Bu raporda, immünhistokimya (ıHC) için dondurulmuş fare Retina bölümlerini hazırlamak için kapsamlı yöntemler açıklanmaktadır. Tanımlanan yöntemlerle oküler posterior bardak diseksiyonu, paraformaldehit fikstasyon, optimum kesme sıcaklığı (OCT) medya ve doku oryantasyonu, seksiyonlama ve immünostasyonu katıştırma bulunmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Immünhistokimya için fare retinal Cryo-bölümler hazırlanması
Bu makalede
Özet
Özet
İmmünhistokimya (ıHC) için yüksek kaliteli fare göz bölümlerinin hazırlanması, Retina yapısının ve fonksiyonunun değerlendirilmesi ve Retina hastalıklarının temelindeki mekanizmaların belirlenmesi için önemlidir. Doku hazırlığı boyunca yapısal bütünlüğünü sürdürmek, tekrarlanabilir Retina IFC verilerini elde etmek için hayati önem taşımaktadır, ancak Retina sitilinin kırılganlık ve karmaşıklığı nedeniyle zor olabilir. % 10 formalin veya Bouin çözeltisi gibi güçlü fiksatörler Retina yapıyı optimum şekilde korur, genellikle arka plan floresan ve/veya azalan antikor-epitopu etkileşimleri, epitopu maskeleme olarak bilinen bir süreci artırarak IFC analizini azaltır. Diğer taraftan,% 4 paraformaldehit gibi daha hafif fiksatörler, retina yapısını korumak için arka plan floresan ve epitope-maskeleme, titiz diseksiyon tekniklerini azaltmıştır. Bu yazıda, Retina yapısal bütünlük kaybı olmadan en antikor-epitope etkileşimlerini korumak için yeterli olan IFC için fare oküler posterior bardakları hazırlamak için kapsamlı bir yöntem sunuyoruz. En uygun ve en uygun koşullarda doku koruma ve oryantasyonunu göstermek için çeşitli Retina hücre tipi belirteçleri için antikor ile temsilci ıHC içerir. Amacımız ihc 'de oküler posterior fincan diseksiyon tam bir protokol sağlayarak retinada ıFC çalışmalarını optimize etmektir.
Giriş
İmmünhistokimya (IHC), situ1,2,3' te dokularda spesifik proteinleri ve hücresel yapıları yerelleştirme için güçlü bir tekniktir. Uygunsuz fiksasyon yöntemleri ve kompleks dokuların alt-optimum kesmesi doku yapısını bozabilir, yüksek arka plan boyama veya antikor-epitope etkileşimlerini azaltır, boyama eserler ve sonuç olarak yanlış yorumlama sonucu IFC veri4. Vertebrat retinası, birbirine bağlı fotoreceptörler, internöronlar ve ganglion hücrelerinin tabaklarından oluşan kompleks ve son derece organize nöral organdır, çok kırılgan ve diseksiyon ve sekleme sırasında kolayca bozulabilir. Fare göz diseksiyonu ve immünostasyon oryantasyonlarından ayrıntılı, standartlaştırılmış ve onaylanmış bir protokol, ıHC yapılarını önemli ölçüde azaltmaya yardımcı olur, böylece sonuçların güvenilirliğini arttırır ve daha doğru karşılaştırmalı veri sağlar Analysis.
IHC için doku hazırlama için birçok protokol vardır, ancak, tüm Retina doku için uygun değildir. % 10 formalin veya Bouin çözeltisi gibi güçlü fiksatörler, diseksiyon ve sekleme sırasında retina yapısını korur5. Ne yazık ki, güçlü fiksasyonlar genellikle Gelişmiş arka plan floresans ve epitopu maskeleme nedeniyle epitoplar kimyasal modifikasyon6yol açar. Öte yandan,% 4 paraformaldehit (PFA) gibi daha hafif fiksatörler, bu yapıtlardan bazılarını hafifletebilir ancak optimum retina yapısını korumak için titiz diseksiyon ve sekürleme gerektirir. PFA hızla dokuya nüfuz eder, ancak proteinleri çok yavaş çapraz bağlar, epitopu maskeleme riskini azaltır. Kısa süre içinde PFA inkübasyon nispeten hafif bir fikfasyon olduğundan, dokularda genellikle antijenleri korumak için hızlı donma gerektirir. Doku donma sırasında buz kristali oluşumunun önlenmemesi ve hücrelerin ve dokularının bütünlüğünü bozması önemlidir7.
