Akım moleküler Analizi ve metastatik potansiyel değerlendirme için sirkülasyon tümör hücrelerinin mikromanipülasyon

Uzak organlarda metastaz klinik tezahürü kanser ilerlemesinin son aşamasını temsil eder ve kanser ile ilgili ölümlerin% 90 ' den fazla hesapları¹. Lokalize metastatik hastalığa geçiş, genellikle tümör hücreleri (ctcs)^2,3,4dolaşımla aracılı çok adımlı bir süreçtir. Bu hücreler primer tümörden kan dolaşımı içine dökebilir ve uzak organlara taşınır, burada ekstrasat ve metastatik lezyonlar kurmak^5,6. Solid tümörler CTCs nispeten yüksek sayıda serbest bırakabilse de, çoğu CTCs, dolaşım, anoikis aracılı hücre ölümü, bağışıklık saldırısı veya sınırlı yetenekleri yabancı bir mikroortama uyum sağlamak için yüksek kesme kuvvetleri nedeniyle ölmek üzere kaderinde⁷. Bu nedenle, metastam-tohumlama becerisi ile donatılmış olan CTCs 'nin moleküler özelliklerinin diseksiyonu sağlayan araçlar kurmak çok önemlidir. Son preklinik ve klinik çalışmalar, tek ctcs ve CTC kümelerinin varlığı ve miktarının, çeşitli katı tümörlere sahip hastalarda daha kötü bir sonuç ile ilişkili olduğunu göstermektedir^{8,9,10 , 11} ' i ^{, 12} tane ^{, 13} ' ü ^{, 14} . CTC kümeleri, dolaşım sırasında birbirlerine bağlı iki veya daha fazla ctcs gruplarıdır ve tek ctcs^3,15,16' ya kıyasla metastaylarda daha etkilidir. Bir küme içindeki hücreler desmosomes üzerinden güçlü hücre hücresi yapışma korumak ve anoikis üstesinden gelmek için yardımcı olabilir kavşaklar,^17,18. Son zamanlarda, CTCs kümelemesinin, nüklenin ve proliferasyon ile ilişkili transkripsiyon faktörleri için bağlayıcı sitelerin hipometilasyonu ile bağlantılı olduğunu ve daha yüksek metaslit¹⁹' ı başarıyla başlatabilme yeteneğine yol açtığı gözlenmiştir. CTC küme dağılma sonuçları anahtar bağlama siteleri yeniden modelleme ve sonuç olarak, metastatik potansiyelinin bastırılması¹⁹. Ayrıca kanser hücrelerinin kümeleri için, CTCs de beyaz kan hücresi (en sık nötrofiller) dolaşım yüksek proliferasyon seviyeleri korumak ve onların metastatik yeteneğini artırmak için ilişkilendirebilirsiniz²⁰. Ancak, CTCs biyolojisi sadece kısmen anlaşılabilir ve temel moleküler özellikleri ve tek ve kümelenmiş hücrelerin açıkları da dahil olmak üzere birkaç soru açık kalır.

Son yıllarda, hücre yüzeyi ifade desenlerinin yanı sıra ctcs 'in fiziksel özelliklerinin, izolasyonlarının^{21,22,23,24, 25}. Antigen-bağımlı yalıtım yöntemleri çoğunlukla hücre yüzeyi epitel hücre yapışma molekül (EpCAM)²⁶ifadesine dayanır. En sık kullanılan ve (Şu anda) CTC numaralandırma için tek FDA onaylı platform, CTCs²¹yalıtmak için iki adımlı bir prosedür temel CELLSEARCH sistemidir. İlk adımda, plazma bileşenleri santrifüjleme ile kaldırılır, CTCs ise anti-EpCAM antikorları ile birleşen manyetik ferrosıvılarla yakalanır. İkinci adımda, CTC zenginleştirilmiş solüsyon, siteratin (CK)^8,18,19ifade eden çekirdeklenmiş (dapi-pozitif) hücreler için lekelenmiş iken, beyaz kan hücreleri (WBCs) kullanılarak tespit edilir Pan-lökosit Marker CD45. Son olarak, yakalanan hücreler entegre bir tarama platformuna yerleştirilir ve CTCs CD45 için negatif durumdayken EpCAM, CKs ve DAPı ifadesi aracılığıyla tanımlanır. Bu CTC numaralandırma için altın standardı olarak kabul olmasına rağmen, aşağı akım moleküler Analizi CTC alma içindeki kısıtlamaları nedeniyle bu teknoloji ile zordur. Ayrıca, yalıtım prosedürü verilen, CELLSEARCH daha yüksek EpCAM seviyeleri ile ctcs zenginleştirme lehine olabilir, daha düşük EpCAM ifade, örneğin kanser heterojenlik²⁷ veya epitel işaretçileri ^{baskılanması için örnek nedeniyle 28,29}. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, CTCs zenginleştirme için antijen bağımsız teknolojiler ortaya çıkmıştır. Örneğin, CTC-ıcwıp, geri kalan kan bileşenlerinden CTCs ve WBCs dahil olmak üzere çekirdeklenmiş hücrelerin hidrodinamik ayrımı bütünleştirir ve ardından antikor etiketli Vbcs 'nin immunomagnetik tükenmesi ile etiketlenmemiş ve uygun CTC 'lerin arıtılmasına izin verir ²⁵. çözüm. Ayrıca, çoğu ctcs, kırmızı kan hücrelerinden (RBCs) veya WBCs 'nin biraz daha büyük olması, boyut bazlı CTC zenginleştirme teknolojilerinin^23,30 (örn., parsortix sistemi (Angle)) geliştirilmesine yol açan bir mikrofluidik tabanlı teknoloji, ayrım kaseti boyunca daralan bir kanal oluşan, 10, 8, 6,5 veya 4,5 μm bir Terminal boşluğu önde gelen hücreler (farklı boyutlarda hedef kanser hücrelerinin beklenen çapına bağlı olarak mevcuttur). Kan hücrelerinin çoğu dar boşluğa geçer, CTCs boyutları nedeniyle kapana kısılırken (aynı zamanda düşük deformetlilik nedeniyle) ve bu nedenle kasette tutulur. Akış yönünü geri dönüş, uygulanabilir bir durumda olan ve aşağı akış analizi için uygun olan yakalanan CTCs 'nin serbest bırakılması sağlar. CTC yalıtım için seçilen Protokolden bağımsız olarak, ancak, tipik post-zenginleştirme yordamları hala nispeten az sayıda RBCs ve WBCs ile karışık CTCs verim, saf tek veya toplu CTCs zorlu analizi yapma. Bu sorunu gidermek için, kan hücresi kirleticileri tarafından sunulan potansiyel önyargı olmadan CTC manipülasyon sağlayan bir iş akışı kurduk. Değişken antikor kombinasyonları ile önceden immünostemenin eklenmesi, CTCs 'Leri kan hücrelerinden ayıran ve hatta farklı yüzey işaretleyici ifade profillerine sahip CTC alt gruplarını belirlemenizi sağlar. Bu son derece özelleştirilebilir prosedür daha sonra belirli akış uygulamaları ile kombine edilebilir.

