Yöntem makalesi

Periferik mononükleer hücrelerden Indüklenen nöral kök hücrelerin üretimi ve transplantasyon çalışmaları için Dopaminergic neuron precursors doğru farklılaşma

DOI:

10.3791/59690

⸱

11 Temmuz 2019

 , 
1Cell Therapy Center, Beijing Institute of Geriatrics, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, and Key Laboratory of Neurodegeneration, Ministry of Education, 2Center of Neural Injury and Repair, Beijing Institute for Brain Disorders

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol, çevresel kan mononükleer hücrelerin yeniden programlanması ile sinirsel kök hücrelerini Sendai virüs enfeksiyonu, dopaminerjik nöronlar içine inscs farklılaşma, tek taraflı-lesioned içine da öncüleri transplantasyon teşvik sunar Parkinson hastalığı fare modelleri ve PD tedavisi için iNSC-türetilen DA öncüleri güvenlik ve etkinliğini değerlendirilmesi.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Parkinson hastalığı (PD), ventral mezensefalon (VM) içinde kanıtlanmış bir Nigra pars Compacta (snpc) dopaminerjik (da) nöronların dejenerasyonu nedeniyle oluşur. Hücre replasman tedavisi PD tedavisi için büyük söz tutar. son zamanlarda, indüklenen nöral kök hücreler (SCS) tümör oluşumu riski azalmış ve plastisite nedeniyle hücre değiştirme tedavisi için potansiyel bir aday olarak ortaya çıkmıştır bölgeye özgü nöronlar ve glia. ınscs, fibroblastlar, periferik kan mononükleer hücreler (PBMNCs) ve diğer çeşitli hücre türleri gibi otolog somatik hücresel kaynaklardan yeniden programlanabilmektedir. Diğer somatik hücreler ile karşılaştırıldığında, PBMNCs kültür erişim ve genişletme kolaylığı nedeniyle cazip bir başlangıç hücresi türüdür. , İnsan OCT3/4, SOX2, KLF4 ve c-myc dahil olmak üzere yeniden programlama faktörleri kodlama, bir RNA olmayan Integrative virüs Sendai virüs (sev), bir negatif duygusu vardır, tek-telli, olmayan segmentli genom içine entegre değildir Ana genom, ancak virüslü hücrelerin sitoplazmasında çoğaltır, yeniden programlama için verimli ve güvenli bir araç sunuyor. Bu çalışmada, PBMNCs 'yi yeniden programlama ve iki aşamalı bir yöntemle özel VM DA nöronlara ayırt edilen ınscs 'nin elde edildiği bir protokol açıklanmaktadır. Daha sonra DA öncüleri tek taraflı 6-hyrokydopamin (6-OHDA)-lesioned PD fare modellerini PD tedavisinde güvenlik ve etkinliğini değerlendirmek için nakledilir. Bu yöntem, hasta özel DA nöral hücrelerinin in vitro ve in vivo fonksiyonlarını ve terapötik etkilerini araştırmak için bir platform sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Parkinson hastalığı (PD) ortak bir nörodejeneratif hastalıktır, dopaminerjik dejenerasyon neden olur (da) nöronlar üzerinde kanıtlanmış Nigra pars Compacta (snpc) ventral mezensefalon (VM), üzerinde prevalansı ile% 1 daha fazla nüfusu 60 yaş üzerinde 1 , 2. son on yıl içinde, hücre terapisi, ya dejeneratif veya hasarlı hücrelerin değiştirilmesi ya da dejenere nöronlar etrafında mikroçevre BESLEYICI, PD3tedavisinde potansiyel göstermiştir. Bu arada, yeniden programlama teknolojisi önemli ilerleme yaptı4, hangi yedek terapi için umut verici bir hücresel kaynak sağlar. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreleri (ıpscs) ve embriyonik kök hücreler (ESCs) DA nöral hücrelere ayırt edebilmek için kanıtlanmıştır, hangi hayatta olabilir, olgunlandırmak, ve sıçan ve non-insan primat PD modelleri içine grepte motor fonksiyonları geliştirmek5 ,6,7,8. ıpscs, hücresel yeniden programlama teknolojilerinde bir kilometre taşı temsil eder ve hücre nakli konusunda büyük bir potansiyele sahiptir; Ancak, hala tamamen farklılaşmış hücrelerden tümör oluşumu riski hakkında bir endişe vardır. Hücre transplantasyonu için alternatif bir hücresel kaynak olan, kararsız ara kaynaklarından elde edilebilir olan indüklenen nöral kök hücreler (ınscs) gibi, doğrudan yeniden programlama yoluyla elde edilen kökten işlenen yetişkin kök hücrelerdir. aşama9,10,11.

