık olduğunu göstermektedir. Biyofilm sağlıklı simbiyotik ve yıkıcı disbiyotik devletlerde var olabilir çok sayıda mikroorganizmaların organize, karmaşık bir topluluktur^10,11. Oral biyofilm normalde patojenik bakterilerin foci kurulmasını engelleyerek ev sahibine direnç sağlar ve konak bağışıklık yanıtı 12 düzenlenmesi ile ideal dişeti doku yapısı ve fonksiyonu teşvik^12,13. Oral kavite içinde kommensal organizmalar ve konak bağışıklık sistemi arasındaki dengesel ilişkinin perturbations doku homeostaz değişikliklere yol açabilir, dysbacteriosis ve PD damgasını klinik ve radyografik görünümlerin gelişimi ile sonuçlanan^{5,10,12,13,14}.

İlginçtir, oral disbacteriosis kurulması, PD başlatılması için gerekli iken, tüm bireylerde PH sürücü için yeterli değildir, simbiyotik ve disbiyotik durumlar arasında mikrobiyota geçiş bozmak için konak bağışıklık yanıtı yeteneğine doğru kaçan¹⁵. Bu pd doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önde gelen karakterlerinden biri, yani polimorfonükleer granülosit (PMN) veya nötrofil, yerel ve sistemik bakış açılarından^16,17etkiler anlamına belirli bir spot yerleştirir .

İnsanlarda, PMN'ler sağlıklı periodontal bağ dokularında ~2 x 10⁶ hücre/h oranında dolaşımdan alınırlar, burada hakim lökosit popülasyonudur. Burada, daha sonra dişeti kreviküler sıvı bir bileşeni olarak ağız boşluğuna dişeti sulkus atılır. PH varlığında, nötrofili dolaşım ve ağız boşluğu içinde tezahür, Bu efektör hücreleri periodontium yukarıda belirtilen imha yol açan bir hiperinflamatuar fenotip sahip^{nerede 17,18,19,20,21,22}. Bu nedenle, PD ve diğer sistemik inflamatuar durumlarda PMN'lerin rolünü anlamak son derece önemlidir.

Kronik hastalıkların PH'ye karşılıklı olarak bağlı olduğu yaygın olarak kabul edilse de, altta yatan mekanizmalar henüz açıklığa kavuşturulamamıştır ve bu morbid ve potansiyel olarak ölümcül sistemik durumların yönetiminde zorluklara katkıda bulunmaktadır. Birden fazla deneysel hayvan modelleri, her biri benzersiz avantajları ve dezavantajları ile, PD^23,24patofizyolojisi çalışmak için kullanılmıştır. Özellikle murine modellerine odaklanan pd çalışmasının kolaylaştırıldığı çeşitli protokoller vardır; ancak, çeşitli teknik ve fizyolojik eksiklikleri sahip^25,26,27,28,^29,30,31.

İlk olarak, oral gavage fare modeli dişeti iltihabı ve kemik kaybı oluşturmak için insan periodontal patojenlerin çok sayıda oral aşılama gerektirir. Ayrıca, genellikle antibiyotik tedavisi bir süre önce murine commensal oral flora yıkmak için²⁵. Bu model genellikle güvenli bir şekilde oral gavaj gerçekleştirmek için özel eğitim gerektirir, daha karmaşık insan oral mikrobiyom periodontal patojenlerin sadece küçük bir kısmını kullanır, ve alveoler kemik kaybı kurmak için birkaç ay gerektirir.

Buna karşılık, kimyasal olarak indüklenen mürin modelleri trinitrobenzen sülfonik asit oral teslim kullanmak (TNBS) veya dekstran sülfat sodyum (DSS), ajanlar genellikle periodontal kemik kaybı neden birkaç aylık bir süre içinde kolit murine modelleri kurulmasında kullanılan²⁶. Dorsumun mürin ifilsorve dokularının yanı sıra kalvaryum içeren intraoral ve ekstraoral apse bazlı modeller mevcuttur. Eski apse modelinde, bakteri çeşitli enjeksiyonlar uygulanır, birden fazla dişeti apse ve alveoler kemik kaybı eksikliği oluşturarak, PH çalışmada kullanımını sınırlayan. İkinci apse modelleri önemli ölçüde daha bakteriyel virülans çalışmaya apt, inflamasyon, ve ağız boşluğu dışında sitelerde kemik rezorpsiyonu, periodontium ve oral mikrobiyom değerlendirme ortadan kaldırır^{27,28,29,30,31}.