Burada, CTC zenginleştirilmiş bir üründen başlayan (herhangi bir CTC zenginleştirilmesi teknolojisi ile elde edilen) bir iş akışını tarif ediyoruz ve tek hücreli çözünürlükte CTC biyolojisi hakkında bilgi edinmek için çeşitli yaklaşımlar birleştirir. Özetle, iş akışımız tek CTCs, CTC kümeleri ve CTC-WBC kümelerinin canlı immünostasyon tarafından tanımlanmasını sağlayarak, ex vivo kültür protokolleri, tek hücreli mikromanipülasyon ve aşağı akış analizinin ardından sıralamayı ve In vivo metastazı gösteriyor.

Hastaların kan örneklerini içeren tüm prosedürler katılımcıların imzalı onayı üzerine yapılmıştır. Prosedürler EKNZ BASEC 2016-00067 ve EK 321/10 protokollerine göre, etik ve kurumsal İnceleme Kurulu (kuzeybatı/Orta Isviçre [EKNZ] Etik Komitesi) tarafından onaylanmış ve Helsinki bildirimine uygun olarak işletildiler.

Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler kurumsal ve Kanton yönergelerine (onaylı fare Protokolü #2781, Basel-City Kanton veteriner ofisi) uygun olarak yapılmıştır.

1. hasta numunesi hazırlama

1. Başlamadan önce, tüm prosedür sırasında sterilitesi korumak için Aseptik çözümler ve malzemeler ile çalışmak için emin olun.
2. Bir meme kanseri hastası 10 mL EDTA kan toplama tüpü içine periferik kan 7,5 mL çekin.
3. Dakika başına 40 salınımı (OSC/min) sırasında sallanan bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında (RT) kısa bir süre için kan içeren tüpleri (1 h 'ye kadar) kulbin.
4. Tek ctcs ve CTC kümeleri için tercih edilen CTC yalıtım yöntemini kullanarak zenginleştirmek^21,22,23,25. CTCs 'yi 1x DPBS çözümünde serbest bırakın.
   Not: seçilen CTC-zenginleştirme teknolojisine bağlı olarak, kalan beyaz kan hücreleri ve kırmızı kan hücreleri mevcut olabilir. CTC küme yapılarını korumak için serbest basıncını ayarlayın.
5. Bölüm 3 ' te hemen sonraki adıma geçin.