Hem ipscs hem de ınscs, fibroblastlar, periferik kan mononükleer hücreler (pbmncs) ve diğer çeşitli hücre türleri12,13,14gibi otolog hücresel kaynaklardan yeniden programlanabilmektedir, böylece büyük bir dereceye kadar nakledilen hücrelerin immünogenisite. Dahası, IPhone 'lar ile karşılaştırıldığında, ınscs, tümör oluşumu ve sırtı işlenmiş plastisite riski azalmış, sadece nöronlar ve glia11farklılaştırmak mümkün. İlk çalışmalarda, invaziv bir prosedür olan cilt biyopsisinden elde edilen fibroblastlar arasında insan ya da fare ıpscs ve ınscs oluşturuldu14,15. Bu bağlamda, PBMNCs daha az invaziv örnekleme işlemi nedeniyle cazip bir başlangıç hücresi kaynağıdır ve genişleme süresi kısa bir süre içinde çok sayıda hücre elde etmek kolaylığı16. İlk yeniden programlama çalışmaları, lentiviral veya retroviral vektörler gibi İntegratif teslimat sistemlerini kullanan, birçok hücre türü içinde verimli ve kolay uygulanabilen17; Ancak bu teslimat sistemleri, klinik terapötik amaçlar için güvenlik sorunları mevcut olan kalan transgenler, mutasyonlar ve yeniden aktivasyonuna neden olabilir12. Sendai virüs (SeV) bir non-Integrative RNA virüsü bir negatif anlamda, ana genom içine entegre değildir tek telli genom, ancak virüslü hücrelerin sitoplazmasında çoğaltır, yeniden programlama için verimli ve güvenli bir araç sunan18 ,19. Rekombinant SeV vektörler, açık okuma çerçevelerinde insan OCT3/4, SOX2, KLF4 ve c-myc gibi yeniden programlama faktörleri içeren kullanılabilir. Buna ek olarak, SeV viral vektörler, sıcaklık duyarlı mutasyonlar sunarak daha da iyileştirilebilir, böylece kültür sıcaklığı 39 °C ' ye yükseltildiğinde hızla kaldırılabilirler.20. Bu yazıda, PBMNCs 'i SeV sistemini kullanarak yeniden programlamak için bir protokol açıklanmaktadır.

Birçok çalışmalar insan ESCS veya ipscs çeşitli yöntemler6,8,21kullanarak da nöronların türetme bildirdi. Bununla birlikte, ınscs 'deki DA nöronların farklılaşması ayrıntılarını açıklayan bir protokol sıkıntısı vardır. Bu protokolde, iki aşamalı bir yöntem kullanarak ınscs 'deki DA nöronların verimli oluşumunu açıklayacağız. DA nöronal öncüleri güvenlik ve etkinlik değerlendirmeleri için PD fare modellerinin striatum içine nakledilebilir. Bu makalede, Sendai virüsü tarafından indüklenen nöral kök hücrelerin nesil çeşitli aşamaları kapsayan ayrıntılı bir protokol sunacak, DA nöronlar içine ınscs farklılaşma, fare PD modellerinin kurulması, striatum içine DA öncüleri nakli için , PD modellerinin. Bu protokol kullanılarak, hastalar ve sağlıklı bağışçıların ınscs oluşturabilir ve hücre transplantasyonu amacıyla güvenli, standartlanabilir, ölçeklenebilir ve homojen olan DA nöronlar türetebilirsiniz veya PD 'yi bir tabak içinde modelleme ve mekanizmaların incelenmesi temel hastalık başlangıcı ve gelişimi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm prosedürler, kurumsal insan araştırma etiği komitesinin yönergelerine uymalıdır. Kan toplama işleminden önce hastalara veya sağlıklı gönüllülerden bilgilendirilmiş onay alınmalıdır. Bu protokol, kurumun insan araştırma etiği Komitesi tarafından onaylanmıştır ve kurumun hayvanların bakımı ve kullanımı kurallarına göre gerçekleştirildi.