Periodontitin ligatür kaynaklı modeli kullanılarak, örgülü ipek dikiş genellikle ikinci azı dişleri etrafında çevresel olarak yüklenmiştir. Alternatif olarak, dikiş malzemesinin tek bir doğrusal segmenti birinci ve ikinci azı dişleri arasına eklenebilir^32,33. Ligatür yerleşiminin amacı bakteri birikimini kolaylaştırmak ve dişeti sülfür içinde disbiyoz oluşturmak, periodontal doku iltihabı ve periodontium oluşturan dokuların imha ile sonuçlanan. En önemlisi, Bu model daha yaygın olarak kullanılan oral gavage modeli³⁴ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha alveoler kemik kaybı üretme yeteneğine sahiptir. Oral gavaj modelinin kullanımını daha da zorlaştıran şey, farelerin çeşitli suşlarının (c57BL/6) alveoler kemik kaybına karşı doğal direncidir. Bu aynı zamanda sorunludur, çünkü bu tür en sık kullanılan rürin bazlı hayvan^{araştırmalarında 35'}tir.

Marchesan ve ark. ve Abe ve Hajishengallis tarafından açıklanan mevcut prosedürler ligature^33,36yerleştirerek teknik hareket basitleştirmek için icat edilebildi. Ne yazık ki, eski protokol özel 3D baskılı ekipman gerektirir ve erken ligatür kaybı potansiyeline sahip, bu nedenle artan hayvan kullanımı ve ameliyathanede harcanan ek zaman ile ilgili maliyetler. Ayrıca, her iki protokol de bir çalışma için mevcut hastalıklı periodontium sadece küçük bölgeler oluşturur.

Bu teknikle yatan avantajlar, periodontium'u yöneten oral disbiyoz ve immünolojinin eşzamanlı çalışmasında, farklı genetik geçmişe sahip düşük maliyetli hayvanların kullanımı ve basit barınma ve hayvancılık uygulamalarında temellenmiştir. Bu nedenle, hedefler hastalıklı doku hacimlerini en üst düzeye çıkarmak ve hayvan araştırmalarında azaltma ilkelerini uygulama girişimlerinde, hayvan tüketimini mümkün olduğunca düşük bir seviyeye düşürmek olmalıdır. Bu, tüm hayvanların deneysel analizlere dahil edilme lerini sağlamayı gerektirir^37. Ancak, periodontal hastalığın hangi hayvan modeli kullanılırsa kullanılsın, insan PH patofizyolojisinin her unsurunu kapsayan tek bir model olmadığı unutulmamalıdır.

Bu yeni protokol, çoğu laboratuvarda bulunan enstrümantasyon ve malzemeler kullanılarak birden fazla maksiller azı dişinin etrafına bir bağ yerleştirilmelerini sağlar. Kolayca ve güvenle erken avulse olası olmayan bir ligatür yüklemek için yeterli miktarda zaman sağlar. Son olarak, PMN'ler PD'deki periodontium'un yok oluşunun koordinasyonu yla, oral nötrofilleri insanlara benzer bir şekilde kurtarmak için yeni bir metodoloji de sunulmuştur.

Tüm murine çalışmaları ilgili etik düzenlemelere uygun ve Toronto Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi ve Araştırma Etik Kurulu (Protokol 2001930) tarafından onaylanmıştır.

1. Ligatür kurulumu

NOT: Bu standart bir ameliyathanede yapIlebilen steril olmayan bir cerrahi işlemdir. Mikropsuz hayvanların kullanımı (burada kapsanmayan) bir biyogüvenlik kabini içinde işleme, steril aletlerin kullanımı ve periodontal patojenler ile oral kavitenin aşılanması periodontitin klinik belirtilerine neden olmayı zorunlu kılır.