2. fare numune hazırlama

1. Başlamadan önce, 25G iğne, 5 mM EDTA filtrelenmiş solüsyon ve 2 mL EDTA kan toplama tüpleri ile 1 mL insülin şırıngası hazırlayın.
2. Tüm prosedür sırasında sterilitesi korumak için Aseptik çözümler ve malzemeler ile çalışmak için emin olun.
3. Şırıngayı 5 mM EDTA çözeltisi ile ön yıkayın.
4. Şırıngayı 100 μL 5 mM EDTA ile yükleyin ve kabarcıkları çıkarın.
5. 80% CO₂ /20% O₂ gaz solunması kullanarak fareyi ötenize edin ve bir sonraki adıma hemen geçin.
   Not: CO₂ inhalasyon yöntemine bir alternatif Isoflurane anestezi (3 vol% Isoflurane ve oksijen (taşıyıcı gaz) 600 ml/dak akış hızında) servikal dislocation, ya da ketamin/xylazine çözeltisi enjeksiyon aşırı doz takip. Spesifik ötenazi yöntemi, onaylanmış fare protokolüne bağlı olarak farklılık gösterebilir.
6. Solunum aktivitesi yokluğunda hayvanın ölümünü teyit, kornea refleks eksik, ve dış uyaranlar olmadan idrara çıkma.
7. EDTA önceden yüklenmiş şırıngayı, 30 ° ' lik bir iğne ile kalp doğru sternum gelen toraks içine dikkatle tanıtan bir kardiyak delinme gerçekleştirin.
   Not: tecrübesiz deneyler Için, kalp delinmesini yapmadan önce, kalbi daha iyi görselleştirmek için göğüs boşluğunu önce açması tavsiye edilir.
8. 1 mL 'ye kadar kan alın. Pistonu bırakmadan, şırıngayı hayvan göğsünden çekin, iğneyi güvenle çıkarın, 2 mL EDTA kan toplama tüpünün kapağını açın ve kanı doğrudan içine çıkartın. Kapağı kapatın ve tüp 10X ters çevirin.
9. Kan içeren tüpleri kısa bir süre için (1 h 'ye kadar) RT 'de 40 OSC/min 'de sallanan bir çalkalayıcı üzerinde kulbe
   DIKKAT: iğne, keskin güvenli biyolojik tehlike elden çıkarılmalıdır.
   Not: Toplam kan hacmini artırmak için birden fazla delik mevcuttur. Önceki iğnenin içinde bulunan pıhtılaşmayı önlemek için farklı çekilenler için EDTA ile önceden yüklenmiş ayrı şırıngalar kullanın.
10. Seçim^21,22,23,25ctcs yalıtım yöntemi kullanarak tek ctcs ve CTC kümeleri için zenginleştirin. CTCs 'yi 1x DPBS çözümünde serbest bırakın.
    Not: seçilen CTC-zenginleştirme teknolojisine bağlı olarak, kalan beyaz kan hücreleri ve kırmızı kan hücreleri mevcut olabilir. CTC küme yapılarını korumak için serbest basıncını ayarlayın.
11. Bölüm 3 ' te hemen sonraki adıma geçin.
    Not: Aşağıdaki prosedürler Için, sabit ve taze izole kan kullanıldığından emin olun.

3. ctcs canlı immün boyama

1. 4 dakika boyunca 72 x g 'de SANTRIFÜJÜN CTC zenginleştirilmiş hücre süspansiyonu
   Not: 72 x g , rotor 100 mm çapına sahipse 800 rpm 'ye karşılık gelir. g-Force numarasını rotora göre dönüştürün.
2. 1% BSA çözeltisi içinde 2 μg/ml anti-human EpCAM-AF488 antikor ve 1 μg/ml anti-human CD45-BV605 antikor ya da 2 μg/ml Anti fare CD45-BV605 antikor eklemek için toplam 500 μL hacminde Pelet 'i yavaşça yeniden uygulayın.
   Not: meme kanseri hasta türevi CTCs Için, anti-human EGFR-FITC ve anti-human HER2-AF488 ek olarak anti-EpCAM ve anti-CD45 eklenebilir. Bu daha düşük EpCAM düzeylerini ifade eden CTCs daha iyi tanımlamak için izin verir.
3. RT 'de 30 dakika boyunca inküye yapın ve ışığa karşı koruyun.
4. 1 mL% 1 BSA, 1x DPBS çözeltisi ve 4 dakika boyunca 72 x g 'de santrifüjleme kullanarak Wash ctcs süspansiyonu Iki kez tekrar edin.
5. 1% BSA, 1x DPBS çözeltisi içinde 2 mL resuspend lekelenmiş hücreler ve 6-kuyu Ultra-düşük ek plaka 1 iyi toplam hacmi transfer.
6. CTCs ve kalıntı kan hücrelerinin sedimentasyonunu sağlamak için lambayı 4 °C ' de 10-15 dak.

4. CTCs ve tek hücreli çekme mikromanipülasyon

Not: başlamadan önce mikro manipülatörün tam olarak ayarlamak için 45 min kadar gerektirdiğini unutmayın. Bir kez ayarlandığında, CTC tanımlama ve mikromanipülasyon prosedürü hücre başına (veya küme) 2 dakikaya kadar gerektirir.