1. PBMNCs toplama, yalıtım ve genişleme

  1. PBMNCs koleksiyonu
    1. Sodyum Heparin koruyucu şişe ile damara tarafından donör periferik venöz kan 10-20 ml toplayın.
      Not: kan örnekleri oda sıcaklığında (RT) depolanmalı veya sevk edilmelidir. Kan örneklerini 24 saat içinde işlem yapın.
  2. Kültür ortamının hazırlanması
    1. Aşağıdaki bileşenleri birleştirerek serum ücretsiz Orta (SFM) hazırlayın: 245 mL Iscove 'un modifiye Dulbecco 'nun Orta (ıMDM), 240 mL ham 's F-12, 5 mL insülin-transferrin-Selenium-X Supplement (onun-X), 5 mL 100x glutamin stok çözeltisi (tablo Malzemeler), 5 ml kimyasal olarak tanımlanmış lipid konsantre, 2,5 g fetal sığır serumu, 0,025 g askorbik asit ve 9 μL 1-thioglycerol. Ortamı filtreleyin ve 4 °C ' de saklayın.
      DIKKAT: askorbik asit ve 1-thioglycerol cilt teması ve inhalasyon ile zehirlidir.
    2. Mononükleer hücre (MNC) orta hazırlamak için, SFM ortamını 10 ng/mL insan interlöte 3 (IL-3), 2 U/mL eritropoietin (EPO), 100 ng/ml insan kök hücre faktörü (SCF), 40 ng/mL insan insülin benzeri büyüme faktörü 1 (ıGF-1), 100 μg/mL Holo-transferrin ve 1 ile tamamlayıcı μM Dexamethasone. Ortamı filtreleyin ve 4 °C ' de saklayın.
      Not: kullanmadan önce ortamı hemen hazırlayın.
  3. PBMNCs izolasyonu
    1. Ultraviyole-kullanmadan önce temiz bir tezgah sterilize. % 75 alkol ile tüm yüzeyleri ve ekipmanları sterilize edin. Bir otoklav kullanarak tüm ipuçlarını sterilize edin.
    2. Periferik kanı (PB) 50 mL konik tüpüne aktarın ve PB 'yi steril Dulbecco 'nun fosfat-tamponlu tuzlu (D-PBS) eşit hacmine sahip olarak seyreltin.
    3. Başka bir 50 ml konik tüpte 15 ml sterilize yoğunluk degrade ortamını (malzeme tabloları) hazırlayın.
      Not: PBMNCs daha iyi yalıtım sağlamak için RT at yoğunluk degrade orta ve PB tutun.
    4. Yoğunluk degrade ortamını içeren konik tüpü 45 ° açıyla eğim ve sonra yavaşça ve dikkatle yoğunluk degrade orta üzerine seyreltilmiş PB 30 mL yatıyordu.
      Not: dikkatli olun ve PB yavaşça yoğunluk degrade orta tabaka üzerine konik tüp tarafına aşağı çalıştırmak için izin verin. Kırmızı kan hücreleri tüpün altına yatırılacak. Katman arayüzünün bozulmasına en aza indirmek için tüpü dikkatlice eğin.
    5. Santrifüj fren "off" pozisyonunda ayarlanmış olan RT 'de 15 dakika için 800 x g 'de tüpler Santrifüjü. Sarı, üst plazma tabakasını aspirate ve atın. Daha sonra yeni 50 mL konik tüpüne 10 mL pipet ile MNCs içeren beyaz bulutlu ince film tabakasını aktarın.
      Not: anahtarlama Santrifüjü fren kapalı MNCs yalıtımı için önemlidir.
    6. 4 °C ' de 10 dak için 600 x g 'de, MNCs ile tüpüne 30 ml D-PBS ekleyin ve santrifüjün. Supernatant atın ve sonra hücre yeniden askıya almak için D-PBS 45 mL ekleyin. 400 x g 'de 4 °c ' de 10 dakika Santrifüjü.
      Not: santrifüj fren bu ve aşağıdaki santrifüjleme adımlar için açık olmalıdır. Hücre pelalları yoğun olduğu için, 1-2 mL D-PBS eklemek yavaşça yeniden Pellet askıya almak ve sonra D-PBS 45 mL ekleyin.
    7. Süpernatant atın ve 5 ml D-PBS ile hücreleri yeniden askıya almak ve tripan mavi dışlama yöntemi ile canlı hücreleri saymak.
    8. Genişleme için gerekli olan MNCs 'yi bir kenara bıraktıktan sonra, kalan hücreleri gelecekteki kullanım için dondurur.
      Not: en az 5 x 106 MNCs, 1 ml donma Orta (malzeme tablosu) ile bir şişede dondurulabilir. Protokol burada duraklatılmış olabilir.
  4. MNCs genişleme
    1. Günde-14, tohum MNCs 2-3 bir yoğunlukta x 106 hücreler mililitre başına bir iyi altı-kuyu plakaları Ile 1,5 ml önceden ısıtılmış (37 °C) MNC orta. 2 gün boyunca 37 °C,% 5 CO2 ' de Inküye.
    2. Gün-11, sterilize pipet ile hücreleri ve orta toplamak ve yeni bir 15 mL konik tüp transfer. Hücre santrifüjler 250 x g 'de 5 dakika için RT. süpernatant atın ve 1 ml ön ısıtılmış (37 °c) MNC orta hücreleri yeniden askıya.
    3. Tripan mavi ile uygun hücreleri saymak. Ön ısıtılmış MNC ortamında mililitre başına 1 x 106 hücreli bir yoğunlukta MNCs tohum ve 37 °c, 5% Co2 3 gün boyunca inküye.
      Not: toplam hücre sayısı gün-11 ' de düşebilir beklenir.
    4. 8. gün, 1.4.2-1.4.3 arasındaki adımları yineleyin ve hücreleri 3 gün boyunca kültüre edin.
    5. 4. gün, 1.4.2-1.4.3 arasındaki adımları yineleyin ve hücreleri 3 gün boyunca kültüre edin.
      Not: 14 gün sonra kültür, eşit veya daha fazla sayıda MNCs kültürü içinde kalması gerekir.