1. Onaylı kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesi (IACUC) yönergelerine göre 0,5" 26 G steril hipodermik iğne ve 1 mL şırınga kullanarak barınma tesisine alışılması gereken 8-12 haftalık erkek C57BL/6 farelere intraperitoneal anestezi uygulayın.
   NOT: Ketamin (100 mg/kg) ve ksilazin (10 mg/kg) anestezinin birleşimi, işlem süresince uygun anestezi düzeyini oluşturur.
2. İşlem sırasında işlem sırasında pedal refleksinin kaybedilmesiyle kanıtlanmış olarak anestezik derinliği değerlendirin.
3. Fareyi ısıtmalı bir cerrahi platforma yerleştirin (Şekil 1A). Elastik bantlar kullanarak açık pozisyonda maksilla ve mandibula stabilize ve daha yatay bir yönde maksilla korumaya yardımcı olmak için bir pamuk rulo ile boyun prop(Şekil 1B). İşlem sırasında ısı kaybını azaltmak için hayvanın gövdesini ve kuyruğunu kapatın.
4. Cerrahi mikroskobu, diş inin görselleştirilmesi için ağız boşluğunun üzerine istenilen büyütme ve aydınlatmaya (doğrudan mikroskoba monte edilmemişse) yerleştirin. İstenilen büyütme operatöre bağlı iken, oral kavitenin optimal görselleştirmesi 16x'te elde edilir.
5. Kıymık forceps kullanarak dişeti sulkus içinde birinci (M1) ve ikinci (M2) maksiller molar etrafında steril 5-0 örgülü ipek dikiş yükleyin.
   NOT: Daha küçük bir ölçerin örgülü ipek dikişleri daha hızlı kurulumkolaylaştırmak ve iyatrojenik yumuşak doku hasarı olasılığını azaltmak için bu amaçla kullanılabilir.
   1. Dikişin distal kuyruğunu dentinin aldata tarafına yerleştirin ve proksimal segmenti M2 ile M3 teması arasına yerleştirin(Şekil 2A).
   2. Sütürü M2'nin bukkal yüzeyinin etrafına sarın ve M1 ve M2'nin teması arasına yerleştirin. Sütürün her iki ucunun da dişeti sulkuna dikiş sürmek ve tüm bolluğu gidermek için sıkıca çekildiğine emin olun(Şekil 2B).
   3. Proksimal sütür segmentini M1'in etrafına sarın, kontur yüksekliğinin altında, ve M1 ve M2'nin teması arasına takın. Sütürle sütürlü somurtkanlığa doğru sürüklüyor ve tüm bolluğu çıkarmak için sütürün proksimal kuyruğunu sıkıca çekin(Şekil 2C).
      NOT: Dikişin M1 ve M2 veya M2 veya M3 arasına takılması durumunda, kontak standart bir diş kaşifi kullanılarak hafifçe açılabilir.
   4. Dikişin uçlarını bir cerrah düğümüile bağlayın ve kuyrukları mümkün olduğunca kısa kestirin. M1 ve M2 arasındaki dişeti embrasure düğüm maksiller dentition(Şekil 2D)palatal tarafında yerleştirin.
      NOT: 1.4.1-1.4.4 adımları gerekirse kontralateral tarafta tekrarlanabilir.
   5. Her hayvan denek arasında sıcak cam boncuk sterilizatör cerrahi aletleri sterilize.
      DİkKAT: Forceps uçları son derece keskin ve kolayca oral travma ve önemli kanamaya neden olabilir. Ağız boşluğundaki kanı çıkarmak ve aktif olarak kanayan yaralara basınç uygulamak için gazlı bezin küçük parçalarını hazırlayın.
6. Ligatür kurulumdan sonra fareyi cerrahi cihazdan çıkarın, ısı lambasının altına temiz bir kafese yerleştirin ve tamamen iyileşene kadar monitörü kullanın.
7. Her fareyi uygun çevresel zenginleştirme ile ayrı ayrı barındırın ve 7-11 gün boyunca filtrelenmiş suya ve nem kontrollü bir ortamda (12 saat ışık/12-h karanlık döngü) standart chow püresi neresine reklam libitum erişimine izin verin.
   NOT: Püre chow böylece beslenme ile ilişkili ağrı yıkıntma için gerekli kuvvetleri azaltır ve yüklü ligature erken kaybını önlemede yardımcı olur.