1. Boya bittikten sonra 2 saat içinde CTC çekme prosedürünü sonlandırtığınızdan emin olun.
2. Mikromanipülatör yazılımını başlatın ve mikro manipülatörü açın. Mikromanipülatörü bilgisayara bağlayın ve ardından Int aygıtınınardından Connect düğmesine basarak robotik kolu ve mikroskop aşamasını başlatın.
3. Makinenin her manipülasyon sonra bilgisayar üzerinden manevra edebilmek için koruma dolabı kapatın.
4. Etanol püskürterek ve kabinenin iç yüzeylerini silerek tozdan ve dökülmelere karşı yüzeyleri temizleyin. Temiz bir ortam sürecin sterilitesi sağlayacaktır.
5. Robotik kolun üzerine yeni bir cam kapiller takın. Tek hücreli çekme için 20-30 μm kapiller kullanın, 30-50 μm CTC küme çekme için tercih edilir.
6. Sistem yağı dağıtım veya duman çekiş ile boru mevcut tüm kabarcıklar çıkarın.
   DIKKAT: cam kapiller keskin ve kırılgan. Dikkatle ele.
7. Sterilizasyon tankı 1 ' i 70% etanol ile doldurun, sterilizasyon tankı 2, steril nükleücretsiz H₂O ve STERIL 1x dpbs ile tampon tankı.
   DIKKAT: tankların kapaklarını kapatmayın, bir sonraki adımda kapiller tanklara serbestçe erişmeli.
8. % 70 etanol ile iki kez kapiller sterilize.
9. Sterilizasyon tankı 1 ' i tank 2 ile değiştirin ve sterilizasyon fonksiyonunu kullanarak en az üç kez H₂O 'da kapiller yıkayın.
10. Mikromanipülatör yazılımını kullanarak yeni bir deneme başlatın ve otomatik ve Manuel seçim modları arasında çekme deneyi türünü seçin.
    Not: işleme bitiş noktasına göre deneme türünü seçin. El modu, kapiller hücre süspansiyon girdikten sonra bir robotik kol manevra sağlar. Bu adım, CTC kümelerinin ayrı hücrelere dağılması için gereklidir. Deneme sırasında çekme türünü değiştirmek mümkündür.
11. Sterilizasyon tankının (sıvı 1), tampon tankı (sıvı 2) ve yatırma tepsisinin (hedef 1 veya 2) konumunu belirleyen güverte tepsisini yapılandırın. Hedef 1 plaka içine mevduat sağlar, hedef 2 PCR tüpler veya PCR plakaları içine yatırmak için izin verir.
12. Sıvı tankların sıcaklığını ve 4 °C ' ye seçilen yatırma tepsisini ayarlayın.
    Not: çekme işlemi zaman alıcı olabilir. Bu nedenle sıvı tankların ve yatırma tepsisinin soğutulması tavsiye edilir
13. Yayımlanan CTCs çözümünü içeren Ultra düşük ataşman plakasını Mikromanipülatör kabininin içinde mikroskop altında konumlandırın. Plakanın kapağını çıkarın ve dolabı kapatın. Set up ve çekme prosedürü sırasında geri kalanı için RT plaka tutun.
14. Manuel olarak çekme (10-20X) ve gerekli tüm kanallar (Brightfield, FITC ve TRITC kanalları) pozlama süresi için mikroskop hedefi seçin.
15. Pikap plakasının (6-kuyu plakası) türünü görselleştirmek ve seçmek için araç çubuğundan iyi Navigator 'ı göster 'i seçin.
    Not: herhangi bir plaka veya iyi Format sadece üretici tarafından kurulabilir.
16. CTCs çözümünü içeren kuyunun ortasında Pickup konumunu kalibre edin, ancak görünüm alanının merkezinde hiçbir hücre olmadan. Kuyuların kenarlarında gerçekleştirilen kalibrasyon, düzensiz iyi yüzey nedeniyle hatalı kalibrasyona neden olabilir.
17. Kapiller (hız 0,01 mm/adım ve 1% hız) ile plakanın altına hafifçe dokunmak için sensörü kullanın.
18. Plaka altındaki 0,05 mm çekme konumunu ayarlayın.
    Not: devam etmeden önce plakaların ve tankların kapaklarını açıp kaldırtığınızdan emin olun. Kapiller kapalı veya kaldırılmamış bir kapağa kırılabilir.
    DIKKAT: kapiller kapaklarla temas edilirse, çevrede veya çözümlerde kırık cam bulunabilir.
19. Hücre türünü ve malzeme çekme parametrelerini seçin. Malzeme çekme parametresi ayarlanabilir ve her başlangıçta yüklenebilir. Tek hücreli çekme için el ile modunu seçin.
20. Malzeme çekme hazırlama ayarları içinde:
    1. Sistem yağı ile numune arasındaki hava boşluğu hacmini 1 μL 'ye ayarlayın
    2. Tampon sıvı hacmini , her çekme işleminden önce 0,5 μL 'ye kadar alacak şekilde ayarlayın.
       Not: arabellek sıvı hacmi toplam maksimum Pickup hacmine ayarlanır. Küçük birimler malzeme çekme veya yatırma verimliliğini etkilemez.
    3. Tampon sıvısının aspirasyon hızını % 1-6 arasında ayarlayın.
    4. Arabellek aspirasyon sonra 1 s için bekleme süresini ayarlayın.
       Not: arabellek sıvı tankı yerine hedef iyi tampon alma seçeneği gerekirse kullanılabilir
    5. Cam kapiller ve seçmeler arasında sterilizasyon yokyeniden ayarlayın.
       Not: gerekirse seçmeler arasında sterilizasyon el ile gerçekleştirilebilir. H 2 o içinde birden fazlayıkayarak takip etanol içinde ya da iki sterilizasyon arasında s, birden fazlayıkama yapın.