Burada, tutarlı ve güvenilir ıFC verilerini sağlayan fare oküler posterior bardakların diseksiyon, sabitleme ve Cryo koruması için ayrıntılı ve standartlaştırılmış protokoller açıklanmaktadır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Burada tarif edilen tüm yöntemler, laboratuar hayvan kaynakları Enstitüsü tarafından sağlanan Laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için Ulusal Sağlık Rehberi 'nin önerileri ile sıkı bir şekilde yürütülmüştür ve Pennsylvania Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi.
Yöntem için tüm araç ve ekipmanlar Şekil 1 ' de gösterilir ve malzeme tablosundalistelenir.
1. Fare göz enucleation, göz bardağı diseksiyon ve gömme
- Karbon dioksit (Co2) ile ötenize fareler (postnatal fareler P0-P11) veya servikal çıkığı (Yetişkin > P11 fareler) ya dekasitasyon izledi. P0-P14 fareler için, gözler deri ile kaplıdır. Sonraki adımlardan önce cildi kaldırmak için emin olun.
- Gözün temporal kısmını işaretleyin (Şekil 2a) bir kuyruk cauterizer kullanarak biraz kornea yakmak. Kornea çok hafifçe dokunarak ve cauterizer ile bir bölünmüş ikinci daha fazla değil, kornea bir delik yakmak kaçının.
- Hemen eğimli Dumont #5/45 forseps kullanarak fare gözleri anlatabilirsin. Buz üzerinde fosfat-tamponlu tuz (PBS) içinde 1 ml% 4 paraformaldehit (PFA) ile 1,5 ml geminizi tüpünde 15 dakika boyunca inküye yapın.
- % 4 PFA 15 dakika sonra, sabit göz kavisli forseps kullanarak transfer Dumont #5/45 değiştirilmiş bir 35 mm diseksiyon çanak için (bkz: malzeme ve Şekil 1C tablo ) PBS ile dolu ve diseksiyon mikroskop altında yer.
- Mikro bıçağı kullanarak limbus (kornea sınırı) üzerinde ve sadece üzerinde dik, yanık işareti küçük bir kesi olun.
- Eğri makas kesi içine yerleştirin ve limbus aşağıdaki kornea bir çevresel kesim gerçekleştirmek (Şekil 2B).
- Kornea çıkarın ve ince bir Dumont #5 forseps ile objektif ayıklamak, (Şekil 2B) ve özenle uzak gözün posterior kısmından kaldırın. Vitreus Vücut, objektif ve Retina arasındaki boşluğu dolduran açık jel, objektif (Şekil 2B) ile ortaya çıkar ve Retina arka göz bardağı iç kapsayan beyaz bir yüzey olarak görünür olacaktır. Retinada delik veya gözyaşı gibi görünür bir hasar olmadığından emin olun (Şekil 2C).
- Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1 mL PBS 'de iki kez göz bardağı yıkayın.
- Göz bardağı lavabolar kadar 4 °c gecede PBS% 15 sakaroz bir çözüm onları dengeleyici tarafından göz bardağı koruyun
- Göz bardağı lavabolar kadar 2-3 h için PBS içinde% 30 sakaroz su bardağı aktarın.
- 10 x 10 mm cryomolds (Şekil 3A) Ekim ayında göz bardağı katıştırın. Bir diseksiyon mikroskop kullanarak, onun dorsal-ventral ekseni boyunca cryomold göz yönlendirmek (Şekil 2D, Şekil 3A) yanık işareti üstte kadar göz çevirerek, optik sinir solda ve kalıp kesme parçası sağ yüzleri ( Şekil 2D). Doku yakınındaki kabarcıkları önlemek için dikkat alın.