2. PBMNCs 'nin ınscs 'e yeniden programlanması, SeV enfeksiyonu

  1. Çözüm ve kültür ortamının hazırlanması
    1. Bir Poly-D-lizin (PDL) stok çözüm 100 mg PDL ile 100 mL H2O bir konsantrasyon 1 mg/ml ile çözünerek hazırlayın. 1 mL 'de-20 °C ' de saklayın.
    2. 100 mg/mL konsantrasyon için 0,01 N HCl 20 mL 'de insülin mg çözünerek bir insülin stok çözüm hazırlayın. 1 mL 'de-20 °C ' de saklayın.
    3. 200 ml INsc bazal orta hazırlamak için, birleştirmek 96 ml dmem-F12 ve 96 ml temel Orta (malzeme tablosu) ile 2 ml 100x glutamin stok çözüm, 2 ml gereksiz amino asit (neaa), 2 ml N2 takviyesi ve 2 ml B27 ek. Kullanımı 10 ng/mL rekombinant insan lösemi inhibitör faktörü, 3 μM CHIR99021 ve 2 μM SB431542 önce ekleyin. Ortamı filtreleyin ve 4 °C ' de saklayın.
      Not: 2 hafta içinde orta kullanın. Rekombinant insan lösemi inhibitör faktörü ekleyin, CHIR99021 ve SB431542 hemen önce kullanmadan.
  2. PBMNCs 'in iNSCs 'e yeniden programlanması, SeV enfeksiyonu
    1. Ultraviyole-kullanmadan önce temiz bir tezgah sterilize. % 75 alkol ile tüm yüzeyleri ve ekipmanları sterilize edin. Tüm ipuçları bir otoklav kullanarak sterilize.
    2. Gün 0, MNC orta hücreleri toplamak ve 15 mL konik tüp transfer. Hücre santrifüjler 200 x g 5 dk. aspirate süpernatant ve hücreleri yeniden askıya 1 ml önceden ısıtılmış MNC orta.
    3. Tripan mavi ile uygun hücreleri saymak. Ön ısıtılmış (37 °C) MNC orta ile hücreleri 24-kuyu plakaları başına 2 x 105 hücre konsantrasyonuna yeniden askıya alın.
    4. SeV tüplerini-80 °C ' den kaldırdıktan sonra, SeV içeren tüpleri 37 °C su banyosunda 5-10 s için çözün ve sonra RT 'de çözülmelerine izin verin. Bir kez çözülmüş, hemen buz üzerine yerleştirin.
    5. İnsan Klf4, Oct3/4, SOX2 ve c-myc kodlamasını, 10 ' luk ENFEKSIYONUN (MOI) bir çokluğu ile kuyulara ekleyin. Hücre ataşmanı kolaylaştırmak için 30 dakika 1.000 x g 'de plakalı santrifüjler. Hücreleri ve süpernatant plakaları bırakın. 37 ° c, 5% CO2' de kuluçte plakaları yerleştirin.
      DIKKAT: SeV ile ilgili tüm prosedürler bir emniyet kabininde yapılmalıdır ve tüm ipuçları ve tüpler elden çıkmadan önce etanol veya çamaşır suyu ile tedavi edilmelidir.
    6. 1. gün, orta ve hücreleri 15 mL santrifüj tüpüne aktarın. 1 mL MNC orta ile iyi durulayın. Hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 200 x g 'de santrifüjler, süpernatant aspirate ve 24-kuyu plakaları içinde 500 μL taze ön ısıtılmış MNC orta ile hücreleri yeniden askıya.
      Not: PDL/laminin üzerine kaplamadan önce herhangi bir hücrenin ataşmanı önlemek için düşük ek 24-kuyu plakası kullanın.
    7. 2. gün, 1 mL 1 mg/mL PDL, 19 mL D-PBS ile 50 μg/mL konsantrasyonunda seyreltilmeli. 50 μg/mL PDL 'ye sahip, RT 'de en az 2 saat kat 6-kuyu plakaları.
    8. Seyreltmeli 200 μL 0,5 mg/mL laminin, 20 mL D-PBS ile 5 μg/mL konsantrasyonuna kadar. 6-kuyu plakaları aspirate PDL ve dikey temiz tezgah üzerinde kuru.
    9. 5 μg/mL laminin bulunan 6-kuyu plakaları ve 37 °C ' de 4-6 h için inkük. Kullanmadan önce D-PBS ile yıkayın.
    10. 3. gün, adım 2.2.6 ' da PDL/laminin kaplı 6-kuyu plakaları üzerinde INsc Medium 'da elde edilen transkif hücreleri plakalı.
      Not: hücreler PDL/laminin kaplı plakalar üzerine yerleştirildikten sonra gerekirse plakaları yavaşça hareket ettirin, hücrelerin ataşmanı rahatsız etmemeler.
    11. 5. gün, 1 mL ön ısıtılmış (37 °C) iNSC orta her iyi 6-kuyu plakaları nazikçe ekleyin.
      Not: hücrelerin şiddetli ölüm (>% 60) geçmesi bekleniyor.
    12. 7. gün, 1 mL ön ısıtılmış (37 °C) iNSC orta her iyi 6-kuyu plakaları nazikçe ekleyin.
    13. 9. günden 28 ' e kadar, harcanan ortamı her gün taze ön ısıtılmış (37 °C) iNSC orta ile değiştirin. INsc kolonilerinin ortaya çıkmasını izleyin. Pick ve yaklaşık 2-3 hafta içinde genişleme için INsc klonlar transfer. Yakılan cam pipetleri kullanarak uygun morfolojiye sahip kolonileri alın, herhangi bir olasılıkla kontamine hücreleri hariç tutarak kolonileri 200 μL ipuçları ile aspirasyon yapın.
      Not: karakterize ınscs, bir şişede 2-5 koloni ile gelecekteki kullanım için dondurulabilir. Donma orta serum ücretsiz bazal orta içerir (malzeme tablosu) ve dimetil sülfoxid 9:1 bir oranda karışık, kullanmadan önce hemen hazırlanmalıdır. Protokol burada duraklatılmış olabilir.