21. Malzeme çekme ayarları içinde:
    1. Malzeme çekme ve pozlama süresi mikroskop altında 7.500 μs sırasında kamera ayarlarını değiştirin.
    2. Sabit çekme yüksekliğiöğesini seçin.
       Not: bunun yerine takım sensörü veya otofokus seçilebilir. Ancak, plakanın küçük kusurları, sensörün veya otofokus hassasiyetini, kapiller plaka içine etkisi neden olabilir rahatsız edebilir.
    3. Kaynak plakaya giren kapiller aspirasyon hızını % 7-15 ' e ayarlayın.
    4. Etkileşimli çekmeözelliğini etkinleştirin.
    5. ΜL 'de aspirasyon hacmini 0-0.05 olarak ayarlayın.
    6. Aspirasyon hızını % 5 ' e ayarlayın.
    7. 0-1 için s 'de aspirasyon sonrasında bekleme süresini ayarlayın.
    8. Kapiller başına çekilen partiküllerin sayısını 1 olarak ayarlayın.
    9. Aynı konumda birden fazla çekme ve hiçbir kazma fonksiyonları ayarlayın. Aspirasyon özelliklerinin deneme tipine göre ayarlanması gerekir (örn. otomatik çekme modu daha büyük aspirasyon hacimleri gerektirebilir).
22. Mevduat ayarları içinde:
    Not: ayar ayarları kesinlikle mevduat plakasına/tüpüne bağlıdır.
    1. Tek hücreli çekme için, hedef plakaya giren kapiller hızını % 25 ' e belirleyin.
    2. Dağıtım hızını % 6 ' ya ayarlayın.
    3. S 'de dağıttıktan sonra bekleme süresini 0 olarak ayarlayın.
    4. Hedefe doğru dağıtılan hava boşluğu miktarını % 100 olarak ayarlayın.
    5. Yatırdıktan sonra durulama yokayarlayın.
       Not: sterilizasyon, kapiller temizlemek için yatırdıktan sonra gerçekleştirilebilir.
    6. Parçacıkların en fazla miktarda yatırma miktarını ve parçacıkları 1 ' e dağıtmak için hedef sayısını ayarlayın.
    7. Plaka için hedef 1 ' in a1 konumunda veya tüpler için hedef 2 ' nin a1 konumunda mevduat yüksekliğini kalibre edin. Kalibrasyon için kapak olmadan açık bir tüp veya plaka yerleştirin ve iyi yatırmaya hafifçe dokunmak için sensörü kullanın (hız 0,01 mm/adım ve 1% hız). Plakanın alt kısmındaki 1 mm 'lik yatırma yüksekliğini ayarlayın.
23. Ayarlariçinde:
    1. Çekme sırasında sahne alanı hızını % 5-10 olarak ayarlayın.
       Not: plakanın hızlı hareketleri, askıya alma sırasında hücrelerin hareket edilmesine ve yanlış konumlandırmaya bağlı olarak birden fazla hücre toplama zorluklara neden olabilir.
    2. Sterilizasyon özelliklerini 1 μL 'ye durulama hacmi, 3 durulama döngüsü ve sterilizasyon turuna göre 2 s bekleme süresi kullanarak ayarlayın.
    3. Kapatmadan önce değişiklikleri uygulayın.
24. Kuyu içinde joystick kullanarak cam kapiller gidin ve ilgi tek hücrenin üstüne yerleştirin. Kapiller Kuyumun kenarına kırabilir gibi iyi sınırdan (1 mm) güvenli bir mesafede pozisyonları çekme seçin.
25. Joystick düğmesini kullanarak veya menüden elle seçerek parçacıklar el ile ekleyin.
26. Çekme başlatmak için aktive parçacıkları Pick seçin.
27. Kapiller, plakanın alt kısmındaki 0,05 mm 'ye ve interaktif çekme (manuel mod) nedeniyle seçilen Pickup konumunun üstüne duracaktır. Parçacık ve çevreleyen dpbs çözümünü manuel olarak Aspire etmek için joystick 'in düğmesini saat yönünde hafifçe çevirin. Manuel mod açık olduğunda maksimum birim sabitlenmez. Ancak, şırınga içinde izin verilen maksimum hacim 25 μL olacaktır.
28. Joystick 'in düğmesini saat yönünün tersi yönde hafifçe çevirerek aşırı DPBS çözümünü veya istenmeyen parçacıkları dağıtın. Çok fazla dağıtım, çözümünüzde şırınga oluşturan kabarcıkların hava boşluğu ve görünürlüğü tehlikeye atacaktır.
29. Depozito ile devam etmek için Next tuşuna basın.
30. PCR tüpüne veya PCR plakasına giren kapiller, hacminin serbest bırakılması ve boş bir kapiller ile başlangıç pozisyonuna geri dönüş dikkate alın.
    Not: kapiller içinde hacim bırakılırsa sterilizasyon ile devam edin. Sonra, yeni bir çekme yapmadan önce ayarları, yağ seviyesini ve yağ yüksekliğini yeniden kontrol edin.
31. Yeni bir tek hücreli çekme başlatmak için Bölüm 4 ' ün 26 noktasından devam edin. Çekme sırasında kapiller yerine gerekli olabilir. Kurulumdan sonra, Pickup konumunun yeni bir kalibrasyonu yapılmalıdır. Kalibrasyonun sonunda, yeni kapiller kalibrasyonuna depozito yüksekliğini düzeltmek ve mevduat yüksekliği kalibrasyonunu atlamak için (Bölüm 4,16) Z-yükseklikte kalibre edilmiş değişiklikleri Uygula 'yı seçin.
    Not: Bölüm 1-4 açıklanan adımları CTCs zenginleştirme ve yalıtım yöntemlerinin çoğu için geçerlidir. Burada belirli CTCs analizi için isteğe bağlı adımlar bildiriyoruz.