2. Örnek toplama

1. Onaylı IACUC yönergelerine göre fareleri ötenazi.
   NOT: Bu protokol için tercih edilen yöntem, CO₂ haznesini ve ardından servikal çıkığı kullanan tek tek ötanazi yöntemidir. Bu ek dokuların hasat gerektiren deneylere bağlı olarak değiştirilebilir.
2. Bir pipet kullanarak, 10 s kalsiyum ve magnezyum olmadan 100 μL sterilize 4 °C 1x fosfat-tamponlu salin (PBS) ile ağız boşluğunu hemen durulayın.
3. Adımı 2,2 2x'i tekrarlayın ve her bir durulamayı tek bir 15 mL konik polipropilen steril test tüpüne yerleştirin.
4. İçeriği 40 m'lik naylon örgü filtreden geçirerek 50 mL konik polipropilen steril test tüpüne aktarın.
5. Bu içeriği yeni bir 15 mL konik polipropilen steril test tüpüne aktarın.
   NOT: Numunenin daha küçük bir tüpe son transferi, önümüzdeki adımlarda hücresel peletin daha iyi görüntülenmesine olanak tanır.
   1. İstenirse, 15 mL'lik konik polipropilen steril test tüpünde molar ligature(ler) çıkarın ve sterilize edilmiş 1x PBS (4 °C, kalsiyum ve magnezyumsuz) 300 μL'lik bir alana yerleştirin. Hafifçe çalkalayın ve tüp dikiş çıkarın. Bu örnek, bu noktadan itibaren oral durulama örneği ile aynı şekilde tedavi edilir.
6. Örnek fiksasyonu kolaylaştırmak için %16 paraformaldehit (PFA) 33,3 μL ekleyin.
7. Girdap örnekleri hemen ve 15 dakika buz üzerinde kuluçka.
8. Tüpü 15 mL'ye 1x PBS ile doldurun ve PFA'yı seyreltin, ardından 1000 x g ve 4 °C'de 5 dakika santrifüj edin.
9. 4 °C'de floresan aktive hücre sıralama (FACS) tamponunun 1 mL'sinde süpernatantı aspire edin ve peleti yeniden askıya alın. Hücreleri hemositometre veya otomatik hücre sayacında say.
10. Numuneyi 1000 RCF ve 4 °C'de 5 dk santrifüj edin.
11. 0.5-1.0 x 10⁶ hücre/50 μL FACS tamponu için uygun bir FACS tampon hacminde postayı aspire edin ve peleti yeniden askıya alın.

3. Akış sitometrik analizi için antikor boyama

NOT: Kullanmadan önce gerekli tüm FACS tüplerini etiketleyip soğutun.

1. Numunenin 50 μL'sine 1 000 fare serumu ve 2 μL anti-fare IgG antikor ekleyin, hemen girdap ve 20 dakika boyunca buz üzerinde blok yapın.
2. Her numuneye uygun antikorları ekleyin, hemen girdap ve karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka.
   NOT: Antikor ların seçimi ve hacimleri, bu özel tekniğe uygun önceki optimizasyon pilot deneylerine bağlıdır.
3. 1 mL FACS tamponu ile numuneleri yıkayın, kısa bir süre girdap ve 1000 x g ve 4 °C'de 5 dakika santrifüj. Bu adımı 2x tekrarlayın.
4. 250 μL FACS tamponundaki numuneleri yeniden askıya alın, parafin filmli tüpleri kapatın, alüminyum folyoya sarın ve analiz ene kadar 4 °C'de tutun.
   NOT: Uzun depolama sürelerindeki floresan sinyal kaybı nedeniyle protokolün tamamlanmasından sonraki saatler içinde numuneleri analiz etmek idealdir. Ancak, numuneler kesinlikle gerekirse 2-3 gün sonra analiz edilebilir.