Not: göz bardağı manipüle etmek Için, bir pipet ucu bağlı bir titanyum tel yapılmış bir titanyum prob kullanın. - Retina dokusu Snap-dondurmak için, ısopentane içeren bir metal kabı en az 5 dk için cryomold daldırın ve sıvı nitrojen veya kuru buz/% 100 etanol banyosu içinde kabı yerleştirin (kadar 1/3 metal kabı yüksekliği).
Not: cryomold ısopentane içinde yüksekliğinin yarısından daha büyük, ancak tamamen subbirleştirilmiş olması gerekmez dalmış olmalıdır. - Dondurulmuş bloğu çıkarın ve alüminyum folyo içinde sarın.
- -80 °C ' de saklayın.
- Blokun yönünü kaydetmek için bir kalem veya keskinleştirme kullanarak dondurulmuş bloğu işaretleyin (Şekil 3B).
2. Bir kriyostat kullanarak bölümleme
- Kriyostat sıcaklığını (-20 ve-25 °C arasında) ayarladıktan sonra, gömülü göz bardakları içeren kalıpların 1 h için kriyostat sıcaklığına dengelenmesine izin verin.
- Bloğu Dorso-ventral oryantasyona (Şekil 3c) takın ve 10 μm kalınlığında seri bölümleri keser. Retina bölümlerini dikkatle detaylandırılmış ve numaralandırılmış mikroskop slaytlarına yerleştirin.
- Slayt kutularındaki slaytlar-20 °C veya-80 °C ' ye kadar ıFC prosedürlerine kadar saklayın.
3. Slayt raf kullanarak floresan immünostans
Not: slayt raf sistemi (örn., Sequenza), cam mikroskop slaytlarını bir kapak plakasına sahiptir ve slayt ile plaka arasında bir ~ 100 μL kapiller boşluğu yaratmaktadır.
- Oda sıcaklığında (RT) Cryo-bölümlerin, Kuru ve mikroskop slaytlarına bağlaymalarına izin vermek için 2 saat ile 4 saat arasında çözüyor.
Not: Ayrıca 30-37 °C ' de 30 dakika ila 1 saat boyunca kurutmak mümkündür. - Slaytları Slayt rafa yerleştirin ve 100-200 μL PBS 'de 2 dakika boyunca retina bölümleri iki kez yıkayın.
- RT 'de 5 dakika boyunca PBS 'de% 0,25 Triton-X/0,05% Nan3' te onları inküle ederek Retina bölümleri geçirgen.
- 100 Ekle μL slaytlar için çözüm engelleme.
- 100 ekleme μL birincil antikor slaytlar için engelleme çözümü seyreltilmiş.
- Retina bölümlerini 4 °C ' de geceleyin.
Not: Bu süre zarfında, bölümlerin kurutmaması için slayt rafa 'nı kapun. - Retina bölümleri 3 kez, her biri 15 dakika boyunca, 200 μL PBS kullanarak yıkayın.
Not: 0,001-0,002% Triton-X100 PBS (PBS-T) ilavesi daha sıkı bir yıkama sağlar ama bazı membranlar ve hücresel yapıları bozabilir. - RT 'de 1 h için floresan etiketli ikincil antikorlarda Retina bölümleri inkük. Şu andan itibaren ışığın korunması.
- Retina bölümlerini 3 kez, her biri 15 dakika yıkayın.
- Hoechst 33342 veya DAPI solüsyonu gibi bir nükleer Marker ile RT 'de Retina bölümleri 5 dakika boyunca kulvarın.
- Retina bölümleri 15 dakika boyunca 1 kez yıkayın.
- Laboratuvar tezgah üzerinde bir kağıt havlu üstüne bir lamel magazini yerleştirin.
- Coverslip merkezine Anti-solma montaj medya 2 damla ekleyin.
- Retina Cryo bölümünün aşağı bakacak şekilde slaytı çevirin.
- Lamel magazini 'ı ~ 45 ° ' lik bir açı ile dikkatlice monte edin ve slayt üzerine montaj ortamına doğru kaydırın.
Not: slaytı yerine düşürmeye çalıştığınızda baloncuklar oluşturarak kaçınarak. - Aşırı montaj ortamını ortadan kaldırmak için ağır bir kitap veya katalog kullanarak (aşağıya bakın), slayt-coverslip kombinasyonuna bile basınç uygulayın.