5. tek hücreli toplama ve yaşam ve proliferasyon analizi için tohumlama

1. Tüm prosedür sırasında sterilitesi korumak için Aseptik çözümler ve malzemeler ile çalışmak için emin olun.
2. 20 μL CTC kültür ortamları³¹ile kültür için seçilmiş tek ctcs içeren bir 384 iyi plaka hazırlayın. CTCs 'nin, manipülasyon sonrasında ortamın küçük hacimlerinde (örn. 384 iyi plaka için 10-20 μL) elde edilmesini sağlayın.
3. Çözümü plakanın alt kısmına döndürün. 384 iyi plakayı hedef 1 ' ye yerleştirin ve 4 °C ' de tutun.
4. Mikromanipülatör ayarlamak ve yeni bir çekme başlatmak için Bölüm 4 ' te açıklanan Mikromanipülatör ile tüm adımları gerçekleştirin.
   Not: tek hücrelerin birden çok seçimi bir malzeme çekme listesinin oluşmasına neden olur. Parçacıklar seçilmiş olacak ve ardışık kuyular biri tarafından yatırılır (bkz. Bölüm 4.22.6). Bununla birlikte, interaktif mod (manuel mod) aspirasyon öncesinde kapiller sağ durdurur, bu nedenle bu kritik adımı kontrol etmek ve başarılı çekme sağlamak için deney girmek izin verir. Plakanın hızlı hareketleri, süspansiyon hücrelerinde hareket ve birden fazla hücre toplama zorlukları neden olabilir.
5. Yatırdıktan sonra, yeni bir çekme başlatmak için adım 4 ' ü yineleyin.
6. Çekme sonunda, 4 dk için 72 x g plaka Santrifüjü, çekilen hücrelerin kuyu altına yerleştirildiğinden emin olmak için.

6. CTC küme kırma ve tek hücreli sıralama için çekme

1. Tüm prosedür sırasında sterilitesi korumak için Aseptik çözümler ve malzemeler ile çalışmak için emin olun.
2. 1 U/μL RNA inhibitörü içeren toplam 2,5 μL hücreli parçalanması çözeltisi ile kırık kümenin tek hücrelerini içerecek tek PCR tüpleri veya PCR plakası hazırlayın.
3. Hızlı bir şekilde tüp altına çözüm spin. Yatırma konteynerleri hedef 2 ' ye yerleştirin ve 4 °C ' de tutun.
4. Mikromanipülatör ayarlamak için Mikromanipülatör ile Bölüm 4 ' te açıklanan tüm adımları gerçekleştirin.
5. Yeni bir çekme başlatın. Kılcal, interaktif çekme (manuel mod) nedeniyle plakanın alt kısmındaki ve seçilen CTC kümesinin üstüne 0,05 mm durduracaktır.
6. Kümeyi ve çevreleyen dpbs çözümünü manuel olarak Aspire etmek için joystick 'in düğmesini saat yönünde hafifçe çevirin. Joystick 'in düğmesini saat yönünün tersine hafifçe çevirerek CTC kümesi dahil olmak üzere aspirasyonlu hacmi dağıtın.
7. Küme oluşturan tek hücreler birbirinden ayrılıncaya kadar 6. adımda açıklanan CTC kümesinin aspirasyonu/bertaraf edilmesini tekrarlayın.
   Not: çok fazla dağıtım, çözümünüzde şırınga oluşturan kabarcıkların hava boşluğu ve görünürlüğü tehlikeye atacaktır.
8. Göz tarafından tek hücrelerin konumunu izleyin. Joystick düğmesini kullanarak veya menüden elle seçerek parçacıkları elle ekleyin.
   Not: tek hücrelerin birden çok seçimi bir malzeme çekme listesinin oluşmasına neden olur. Parçacıklar çekilmiş olacak ve ardışık PCR tüpler/kuyular biri tarafından yatırılır (bkz. Bölüm 4.22.6). Bununla birlikte, interaktif mod (manuel mod), aspirasyon öncesinde kapiller sağ durdurur, bu nedenle, bu kritik adımı kontrol etmek ve başarılı çekme sağlamak için deney girmek izin verir.
9. Çekme başlatmak için aktive parçacıkları Pick seçin.
   Not: hücre parçalanması çözüm miktarını tamamen Lyse tek bir hücre izin verir. Ancak, lysed içeriği parçalanması Ajan uzun pozlama DNA veya mRNA düşebilir. Bu nedenle, hemen sonraki adıma geçin.
10. Hemen seçilmiş tek hücreyi içeren tüpü kapatın ve ek donma için kuru buzda aktarın.
11. Hızla tüp spin ve yatırılan hücrenin uygun bir Lyse sağlamak için tüp tarafında damla yokluğunda kontrol edin.
12. Yeni bir çekme başlatmak için adım 5 ' ten tekrarlayın.
    Not: mikroskop sahne-ecek hareket etmek a katma parçacık diğerine hız içinde açıklanan Bölüm 4.23.1. Ultra düşük ataşman plakasında CTCs süspansiyonu hareket edebilir ve yanlış konumlandırma nedeniyle hatalı çekme neden olabilir.