3. ınscs 'nin dopaminerjik nöronlara farklılaşması

  1. Çözüm ve kültür ortamının hazırlanması
    1. Hazırlamak 200 mL INsc farklılaşma bazal orta ile birleştirerek 192 mL DMEM-F12 ile 2 mL 100x glutamin stok çözüm, 2 ml NEAA, 2 ml N2 takviyesi ve 2 mL B27 ek.
      Not: 2 hafta içinde orta kullanın.
    2. INsc farklılaşma aşaması ı orta, 1 μM SAG1 ve 100 ng/mL FGF8b ile iNSC farklılaşma bazal ortamını tamamlayıcı olarak hazırlayın.
      Not: 2 hafta içinde orta kullanın.
    3. 0,5 mM döngüsel Adenozin monofosfat (cAMP), 0,2 mM askorbik asit, 10 μM DAPT, 10 ng/mL beyin türetilen nörotrofik faktör (BDNF), 10 ng/mL glial türevi ile INsc farklılaşma bazal orta kullanarak INsc farklılaşma aşaması II orta hazırlayın nötrofik faktör (GDNF) ve 1 ng/mL dönüşüm büyüme faktörü Βııı (TGF-Βııı).
      Not: 2 hafta içinde orta kullanın.
  2. Kültür yemekleri kaplama
    1. Ultraviyole-kullanmadan önce temiz bir tezgah sterilize. % 75 alkol ile tüm yüzeyleri ve ekipmanları sterilize edin. Tüm ipuçları bir otoklav kullanarak sterilize.
    2. PDL kaplama için, hücreleri yeniden kaplamadan en az bir gün önce, 50 μg/mL konsantrasyonuna kadar 19 mL D-PBS ile 1 mg/mL PDL 1 mL seyreltir. En az 2 saat için RT 'de 50 μg/mL PDL ile 24 kuyu plakalarına% 75 alkol ile sterilize edilmiş olan 12 mm 'lik cam coverlar.
    3. Laminin kaplama için 200 μL 0,5 mg/mL laminin, 20 mL D-PBS ile 5 μg/mL konsantrasyonuna kadar seyreltilmeli. PDL aspirate ve temiz bankta kuyuları kuru. 12 mm 'lik kapağı 5 μg/mL laminin ile kat ve 37 °C ' de 4-6 h için inküye yapın. Kullanmadan önce D-PBS ile yıkayın.
  3. Farklılaşma için geçiş hücreleri.
    1. Kültürlü ınscs 'nin konfluence% 70-90 ulaştığında, kültür plakasının orta Aspire ve hücreleri yıkamak için D-PBS 1 ml ekleyin. İyi başına 1 mL ön ısıtılmış (37 °C) hücre dağılma reakajının (malzeme tablosu) ekleyin ve hücreleri ayırmak Için 37 °c ' de 3 dakika boyunca inküye yapın.
    2. 3 dakika boyunca kuluçken sonra, hücreler yarı yüzen haline gelmiştir; 3 mL önceden ısıtılmış ekleyin (37 °C) DMEM-F12 orta başına, ve pipet hücreleri yukarı ve aşağı tek hücrelere hücre granül ayırmak için.
    3. Hücreleri 15 mL konik boruya aktarın ve 3 dakika boyunca 250 x g 'de santrifüjler, supernatant aspirate, hücre sayısına göre ön ısıtılmış (37 °C) insc orta uygun hacim ile hücreleri yeniden askıya.
    4. Tripan mavi dışlama yöntemini kullanarak hücreleri saymak. 24-kuyu plakasında 12 mm cam lamel magazini başına 5 x 103 hücreli plaka ve 37 °c, 5% Co2' de inküyeler.
  4. İNSCs 'nin dopaminerjik nöronlara farklılaştırın.
    1. Hücreleri PDL/laminin kaplı kapaklara yeniden kaplamandan sonra 24 saat farklılaşma başlar. , D-PBS ile bir kez aspirate kültür orta, ve daha sonra 600 μL önceden ısıtılmış farklılaşma aşaması ı orta her iyi 24-kuyu plakaları ve 37 °C, 5% CO2içinde inküyasyon ekleyin.
    2. Farklılaşma ilk aşamasında 1 gün 10 günden itibaren her gün Orta değiştirin.
    3. 10. gün, kültür ortamını Aspire ve hücreleri bir kez D-PBS ile yıkayın. 24-kuyu plakalarının yanı sıra ön ısıtılmış (37 °C) farklılaşma aşaması II orta 600 μL ekleyin ve 37 °C,% 5 CO2' de inkübasyon yapın.
    4. Farklılaşma ikinci aşamasında 11 günden gün 25 her gün Orta değiştirin. Farklılaşan hücreler analiz için farklı zaman noktalarında civarında formaldehite ile düzeltilebilir.
    5. İmmünofluorescent boyama için, D-PBS ile hücreleri, 11 ile 25 arasında farklılaşma gününde seçilen zaman noktalarında hafifçe üç kez yıkayın.
    6. Pipet 300 PBS 'de% 0,3 noniyonik yüzey parçası yapmak için 100 mL PBS içine noniyonik yüzey (malzeme tablosu) μL.
      DIKKAT: Noniyonik yüzey cilt teması ve inhalasyon ile zehirlidir.
    7. RT 'de 10 dakika boyunca% 4 civarında formaldehite ile hücreleri düzeltin. Sonra PBS 'de% 0,3 ile üç kez yıkayın.
      DIKKAT: Paraformaldehyde cilt teması ve inhalasyon ile zehirlidir.
    8. RT 2 saat için% 3 eşek serumu ile hücreleri engelleyin.
    9. Uygun bir konsantrasyonda% 1 eşek serumda primer antikor seyreltir ve karıştırın hafifçe triturate. 24 kuyu plakasının her bir kuyusu için primer antikor çözeltisi 300 μL ekleyin. Hücreleri 4 °C ' de bir gecede kulküat. Hücreleri üç kez PBS% 0,3 noniyonik yüzey ile yıkayın.
    10. Uygun bir konsantrasyonda% 1 eşek serumda ikincil antikor seyreltir ve karıştırın hafifçe triturate. 24 kuyu plakasının her bir kuyusu için ikincil antikor çözeltisi 300 μL ekleyin. 2 saat boyunca RT 'deki hücreleri ışıktan korunur.
    11. Hücreleri üç kez PBS% 0,3 noniyonik yüzey ile yıkayın. Seyreltmeli 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ile PBS 1:500 seyreltme. 24-kuyu plakasının her bir kuyunda bulunan hücreleri, ışıktan korunan RT 'de 15 dakika boyunca seyreltilmiş DAPı 300 μL ile kulbe etme. Hücreleri üç kez PBS% 0,3 noniyonik yüzey ile yıkayın.
    12. Hafifçe forseps ile plakaların kuyuların kapak dışarı çıkarın. Karanlık bir gecede RT. floresans mikroskop altında monte edin.