Not: örnek hazırlıkta tutarlılığı sağlamak Için, her zaman aynı nesneyi kullanın (örn. aynı kitap veya katalog), slayt montajı sırasında kapak kaymasına bile baskı uygulamak için. - Düz tutun ve karanlıkta RT bir gecede sertleşmesine izin. Slaytlar 4 °C ' de sonsuza kadar düz saklayın.
- Geniş alan veya konfokorik floresan mikroskobu ile görüntü (Şekil 4).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Nasıl bu protokoller, IFC için optimum Retina koruma sağlamak göstermek için, biz P28 WT fareler (C57BL/6N) rodopsin (bir fotoreceptor Marker) antikorlar ile retina bölümler probed8, glutamik asit decarboksilaz 65 (Gad65, bir amacrine hücre Marker)9, glutamin sentetaz (GS, bir Müller hücre Marker)10, ve calbindin (yatay hücre işaretleyicisi)11 (Şekil 4). IHC, proto...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Fare Retina diseksiyon küçük boyutu ve fare gözleri şekli ve Retina doku kırılganlık nedeniyle hassas bir süreçtir. Yüksek kaliteli diseksiyon yapmak bir uygulama meselesi olsa da, ayrıntılı bir protokole sahip olmak, verimli yöntemler ve ipuçları sağlamak Retina bölümler ve IHC elde etmek için bir zorunluluktur. Burada açıklanan protokollere ek olarak, tekrarlanabilir IHC için uygun olan tutarlı yüksek kaliteli Retina bölümler için izin çeşitli ipuçları vardır.
Diseksiyon başlamadan önce, rah...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Açıklamalar yok.
Teşekkürler
Bu çalışma NıH (RO1-GMO97327) ve Üniversite Araştırma Vakfı (UPenn) ' den gelen fonlar tarafından destekleniyordu. Özellikle, immunohistokimya protokolü, Gordon Ruthel (Pennsylvania Üniversitesi) ve Penn VET Imaging Core ile ilgili yardım için mikroskopi ve Leslie King, PhD. .
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 6qt. Paslanmaz Çelik Beher (185 x 218mm) | Gilson | #MA-48 | Sıvı nitrojen için (Şekil 1E) |
| Alüminyum folyo ve nbsp; | |||
| Koterizatör | Bovie | #AA01 | Göz yönünü işaretlemek için (Şekil 1A) |
| Kavisli forseps, Dumont #5/45 cımbız, 45 derece bükülmüş | Elektron Mikroskobu Bilimleri | # 72703-D | Fare gözü enükleasyonu ve bakımı için (Şekil 1A) |
| Kavisli makas, Vannas Yaylı Makas - 2,5 mm Kesici Kenar | Güzel Bilim Araçları | #15002-08 | Korneayı çevresel olarak kesmek için (Şekil 1B) |
| kabı diseksiyonu için | diş balmumu kaplı 35 mm diseksiyon kabı | ||
| Diseksiyon mikroskobu | Leica, Houston, ABD | MZ12.5 Yüksek Performanslı Stereomikroskop | |
| Mikro Bıçaklar - Plastik Saplı | Güzel Bilim Araçları | #10315-12 | Yanık izinde küçük bir kesi yapmak için (Şekil 1A) |
| Pembe diş mumu | Elektron Mikroskobu Bilimleri | # 72660 | Diseksiyon çanağını kaplamak için |
| Sürgülü Raf ve Kapak Plakası | Ted Pella | # 36107 | Retinal IHC için (Şekil 1G) |
| Paslanmaz Çelik Beher (89 x 114mm) | Gilson | #MA-40 | İzopentan banyosu için (Şekil 1E) |
| Strafor kutu | Yalıtımlı soğutucu için | ||
| İnce forseps Dumont #5 | Güzel Bilim Araçları | #11254-20 | Korneayı çıkarmak ve lensi çıkarmak için (Şekil 1B) |
| Tissue-Tek kriyomold (10 mm x 10 mm x 5 mm) | Elektron Miskroskopi Bilimleri | # 62534-10 | OCT gömme için kalıp |
| Tamponlar ve Reaktifler< / strong> | Company< > < | strong>Katalog Numarası< / strong> | Comments |
| Blokaj çözümü | 2 Normal At Serumu,% 1.5 Soğuk Balık derisi Jelatin (H2O'da% 40-50'de, kedi #G7765),% 5 sığır serum albümini (kedi #AK1391-0100) geçirgenlik tamponunda. | ||