7. fare enjeksiyon için CTCs yalıtım

1. Tüm prosedür sırasında sterilitesi korumak için Aseptik çözümler ve malzemeler ile çalışmak için emin olun.
2. 5 μL steril 1x DPBS ile bir PCR tüpü hazırlayın.
3. Hızlı bir şekilde tüp altına çözüm spin. Yatırma konteynerleri hedef 2 ' ye yerleştirin ve 4 °C ' de tutun.
4. Mevduat ayarları içinde adım 4.22.6 bir değişiklik uygulamak: 1.000 için iyi başına parçacıklar mevduat maksimum miktarını ve parçacıklar 1 dağıtmak için hedefler sayısını ayarlayın. Bu adım, çekilen hücrelerin 1.000 kez aynı tüpte yatırılmasını sağlar.
5. Çekme adımını tam olarak kontrol etmek ve çekilen çözümü kirletici hücrelerden serbest tutmak için yalnızca interaktif modu (manuel mod) kullanın.
   Not: 1.000 ' den fazla hücre gerekiyorsa, 1.000 hücre sonra örnek kaybını önlemek için parçacıkları dağıtmak için hedefler sayısını artırın.
6. Yeni bir çekme başlatmak için Bölüm 4,26 adımlarını devam edin. Birden çok istek gerçekleştirmek için 6. Fare enjeksiyonu için kullanılabilir hücre sayısını izlemek için her çekme sırasında toplanan hücrelerin sayısına ek açıklama ekleyin.
7. Çekme sonunda, hortum Santrifüjü 72 x g 4 dakika (bkz. Bölüm 3,1.) ve Aspire supernatant.
8. Toplanan CTCs fare enjeksiyonu için uygun seçim tampon içine resuspend. Meme yağ Pad enjeksiyon için, 1x dpbs ve reconstituted Bodrum membranı 1 ila 1 oranında toplanan ctcs pelletini ve enjeksiyon kadar 4 °c tutun. İntravenöz enjeksiyon için sadece dpbs toplanan ctcs pelletini.
   Not: çözümün hacmi kesinlikle enjekte edilecek CTCs sayısına bağlıdır. Meme yağ yastığı veya en fazla 100 μL fare başına intravenöz enjekte etmek için tavsiye edilir. Hacmi hesaplarken, her zaman manipülasyon ve şırınga yükleme için ölü hacmi düşünün.

Sunulan iş akışı, tek CTCs 'den ya da CTC kümelerinden ayrılmış olan bireysel CTCs 'lerin hazırlanmasına olanak tanır. Hastaların veya tümör taşıyan farelerden gelen CTCs, mevcut CTC-zenginleştirme yöntemleri ile bütün kandan zenginleştirilerek kanserle ilişkili işaretçileri (örn. EpCAM, yeşil) ve WBC 'ye özgü belirteçleri (örn., CD45, kırmızı) karşı antikorlar ile lekelenmiştir (Şekil 1a ). Lekeli CTC ürün daha sonra mikromanipülasyon istasyonuna aktarılır bireysel hücreler, PCR tüpler veya multiwell plakaları yatırılır ve tek hücreli sıralama, in vitro kültür veya dahil olmak üzere, aşağı analiz için hazırlanan, çekildi In vivo deneyleri (Şekil 1B).

Bu yöntemin güvenilirliği, el ile hücre çekme sırasında uygun bir hedef hücre ayrımı dayanır. Anti-EpCAM antikorları ile canlı immünostatuvar, süspansiyonda kanser hücrelerini görselleştirir ve CD45-pozitif olaylardan (büyük olasılıkla WBCs) doğru bir ayrım sağlar (Şekil 2a). Düzgün kalibre ve korunur, CellCelector iyi kontrollü hücre manipülasyon sağlar. Hassas CTC yalıtımı, CTC küme aspirasyonu (Şekil 2B, C) öncesinde ve sonrasında çekilen resimlerde gösterildiği gibi, çevreleyen kirletici hücreler (RBCs veya WBCs) olmadan yalnızca istenilen hedefin aspirasyonu ile karakterize edilir.