Oral durulama örneklerinden(Şekil 3A)ve iltihaplı (Şekil 3B) bağ kaynaklı periodontite sekonder olan murine oral kaviteden temsili akış sitometri verileri sağlanır. PmN'lerin yüklü bir ligatürden geri kazanımı da gösterilmiştir (Şekil 3C). Akış sitometre kanal gerilimleri manuel olarak kalibre edildi ve tek lekeli kompanzasyon boncukları ile telafi yapıldı. PMN'ler Ly6G+veF4/80-ve ana hatlarıyla38strateji kullanılarak tanımlanmıştır. Her oral durulama ve ligatür örneğinden en az 500 kapılı PMN olayı elde edildi. PMN canlılığı trypan mavi boyama ile yaklaşık 7 olarak saptıldı. Alveoler kemik ibik (ABC) sağlıklı için setoenamel kavşak (CEJ) ve ligated fareler için ölçülen alveoler kemik düzeylerinin temsili görüntüler(Şekil 4A) (Şekil 4B). Bu ölçümler arasındaki bağıl farklar(Şekil 4C)sağlanır.

Şekil 1: Azı yağı ligasyonu için hayvan konumlandırması. (A) Oral kaviteye erişim maksiller ve mandibular kesici diş titremesi üzerine hafif çekiş yerleştirerek mandibul depresif bir pozisyonda tutarak elde edilir. (B) Gazlı bez başın hareketini önlemek ve nispeten yatay bir pozisyonda maksilla yerleştirmek için kafatası altına yerleştirilir. Vücut ve kuyruk mikroskop altında cerrahi aşamada hareket önce ısı kaybını önlemek için kaplıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Ligatür kurulumunun sıralı fotoğrafı. (A) Sütürün distal kuyruğu dentinin palatal tarafına yerleştirilir ve proksimal segment M2 ve M3 teması arasına yerleştirilir. (B) Dikiş daha sonra M2'nin bukkal yüzeyine sarılır ve M1 ve M2'nin teması arasına yerleştirilir. (C) Proksimal dikiş segmenti, kontur yüksekliğinin altında M1'e sarılır ve M1 ve M2 kontağı arasına yerleştirilir. (D) Dikişin uçları bir cerrahın düğümü ile bağlanır ve düğüme mümkün olduğunca yakın kırpılır. Düğüm maksiller dentinin palatal tarafında M1 ve M2 arasındaki dişeti embrasure yerleştirilir. Tüm fotoğraflar molar dentition engelsiz bir görünüm ile prosedür adımları kayıt için parçalanmış maksilla elde edilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Temsili FACS arsalar ve sözlü nötrofil varlığını gösteren gating stratejisi. Nötrofiller aşağıdaki örneklerden kurtarıldı ve akış sitometrisi ile değerlendirildi: (A) naif bir fareden oral durulama, (B) oral durulama, ve (C) ligatür kaynaklı periodontit (bilateral) ile bir fareden elde edilen bağlar. Temsili gating strateji scatterplots gösterilir. Singlets (SSC-H x SSC-W ve FSC-H x FSC-W) ve nötrofiller (Ly6G+ve/F480-ve)gösterildiği gibi geçitli idi. Sayısal değerler her kapıdaki hücrelerin yüzdesini yansıtır. SSC-A = yan dağılım alanı; SSC-W = yan dağılım genişliği; SSC-H = yan dağılım yüksekliği; FSC-A = ileri dağılım alanı; FSC-W = ileri dağılım genişliği; FSC-H = ileri dağılım yüksekliği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Alveoler kemik kaybı kontrol ve ligated hayvanlar arasındaki farklar. (A) kontrolü ve (B) ligated fareler arasında alveoler kemik kaybı farklılıkları gösteren temsili fotoğraflar. (C) Sementoenamel kavşaktan (CEJ) alveoler kemik imine (ABC) ölçümleri ve M1 ve M2'nin mesiopalatal ve distopalatal çizgi açıları gösterilmiştir (ortalama ± SEM, n = 3). P-değerleri post-hoc Fisher'ın LSD testi ile iki yönlü ANOVA ile belirlendi. (*p < 0.01; **p < 0.001; ***p < 0.0001). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.