| Gelvatol (solmayı önleyici montaj ortamı)Çeker | ocak altında, 0.337g DABCO'yu (Sigma cat #D2522-25G) 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01) içinde çözün. 12N HCl (~ 5 damla) ile pH 8-8.5'e ayarlayın. Kehribar damla şişede 4 ° C'de saklayın; C (8). | ||
| Hoechst 33342 1000x Stok | Thermo Scientific | # 62249 | PBS'de (1000x) 1 mg / ml. Aliquot ve karanlıkta, 4 ° C'de saklayın; 1 yıla kadar veya -20 ° C'de; Uzun süreli depolama için C. Taze hazırlayın 1 ug / mL (1x) & nbsp'de; |
| İzopentan, %99 | PBS Elektron Mikroskobu Bilimlerinde GFS Kimyasalları | # 2961 | |
| Sıvı Azot | |||
| Paraformaldehit (PFA) | nbsp; | #15710 | %16 PFA stoğundan taze %4 PFA hazırlandı. Kalan %16 PFA'yı 4 ° C'de saklayın; Karanlıkta C. |
| Geçirgenleştirme çözümü | PBS +% 0.25 Triton-X (AMRESCO cat # 0694-1L) +% 0.05 NaN3. Taze hazırlayın. | ||
| Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) | Bioworld | #41620015-20 | 0,02 g/L KCl, 0,02 g/L KH2PO4, 0,8 g/L NaCl, 0,216 g/L Na2HPO4, pH 7,4. 10x stoktan hazırlanmıştır |
| Sükroz çözeltileri | Fisher Scientific | #S-5-500 | Uygun miktarda sakarozun 37& derece içinde çözün; C PBS (çözünmesi ~ 15 dakika sürer). 4 ° C'de birkaç gün saklanabilir. |
| Tissue-Tek OCT bileşik | Sakura | #4583 | |
| Antikorlar | Company< | strong>Katalog Numarası | Comments |
| anti-calbindin | Sigma-Aldrich | C8666 | Horinzotal hücreleri etiketlemek için |
| anti-GAD65 | Chemicon | AB5082 | GABAerjik amakrin hücreleri etiketlemek için |
| anti-GS | BD İletim | 610517 | Mü'u etiketlemek için; ller hücreleri |
| anti-rodopsin | Millipore | MAB5316 | Çubukları etiketlemek için |
Kaynaklar
- Coons, A. H. Labelled antigens and antibodies. Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).
- Coons, A. H. Fluorescent antibodies as histochemical tools. Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).
- Chatterjee, S. Artefacts in histopathology. Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).
- Hartz, P. H. Frozen sections from Bouin-fixed material in histopathology. Stain Technology. 20, 113(1945).
- Benerini Gatta, L., et al. Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic pathology. European Journal of Histochemistry. 56 (2), e12(2012).
- Tokuyasu, K. T. Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry. Journal of Microscopy. 143 (Pt 2), 139-149 (1986).
- Imai, H., et al. Molecular properties of rhodopsin and rod function. Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6677-6684 (2007).
- Lee, J. W., Lim, M. Y., Park, Y. S., Park, S. J., Kim, I. B. Reexamination of Dopaminergic Amacrine Cells in the Rabbit Retina: Confocal Analysis with Double- and Triple-labeling Immunohistochemistry. Experimental Neurobiology. 26 (6), 329-338 (2017).
- Bringmann, A., Grosche, A., Pannicke, T., Reichenbach, A. GABA and Glutamate Uptake and Metabolism in Retinal Glial (Muller) Cells. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 4, 48(2013).
- Nakhai, H., et al. Ptf1a is essential for the differentiation of GABAergic and glycinergic amacrine cells and horizontal cells in the mouse retina. Development. 134 (6), 1151-1160 (2007).
- Applebury, M. L., et al. The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