Daha önce açıklandığı gibi, CTC kümeleri, eşleştirilen tek CTCs19' a kıyasla daha fazla metastatik fenotip görüntüler. Ancak, komşu hücrelerin varlığı küme içindeki hücrelerin proliferasyon hızını artırmak için yeterli olup olmadığını bilinmiyor. Bu soruyu ele almak için 1009 tek CTC ve 1008 CTC kümeleri arasında değişen 2-17 hücreleri (% 89,5 ile 2-5 hücre kümeleri olmak) CTC-türetilen BR16 hücre satırından türetilen20 bireysel kuyuları içine mikromanipüle edildi 384-Well Ultra düşük montaj plakaları. Her kuyunda canlı hücrelerin sayısı mikroskop altında elle sayılır ve haftalık olarak kaydedildi. Tüm analizler hücre numarasının normalleştirilmesi sonrasında yapıldı (yani, üç hücreli küme üç ayrı hücre olarak analiz edildi). Başarısız koloniler, deney sonunda kuyunda yaşayan hücrelerin eksikliği ile karakterize edildi. Şüpheli olarak, CTC kümeleri tek CTCs ile karşılaştırıldığında artan hayatta kalma gösterdi ve in vitro kültür 56 gün içinde hücre kolonilerine yol verdi (Şekil 3A, 3B). Özellikle, CTC kümeleri de daha yüksek proliferasyon oranı gösterdi ve böylece daha yüksek nihai hücre numaraları ulaştı (Şekil 3c), diğer tümör hücreleri ile doğrudan temas hem onların canlanma ve proliferasyon oranı üzerinde bir etkisi olduğunu belirten.

Son olarak, meme kanseri hastalarından doğrudan izole edilen CTCs 'nin tek hücreli RNA sıralama verilerini sağlıyoruz. Özellikle, tek CTCs, CTC kümeleri veya CTC-WBC kümelerinden (Şekil 4) türetilen tek hücrelerin t-dağıtılmış Stokastik komşu katıştırma (tsne) gösteriyoruz. Bu yaklaşım, benzer gen ifade profiline sahip hücrelerin tanımlanması ve belirli genlerin ifadesine göre farklılık gösteren hücre nüfuslarının ayırt edilmesini sağlar.

Şekil 1 . Deneysel iş akışının şematik gösterimi. (A) ctcs kanser hastalarının veya fare kanseri modellerinin kanından elde edilir, kullanılabilir yöntemleri kullanarak zenginleştirilmiş ve tümör hücrelerini ayrımcılık antikorları ile etiketlenmiş (yeşil) beyaz kan hücrelerinden (kırmızı). (B) ctcs 'nin hassas mikromanipülasyonu, tek hücreli SıRALAMA, CTC kültürü veya in vivo transplantasyon deneyleri gibi birden fazla prosedür ve uygulamayı kolaylaştırır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 2 . Mikromanipülasyon öncesi ve sonrası CTCs temsilcisi resimleri. (A) bir CTC-türetilen xenograft (NSG-CDX-BR16) türetilen ve ctcs ve beyaz kan hücrelerinin görselleştirme etkinleştirmek için antikorlar Anti-EpCAM (yeşil) ve anti-CD45 (kırmızı) ile lekelenmiş ctcs temsili görüntüleri, sırasıyla. Büyütme 40X gösterilir. (B, C) Mikromanipülasyon, CTCs 'nin istenmeyen hücrelerden önce (sol) ve sonra (sağ) hücre aspirasyon prosedürünü görüntülerde gösterildiği gibi kesin olarak ayrılması için izin verir. Büyütme 10X. Daha büyük görünüm (B) ve daha dar bir görünüm alanı (C) sırasıyla gösterilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. 

Şekil 3 . Tek CTCs ve CTC kümelerinin hayatta kalma ve proliferasyon analizi. Tek CTCs veya CTC kümeleri kültürlü CTC-türetilen BR16 hücrelerinden bireysel hücreler 384-Well plakaları içine mikromanipüle edildi. (A) Kaplan-Meier Arsa hücre kümeleri karşı tek hücreler seribaşı hayatta kalma olasılığını gösteren. P< ikili log-Rank test tarafından 0.0001. (B) deney sonunda canlı hücrelerden oluşan kolonilerin oranını temsil eden çubuk grafik (gün 56). P< 0.0001 tarafından Chi-Kare testi. (C) deneme süresince normalleştirilmiş hücre numarası dağılımını görselleştiren heatmaps (gün 0, 8, 32, 56). Her blok bir başlangıç hücresini temsil eder ve heatmap belirli bir zaman noktasında iyi başına hücre sayısını gösterir. d = gün. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 4 . Tek hücreli RNA sıralaması. CTC RNA ifade verilerinin, t-dağıtılmış Stokastik komşu katıştırma (tSNE) kullanarak görselleştirilmesi. Her nokta tek bir CTC, CTC kümesi veya CTC-WBC kümesinden türetilen tek bir hücreyi temsil eder. Noktaların renkleri donör KIMLIĞINE karşılık gelir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

No ve BMS, tümör hücrelerinde dolaşan ve kanserin tedavisi ile ilgili patent uygulamalarında mucitler olarak listelenmiştir. No, sıvı biyopsisi ile ilgili ilaç ve sigorta şirketleri için ücretli bir danışmanıdır.