4. tek taraflı 6-hyroxydopamin (6-OHDA) kurulması-lesioned PD fare modelleri

  1. Hücre nakli için PD fare modelleri oluşturmak için, 6-OHDA enjeksiyon için 20-25 g tartım yetişkin erkek SCıD-bej fareler kullanın.
  2. Cerrahi ilaçlar hazırlanması
    1. 0,2%% askorbik asit çözeltisi 0,2 g askorbik asit, 100 mL sterilize edilmiş salin içine (% 0,9) çözülerek hazırlayın -80 °C ' ye kadar saklayın. Cerrahi gününde% 0,2 askorbik asit çözeltisi% 0,02 askorbik asit çözeltisi elde etmek için 10 kez seyreltilir.
      Not: 6-OHDA oksidasyonu önlemek için askorbik asit eklenir.
    2. 6-OHDA çözeltisi hazırlamak için, sterilize edilmiş 1 mL tüpüne uygun 6-OHDA miktarını tartın ve sonra 5 μg/μL 6-OHDA çözeltisi yapmak için% 0,02 askorbik asit hacmi ekleyin. Karışımı çözülene kadar Vortex. Kullanım kadar buz üzerinde 6-OHDA yerleştirin.
      Not: 6-OHDA sıcaklık ve hafif duyarlıdır. Çözümü ışığa karşı korumak ve kullanmadan önce buzda tutmak için dikkatli olun.
  3. Cerrahi önce otoklavlama tarafından sterilize cerrahi ekipman hazırlayın. Stereotaktik çerçeveyi kurarken tüm ekipman ve yüzey alanlarını etanol ile temizleyin. Bir Isıtma lambası altında bir fare kurtarma kafesi ayarlayın.
  4. Tek taraflı 6-OHDA-lesioned fare modelleri kurmak için ameliyat yapın.
    1. Her fareyi tartın, ağırlığı kaydedin ve uygulanması gereken ilacın miktarını hesaplayın. Her fare 0,5 mg/kg atropin operasyonlardan önce 20 dakika alır. 80 mg/kg ketamin ve 10 mg/kg xylazine ile fare anestezize.
    2. Yönet 0,5 intraperitoneal enjeksiyon ile mg/kg atropin.
    3. 80 mg/kg ketamin ve 10 mg/kg xylazine ile intraperitoneal enjeksiyon ile fare anestezinin 20 dakika atropin uygulamadan sonra.
    4. Fareyi kapalı bir odaya koyun. 3-5 dk sonra, fare derin arka bacak tutam yanıt vermeden anestezize olacaktır.
      Not: anestezi alınan fare bir uyarma dönemi yaşayacağını bekleniyor.
    5. Fare kafasını tıraş ve kornea ülserleri geliştirilmesi koruma için fare gözünde eritromisin göz merhem uygulayın.
    6. Fareyi stereotaktik aparatın üzerine yerleştirin. Öncelikle kesici çubukları ile fareyi düzeltin. Fare kafasını düz ve güvenli bir konumda yapmak için kulak bardakları doğru şekilde takın.
    7. Fare kafasını Povidon İyot ve izopropresl alkolle sterilize edin. Bir neşter bıçağı ile baş deride bir sagittal kesi (~ 1,5 cm) kes ve kafatası açığa. 0,1 mm 'den az olan kemiğinin ve lambda arasındaki yükseklik farkını azaltmak için kesici çubuk ve kulak çubuklarını ayarlayın.
      Not: fare kemiğinin koronal ve sagittal sütürler kesişiminde yer alır ve lambda lambdoid ve sagittal sütürler kesişiminde.
    8. Yavaşça iğne ucunu kemiğinin 'ya doğru hareket ettirin ve düşürmek ve kemiğinin 'yı sıfır nokta olarak tedavi edin. Ucu A/P + 0,5 mm, M/L-2,1 mm koordinatlarıyla bregma 'ya göre bir pozisyona taşıyın. Ucu geri çekin ve noktayı işaretleyin. Kafatasına küçük bir delik açsana.
    9. Microşırınga (malzeme tablosu) Içine 2 μL 5 μg/μL 6-OHDA çözeltisi ayıklayın. İğneyi işaretlenmiş noktaya geri dönün ve iğneyi D/V-3,2 mm 'ye yerleştirin.
    10. 1 μL/dak hızında 2 μL 5 μg/μL 6-OHDA çözeltisi (10 μg toplam) enjekte edilir. 6-OHDA enjeksiyon tamamlandıktan sonra, başka bir 5 dakika için yerine iğne bırakın. Sonra enjeksiyon iğnesini yavaşça geri çekin.
    11. Sütürler ile kesi kapatın ve fare gözünde eritromisin göz merhem uygulayın. Su kaybı önlemek için subkutan 0,5 mL tuz sunun ve doğrudan süküle deri üzerinde bir antibiyotik merhem uygulayın.
    12. Stereotaktik cihazdan fareyi çıkarın ve kurtarma kafesi koymak. Fare geri koyun ve bilinç kavuşur kadar yiyecek ve suya erişim sağlar. 2-3 gün boyunca içme suyu günlük sonrası cerrahi analjezik ile fare Treat ve Ibuprofen önerilen doz 0,03 mg/gün başına vücut ağırlığı g.
    13. Fare günlük cerrahi sonrası inceleyin.

5. tek taraflı 6-OHDA 'dan sonra davranışsal değerlendirme

  1. Ameliyattan iki-üç hafta sonra, PD semptomlarını tahmin etmek için davranış değerlendirmesi yapın. Her fareyi tartmak, onların ağırlık kayıt ve uygulanmalıdır ilaç miktarını hesaplamak (0,5 mg/kg apomorfik önce değerlendirme).
  2. Yönetmek 0,5 mg/kg apomorfik subkutan enjeksiyon tarafından değerlendirme önce ve bir cam silindir fare yerleştirin.
  3. 5 dakika alışkanlık döneminden sonra, dakika başına lezyon tarafına göre kontralateral ve ipsilateral rotasyonların sayısını saymak ve bir video kamera ile etkinliğini kaydetmek.
  4. Kontralateral eksi ipsilateral rotasyonlar ile fareler > 7 RPM/dak başarılı bir şekilde lezyon olarak kabul edilir ve hücre nakli deneyleri için aday olarak seçilmiştir. 30 dakika dinlendikten sonra fareler gövde kafeslerine dönün.
    Not: fare başarıyla lesioned olsaydı, 6-OHDA enjekte fare da agonist ağırlıklı olarak lezioned yan aşırı hassas denervated striatum aktive beri kontralateral tarafına doğru dönüm daha büyük bir önyargı gösterecektir.
  5. Bir hafta önce davranış değerlendirmesini yapın ve 2, 4, 6, 8, 12, 16 hafta sonra hücre nakli yapın.

6. DA öncülerin hücre nakli

  1. Hücre süspansiyonunu transplantasyon için hazırlayın. Hücre engraftment için, 2 x 105 da öncüleri D10 ve D13 da öncüleri tarafından 1:7 oranı 4 μL 5 g l-1 glikoz dengeli tuz çözeltisi (malzeme tablosu) Transplantasyon tampon içinde karışık askıya.
  2. 6-OHDA da habercisi hücre süspansiyon veya tampon ile değiştirilir dışında, 4,4 bölümünde açıklanan prosedürleri takiben hücre transplantasyon cerrahisi gerçekleştirin.
  3. Bölüm 5 ' te açıklanan prosedürleri takiben DA öncülerin hücre nakli sonrasında 2, 4, 6, 8, 12, 16 hafta davranışsal değerlendirme gerçekleştirin. Dakika başına lezyon tarafına göre apomorf kaynaklı kontralateral rotasyonların sayısını saymak ve bir video kamera ile etkinliğini kaydetmek.
    Not: transplantasyondan sonra, düşük bir kontralateral rotasyon oranı geliştirilmiş bir motor fonksiyonunu göstermektedir.
  4. 4, 8, 12 ve 16 hafta sonra hücre nakli, derin anestezi altında fareyi serpmek 4% paraformaldehit fare vücudu sert hale gelene kadar ve fare karaciğeri soluk olur.
  5. Fare beyni nazikçe ayırın ve 4 °c gece içinde 4% civarında formaldehite beyin koydu.
  6. İkinci gün, beyin altına batana kadar,% 30 ' lık sukroz ile beynimi kırabilir.
  7. 40 μm kalınlıkta beyinlerinizi donma mikrotome kullanarak dilimleyin.
  8. 3.4.5-3.4.12 adımlarında daha önce açıklandığı gibi immünostat gerçekleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, PD modellerini tedavi etmek için INsc-DA hücre tedavisinin farklı aşamalarını kapsayan bir protokol bildiriyoruz. Öncelikle, PBMNCs yalıtılmış ve genişletilmiş ve SeV enfeksiyonu tarafından ınscs içine yeniden programlanmıştır. Şekil 1' de PBMNC genişleme ve insc indüksiyon prosedürlerinin şematik bir gösterimi gösterilir. -14 gün, PBMNCs yoğunluğu degrade Orta (malzeme tablosu) kullanılarak izole edildi. Santrifüjden önce, PBS ile seyreltilmiş kan ve yoğunluk gradya...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada PD modelleri için INsc-DA hücre tedavisinin farklı aşamaları kapsanan bir protokol sundu. Bu protokolün kritik yönleri şunlardır: (1) pbmncs izolasyonu ve genişlemesi ve pbmncs 'nin ınscs 'ye yeniden programlanması, (2) ınscs 'nin da nöronlara farklılaşması, (3) tek taraflı 6-OHDA-lesioned PD fare modellerinin kurulması ve davranışsal ve (4) DA öncüleri ve davranışsal değerlendirmesinin hücre nakli.

Bu protokolde ilk bölüm, eritroblastları tercih eden ve lenfosit proliferasyonu destekle...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışma aşağıdaki hibe tarafından desteklenmektedir: kök hücre ve çeviri ulusal anahtar projesi (2016YFA0101403), Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (81661130160, 81422014, 81561138004), Pekin Belediye doğal Bilim Vakfı (5142005), Pekin yetenekleri Vakfı (2017000021223TD03), destek projesi yüksek düzey öğretmenler Pekin Belediye üniversitelerinde 13 beş yıl dönemi planı (CıT & TCD20180333), Pekin tıbbi sistem yüksek seviyeli Yetenek Ödülü (2015-3-063), Pekin Belediye Sağlık Komisyonu Fonu (PXM 2018_026283_000002), Pekin 100, Thousand, ve 10000 yetenekler Fonu (2018A03), Pekin Belediye Hastanesi özel finansman desteğinin klinik tıp gelişimi (ZYLX201706) ve Royal Society-Newton gelişmiş Bursu (NA150482).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
15 ml konik tüpCorning430052
1-TiogliserolSigma-AldrichM6145Soluma ve cilt teması için toksik
24 oyuklu plakaCorning3337
50 ml konik tüp Corning430828
6-OHDASigma-AldrichH4381
6 oyuklu plakaCorning3516
AccutaseInvitrogenA11105-01Hücre ayrışma reaktifi
ApomorfinSigma-AldrichA4393
Askorbik asitSigma-AldrichA92902Cilt teması ile toksik 
B27 takviyesi Invitrogen17504044
BDNFPeprotech450-02Beyin kaynaklı nörotrofik faktör
Sodyum heparin içeren kan alma tüpleriBD367871
BSAyisheng36106es60Fetal sığır serumu
cAMPSigma-AldrichD0627Dibutiriladenozin siklik monofosfat
CellBanker 2ZENOAQ100mlPBMNC'ler için dondurma ortamı olarak kullanılır
Kimyasal olarak tanımlanmış lipid konsantresiInvitrogen11905031
CHIR99021Gen Operasyonu04-0004
LamelFisher25*25-2
DAPISigma-AldrichD8417-10mg
DAPTSigma-AldrichD5942
DeksametazonSigma-AldrichD2915-100MG
DMEM-F12Gibco11330
DMEM-F12Gibco11320
Eşek serumuJackson017-000-121
EPOPeprotech100-64-50UGİnsan Eritropoietin
FGF8bPeprotech100-25
Ficoll-Paque PremiumGE Healthcare17-5442-02P=1.077, yoğunluk gradyan orta
GDNFPeprotech450-10Glial kaynaklı nörotrofik faktör
GlutaMAXInvitrogen21051024100 ve kez; Glutamin stok çözeltisi
Ham's-F12Gibco11765-054
HBSSInvitrogen14175079Dengeli tuz çözeltisi
İnsan lösemi inhibitör faktörüMillporeLIF1010
İnsan rekombinant SCFPeprotech300-07-100UG
IGF-1Peprotech100-11-100UGİnsan insülin benzeri büyüme faktör 
IL-3Peprotech200-03-10UGİnsan interlökin 3
IMDMGibco215056-023Iscove'un modifiye edilmiş Dulbecco'nun orta
İnsülin Roche 
ITS-XInvitrogen51500-056İnsülin-transferrin-selenyum-X takviyesi
Nakavt serum replasmanıGibco10828028Serum içermeyen bazal ortam
LamininRoche 
MikroşırıngaHamilton7653-01
N2 takviyesi Invitrogen17502048
NEAAInvitrogen11140050Esansiyel olmayan amino asit
NeurobazalGibco10888Temel orta
PDLSigma-AldrichP7280Poli-D-lizin
SAG1EnzoALX-270-426-M01
SB431542Gen Çalışması04-0010-10mg-20'de ışıktan saklayın?
Sendai virüsüYaşam TeknolojileriMAN0009378
Sucrosebaiaoshengke
TGFβ?Peprotech100-36EDönüştürücü büyüme faktörü  β?
TransferrinAr-Ge D Sistemleri2914-HT-100G
Triton X 100baiaoshengkeNoniyonik yüzey aktif madde
Tripan mavisiGibcoT10282
KsilazinSigma-AldrichX1126
1258501411243217001

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Williams-Gray, C. H., et al. The distinct cognitive syndromes of Parkinson's disease: 5 year follow-up of the CamPaIGN cohort. Brain. 132, Pt 11 2958-2969 (2009).
  2. Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radical Biology and Medicine. 62, 132-144 (2013).
  3. Chen, Z. Cell Therapy for Parkinson's Disease: New Hope from Reprogramming Technologies. Aging and Disease. 6 (6), 499-503 (2015).
  4. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  5. Doi, D., et al. Isolation of human induced pluripotent stem cell-derived dopaminergic progenitors by cell sorting for successful transplantation. Stem Cell Reports. 2 (3), 337-350 (2014).
  6. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
  7. Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12543-12548 (2004).
  8. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  9. Ma, T., Xie, M., Laurent, T., Ding, S. Progress in the reprogramming of somatic cells. Circulation Research. 112 (3), 562-574 (2013).
  10. Tang, X., et al. Conversion of adult human peripheral blood mononuclear cells into induced neural stem cell by using episomal vectors. Stem Cell Research. 16 (2), 236-242 (2016).
  11. Yuan, Y., et al. Dopaminergic precursors differentiated from human blood-derived induced neural stem cells improve symptoms of a mouse Parkinson's disease model. Theranostics. 8 (17), 4679-4694 (2018).
  12. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  13. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  14. Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
  15. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).
  16. Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nature Protocols. 7 (4), 718-728 (2012).
  17. Bazley, F. A., et al. Direct Reprogramming of Human Primordial Germ Cells into Induced Pluripotent Stem Cells: Efficient Generation of Genetically Engineered Germ Cells. Stem Cells and Development. 24 (22), 2634-2648 (2015).
  18. Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. Journal of Virology. 74 (14), 6564-6569 (2000).
  19. Sochacki, J., Devalle, S., Reis, M., Mattos, P., Rehen, S. Generation of urine iPS cell lines from patients with Attention Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD) using a non-integrative method. Stem Cell Research. 17 (1), 102-106 (2016).
  20. Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14234-14239 (2011).
  21. Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (9), 3392-3397 (2008).
  22. Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. -K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nature Protocols. 7 (11), 2013-2021 (2012).
  23. Zhu, S., et al. Reprogramming of human primary somatic cells by OCT4 and chemical compounds. Cell Stem Cell. 7 (6), 651-655 (2010).
  24. Ono, Y., et al. Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells. Development. 134 (17), 3213-3225 (2007).
  25. Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1 (6), 703-714 (2012).
  26. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  27. Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (4), 336-347 (2010).
  28. Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. Transgenic rodent models of Parkinson's disease. Acta Neurochirurgica Supplements. 101, 89-92 (2008).
  29. Sheng, C., et al. Generation of dopaminergic neurons directly from mouse fibroblasts and fibroblast-derived neural progenitors. Cell Research. 22 (4), 769-772 (2012).
  30. Prasad, A., et al. A review of induced pluripotent stem cell, direct conversion by trans-differentiation, direct reprogramming and oligodendrocyte differentiation. Regenerative Medicine. 11 (2), 181-191 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Periferik Kan Monon kleer H creleriDopaminerjik N ron DiferansiyasyonuSendai Vir s Yeniden Programlama6 Hidroksidopamin Lezyon ModeliH cre Transplantasyon ProtokolTirozin Hidroksilaz Mark rFOXA2 EkspresyonuN ral K k H cre EkspansiyonuParkinson Hastal Tedavisi

İlgili makaleler